破骨細(xì)胞中NFATc1相關(guān)調(diào)節(jié)研究進(jìn)展

李忠浩 丁寧 楊全增 閆亮 夏亞一*

1.蘭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨科，甘肅 蘭州 730000 2.甘肅省骨科重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000

骨質(zhì)疏松癥正成為影響老年人健康的老年疾病之一，主要原因是骨吸收大于骨形成。人體骨骼受到成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞(osteoclast，OC)的動(dòng)態(tài)平衡調(diào)節(jié)；OC通過重構(gòu)自身細(xì)胞骨架形成一個(gè)吸收陷窩，并分泌氫離子及蛋白酶來降解骨礦物質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)，一旦這個(gè)過程過表達(dá)就將發(fā)生骨組織疾病，而人體內(nèi)存在著復(fù)雜的信號通路來調(diào)節(jié)OC發(fā)揮功能，其中NFATc1發(fā)揮著重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用[1-2]，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NFATc1基因敲除的小鼠無法生成成熟OC并進(jìn)行骨溶解，而NFATc1的異位表達(dá)則有效地使破骨細(xì)胞前體細(xì)胞(osteoclast precursor cell，OPC)在沒有RANKL刺激的情況下仍可以分化為OC[3]。這說明NFATc1是介導(dǎo)OC生長中的重要開關(guān)，本文將對其相關(guān)調(diào)節(jié)研究做一綜述。

NFATc1是NFAT家族中重要的一員，人類和小鼠的NFATc1為全長約150 kb的轉(zhuǎn)錄DNA[4]。NFATc1是OC分化過程中的重要轉(zhuǎn)錄因子，其N-末端結(jié)構(gòu)域結(jié)合鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(Calcineurin，CaN)去磷酸化而介導(dǎo)NFAT核轉(zhuǎn)位，C-末端與DNA序列特異結(jié)合并和激活子蛋白1(AP-1)共同發(fā)揮作用；C-末端包含一個(gè)20kDa大小的殘基416-591(NFATc1-DBD)也可以特異結(jié)合DNA，但其結(jié)合DNA能力相對較弱[3]。激活后，NFATc1即從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞核并轉(zhuǎn)錄出OC特異性基因如TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase，抗酒石酸堿性磷酸酶)，CTSK(cathepsin K，組織蛋白酶K)和MMP-9(matrix metallopeptidase 9，基質(zhì)金屬蛋白酶-9)[5]。綜上可知，NFATc1在調(diào)節(jié)OC方面發(fā)揮著不可替代的作用，其在體內(nèi)的調(diào)節(jié)過程簡介如下。

圖1 NFATc1調(diào)控信號通路簡圖Fig.1 Schematic diagram of NFATc1 regulation signaling pathway

1 破骨細(xì)胞中NFATc1的上游信號通路

這一過程分為啟動(dòng)、擴(kuò)增及靶向作用三個(gè)階段[6]，其中啟動(dòng)及擴(kuò)增階段主要依賴NFATc1上游包括由RANK(Receptor Activator for Nuclear Factor-κ B，核因子κ B受體活化因子)-RANKL(Receptor Activator for Nuclear Factor-κ B Ligand，核因子κ B受體活化因子配體)及協(xié)同刺激信號通路(costimnlatory signal)介導(dǎo)的一連串以NFATc1為靶點(diǎn)的信號通。見圖1。

RANK-RANKL信號通路相關(guān)研究開展最早，RANK與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TRAF6)結(jié)合后接受來自RANKL的信號，介導(dǎo)下游信號分子如核轉(zhuǎn)錄因子kappaB(NF-κB)，c-Jun和p38/c-fos表達(dá)，并激活其下游NFATc1轉(zhuǎn)錄過程。NFATc2與NF-κB結(jié)合后誘導(dǎo)初始NFATc1的激活[3]；c-Jun/NFAT信號軸對RANKL調(diào)節(jié)OC分化也發(fā)揮重要作用：Ikeda等[7]發(fā)現(xiàn)c-Jun阻斷能抑制NFAT介導(dǎo)的骨溶解，而在c-Jun抑制小鼠中，即使阻斷RANKL，NFAT的過表達(dá)仍可以介導(dǎo)OPC分化為TRAP(+)多核細(xì)胞破骨細(xì)胞樣細(xì)胞，因而證明其上下游調(diào)節(jié)關(guān)系；Huang等[8]在p38抑制細(xì)胞中，過表達(dá)的c-fos仍可以介導(dǎo)出大量NFATc1，表明p38/c-fos在NFATc1激活中也是一條重要信號通道。

現(xiàn)有研究表明NFATc1持續(xù)轉(zhuǎn)錄主要由Ca2+和CaN通路維持。RANKL在OPC中激活PLCγ2(Phospholipase C Gamma 2，人磷脂酰肌醇特異性磷脂酶Cγ2)從而水解肌醇磷脂酰肌醇-4,5 -二磷酸生成肌醇-1,4,5 -三磷酸肌醇(InsP3)和甘油二酯(DAG)，InsP3誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放Ca2+，細(xì)胞內(nèi)驟升的Ca2+使鈣調(diào)蛋白(Calmodulin)轉(zhuǎn)換為活化形態(tài)，從而誘導(dǎo)CaN磷酸化及激活CaMKs9(calcium/calmodulin-dependent protein kinases，鈣依賴性蛋白激酶)，最終使CaN去磷酸化NFATc1絲氨酸殘基而發(fā)生核轉(zhuǎn)位和NFATc1蛋白的激活[9]。但是RANK受體并不直接啟動(dòng)Ca2+信號，研究發(fā)現(xiàn)它作為免疫受體與其他受體共同作用，如人破骨細(xì)胞相關(guān)免疫球蛋白樣受體(OSCAR)/PIR-A(paired immunoglobulin-like receptor，配對免疫球蛋白樣受體)或TERM-2(triggering receptor expressed in myeloid cells，骨髓樣細(xì)胞觸發(fā)受體)/SIRPβ1(signal-regulatory proteinβ1，信號調(diào)節(jié)蛋白β1)受體復(fù)合體。在OPC中可以觀察到ITAM(Immunoregulatory tyrosine activation motif，免疫調(diào)節(jié)酪氨酸活化基序)磷酸化后與PLCγ2及Syk結(jié)合導(dǎo)致其激活，其中，OSCAR/PIR-A與Fc受體共同γ亞單位(FcRγ)結(jié)合而TREM-2/SIRPβ1則與DNAX激活蛋白12(DAP12)結(jié)合從而促進(jìn)Ca2+信號通路傳導(dǎo)。DAP12缺失的小鼠骨折愈合更快，而FcRγ與DAP12雙基因敲除小鼠(DAP12-/-FcRγ-/-)則由于OC分化缺陷出現(xiàn)骨過度硬化[10-11]。這些研究表明Ca2+信號通路對NFATc1的重要誘導(dǎo)作用。Takayanagi等[9]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在沒有RANKL刺激的情況下，對ITAM受體的刺激并不能激活Ca2+通道，因此ITAM相關(guān)受體只是協(xié)同增大RANK對NFATc1的刺激。最近的一項(xiàng)研究報(bào)道，部分激活GSK-3β異位表達(dá)突變體(GSK3β- s9A)可抑制RANKL介導(dǎo)的NFATc1表達(dá)和Ca2+振蕩。此外，還發(fā)現(xiàn)在OPC中表達(dá)GSK3β- s9A變體的小鼠存在NFATc1核轉(zhuǎn)位障礙[12]，說明糖原合成酶激酶-3β(GSK3β)通過Ca2+信號通路對NFATc1的表達(dá)起抑制作用。

在NFATc1啟動(dòng)完成后，則進(jìn)入擴(kuò)增階段以保持其持續(xù)高表達(dá)從而維持轉(zhuǎn)錄過程，這一過程受到NF-κB及Ca2+介導(dǎo)的NFATc1擴(kuò)增信號通路調(diào)節(jié)。一方面，Takayanagi等[3]發(fā)現(xiàn)在OPC中啟動(dòng)RANKL信號1h后，NF-κB中的p50及p65與NFATc2結(jié)合誘導(dǎo)NFATc1表達(dá)，即引起短暫的NFATc1表達(dá)擴(kuò)增(autoamplification)。因?yàn)镺C特異基因TRAP中存在高度保守的AP-1/NFAT結(jié)合元件，且其與IL-2啟動(dòng)子中的協(xié)同AP-1/NFAT結(jié)合位點(diǎn)相似，故假設(shè)OC中NFAT發(fā)揮功能需要c-fos/AP-1。最終印證在OC分化過程中NFATc1確是c-fos/AP-1的主要標(biāo)靶基因，在c-fos缺失細(xì)胞中，NF-κB明顯升高[13-14]，這支持NFATc1和NF-κB在RANK通路中是c-fos的下游信號并表明c-fos/AP-1，NF-κB及NFATc2在NFATc1擴(kuò)增中十分重要。另一方面，Ca2+介導(dǎo)激活NFATc1觸發(fā)擴(kuò)增回路并維持NFATc1依賴性轉(zhuǎn)錄過程持續(xù)進(jìn)行[3,10]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在分化階段晚期添加鈣神經(jīng)素抑制劑KF506將抑制OC生成，這證明Ca2+信號能介導(dǎo)NFATc1激活也能觸發(fā)NFATc1擴(kuò)增。持續(xù)性的鈣振蕩誘導(dǎo)NFATc1通過自我誘導(dǎo)擴(kuò)增而產(chǎn)生自我放大效應(yīng)。G蛋白信號調(diào)節(jié)因子10(RGS10)通過競爭性結(jié)合Ca2+/鈣調(diào)蛋白及三磷酸肌醇(PIP3)可控制PLCγ2并抑制鈣振蕩模式[15]。NFATc1擴(kuò)增的Ca2+調(diào)節(jié)通路有鈣振蕩依賴通路及鈣振蕩非依賴通路，RANK受體啟動(dòng)子中高度保守的結(jié)構(gòu)域啟動(dòng)RANK信號通路激活并繼續(xù)介導(dǎo)ITAM而引起PLCγ2的激活。Kuroda等[16]之后又發(fā)現(xiàn)存在一條不需要RANKL/巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)介導(dǎo)的鈣振蕩非依賴通路，隨之有人證明在此通路中，Cot激酶(cancer osaka thyroid)通過直接磷酸化作用加強(qiáng)了NFATc1的穩(wěn)定并促進(jìn)其積累[17]。綜上，目前大部分研究主要集中在Ca2+依賴通路，而其他通路的進(jìn)一步作用機(jī)制仍存在進(jìn)一步研究價(jià)值。

2 破骨細(xì)胞中NFATc1的下游信號通路

NFATc1通過誘導(dǎo)和擴(kuò)增調(diào)節(jié)靶細(xì)胞mRNA水平影響OC的分化、融合與功能，見圖1。在OC分化中，OSCAR是NFATc1的目標(biāo)基因[18]。對NFATc1的負(fù)性調(diào)節(jié)減弱，如NFATc1/ Blimp1(B lymphocyte induced maturation protein 1，B淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)成熟蛋白1)/ Bcl6(B-cell lymphoma 6，B細(xì)胞淋巴瘤6)負(fù)性調(diào)節(jié)環(huán)及MafB(V-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog B)和IRF-8(Interferon regulatory factor 8，干擾素調(diào)節(jié)因子8)被抑制[19-22]。在OC融合過程中，NFATc1下游靶基因編碼的蛋白發(fā)揮著重要作用，比如樹突狀細(xì)胞特異性跨膜蛋白(DC-STAMP)、液泡膜質(zhì)子泵亞基(atp6v0d2)和原癌基因酪氨酸蛋白激酶c-Src的底物TKS5/FISH。在TKS5缺陷的OC中，激活M-CSF及RANKL后盡管仍可分化出單核破骨細(xì)胞，但是無法誘導(dǎo)出多核破骨細(xì)胞；TKS5又可以部分修復(fù)c-Src敲除OC的磷酸化過程[23]。當(dāng)整合素integrinβ3與骨基質(zhì)中的玻璃體結(jié)合蛋白結(jié)合激活后，c-Src即與ITAM結(jié)合而磷酸化酪氨酸激酶Syk并介導(dǎo)融合[24-25]。在c-Src/Syk信號通路中，integrinβ3和c-Src是NFATc1的靶基因產(chǎn)物[26-27]。此外，在atp6v0d2缺陷小鼠中同樣發(fā)現(xiàn)OC融合障礙，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)原鈣粘蛋白-7(protocadherin-7)與此過程有關(guān)[28]。骨溶解過程由OC泌酸降解骨質(zhì)，幾個(gè)NFATc1的目標(biāo)基因編碼出的蛋白參與這一過程，如氯離子通道CLC7，它是晚期細(xì)胞內(nèi)/溶酶體內(nèi)的氯離子通道，其位于OC吸收皺褶區(qū)域[27]；Cathepsin K可以使骨膠原變性[29]；TRAP可以將骨基質(zhì)磷酸骨橋蛋白及骨唾液酸糖蛋白脫磷酸化[14]。Lu等[30]最新發(fā)現(xiàn)小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(Mitf)在NFATc1下游發(fā)揮正性調(diào)節(jié)作用，它可擴(kuò)增NFATc1依賴破骨效應(yīng)；Mitf和AP-1(Fos/Jun)、PU.1等結(jié)合NFATc1組成一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合體。

3 NFATc1負(fù)性信號調(diào)節(jié)通路

NFATc1可誘導(dǎo)肝配蛋白B2(ephrinB2)的轉(zhuǎn)錄，而在OC譜系細(xì)胞中ephrinB2通過下調(diào)c-fos及NFATc1抑制OC分化，因此ephrinB2被認(rèn)為是RANK信號通路介導(dǎo)的耦合信號分子[31]。此外，一種新的負(fù)性O(shè)C調(diào)節(jié)通路被發(fā)現(xiàn)，其涉及兩個(gè)在RANKL介導(dǎo)下的轉(zhuǎn)錄抑制因子:Bcl6和Blimp1，他們形成一個(gè)NFATc1/Blimp1/Bcl6負(fù)性調(diào)節(jié)環(huán)路。Bcl6抑制破骨基因如DC-STAMP、NFATc1和Cathepsin K的表達(dá)，以及OC的分化。Bcl6基因敲除小鼠表現(xiàn)出破骨作用增強(qiáng)和骨量降低；而在適量OC存在條件下，Blimp1敲除小鼠表現(xiàn)出Bcl6高表達(dá)從而在RANKL介導(dǎo)的情況下抑制OC的分化并增加骨量，而Blimp1本身經(jīng)驗(yàn)證是可以增加小鼠OC分化的。這說明Blimp1抑制Bcl6的表達(dá)，而Bcl6又抑制破骨基因的表達(dá)；除此之外，其他NFATc1負(fù)性調(diào)節(jié)信號如IRF8及Mafb也被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)[19,22,32]。此外，Lhx2(LIM homeobox 2)最近被發(fā)現(xiàn)也能抑制NFATc1介導(dǎo)的破骨活動(dòng)[33]。這提示我們是否在目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的信號中存在著NFATc1的負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，并且是否仍存在我們尚未發(fā)現(xiàn)的負(fù)反饋調(diào)節(jié)軸？

4 NFATc1信號的節(jié)律性調(diào)節(jié)

作為調(diào)節(jié)骨生長的重要分子，NFATc1在生物體內(nèi)可能會(huì)受到激素的調(diào)節(jié)，而激素的調(diào)節(jié)一大特點(diǎn)就是具有節(jié)律性。日本學(xué)者通過將小鼠在12h的明/暗周期中飼養(yǎng)兩周后于不同晝夜時(shí)點(diǎn)(Zeitgeber times，ZT)將小鼠處死，取小鼠股骨提取mRNA并檢測OC相關(guān)基因和時(shí)鐘基因表達(dá)水平。發(fā)現(xiàn)NFATc1的震蕩時(shí)間節(jié)段與時(shí)鐘基因如PER1/PER2相似，于是提出假設(shè)兩者間存在著相似的基因結(jié)構(gòu)。最終，在NFATc1的結(jié)構(gòu)序列里找到了時(shí)鐘基因中的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)E-box，芯片檢測分析發(fā)現(xiàn)在NFATc1-613/-607和-5295/-5289位置上的E-box與腦與肌肉類芳香烴受體核轉(zhuǎn)位子蛋白1(BMAL1)存在結(jié)合。為進(jìn)一步驗(yàn)證，他們又將腎上腺切除小鼠在12小時(shí)的明/暗周期中飼養(yǎng)兩周后于ZT12行地塞米松注射(3mg/kg b.w.)，在注射后不同時(shí)間處死小鼠，并取股骨mRNA分析。最終發(fā)現(xiàn)地塞米松注射后BMAL1與NFATc1E-box之間結(jié)合增加并且在注射4h和32h后達(dá)到峰值。以上研究表明NFATc1對OC的調(diào)節(jié)中存在著節(jié)律，而這種節(jié)律可能是由時(shí)鐘蛋白調(diào)控并受腎上腺激素影響[34]。晝夜節(jié)律在骨代謝中普遍存在，其分子機(jī)制研究仍不十分清楚，而NFATc1是OC中重要的通路節(jié)點(diǎn)，介導(dǎo)著多條OC分化分子通路，因此，對NFATc1的節(jié)律調(diào)控研究是亟待研究的方向。

5 機(jī)械應(yīng)力對NFATc1通路在破骨細(xì)胞中的調(diào)節(jié)

骨適應(yīng)其環(huán)境,成骨和破骨細(xì)胞在體內(nèi)受機(jī)械負(fù)荷，骨的塑形需要受到機(jī)械刺激，這些機(jī)械力的刺激來源于體重負(fù)荷；然而，很少有機(jī)械應(yīng)力對OC影響的研究。Sumika等[35]研究表明短期對RAW264.7細(xì)胞施加拉力可激活RANKL通路；與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組NFATc1mRNA水平在施加機(jī)械拉力后6 h下降，但在12 h和24 h升高。施加機(jī)械應(yīng)力24 h后發(fā)現(xiàn)，盡管DC-STAMP mRNA和蛋白水平下降但是NFAT轉(zhuǎn)錄活性與對照相比顯著增強(qiáng)。對RAW264.7細(xì)胞施加短期的機(jī)械應(yīng)力后可減弱NFAT轉(zhuǎn)錄活動(dòng)并下調(diào)DC-STAMP從而明顯抑制OC生成。有研究發(fā)現(xiàn),在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)和小鼠OPC中流體切力(FSS)可以增加促炎基因表達(dá)[36]；隨后發(fā)現(xiàn)機(jī)械應(yīng)力介導(dǎo)CaN-NFATc軸調(diào)節(jié)OC[37]。最新發(fā)現(xiàn)FSS可以使Ca2+在胞質(zhì)中富集[38]，故可能繼續(xù)通過Ca2+信號通路來調(diào)控NFATc1。在生理狀態(tài)下，體內(nèi)應(yīng)力環(huán)境是多樣、復(fù)雜且偶聯(lián)的，機(jī)械負(fù)荷在調(diào)控成骨及破骨細(xì)胞生理功能中發(fā)揮重要作用，因此可預(yù)防或治療骨質(zhì)疏松[39]。而目前各種機(jī)械應(yīng)力在OC的分子通路機(jī)制研究尚少，各種應(yīng)力如何將力學(xué)信號轉(zhuǎn)換并介導(dǎo)分子信號通路也未能闡釋清楚；NFATc1作為調(diào)節(jié)骨形成的重要轉(zhuǎn)錄因子，其與機(jī)械應(yīng)力間的關(guān)系非常值得研究。

6 結(jié)論

作為關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，NFATc1在OC的分化及骨溶解等過程中扮演著重要的角色。隨著對其研究的深入，越來越多相關(guān)的分子通路及靶點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)，其無疑為日后以抑制OC分化、融合及骨溶解為目的的研究治療提供了基礎(chǔ)。值得注意的是，OC作為溶解骨的基本單位，其處于人整體內(nèi)環(huán)境中，因此將承受外界機(jī)械應(yīng)力及人體內(nèi)各種激素及分子的影響，NFATc1作為誘導(dǎo)OC關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，其與各種刺激信號轉(zhuǎn)化的關(guān)系，以及與其相關(guān)信號通路的機(jī)制仍十分具有研究價(jià)值。