大鼠卵巢去勢后頜骨和股骨骨髓基質干細胞性能觀察

惠亞玲 何勇 郭麗

1.武警工程大學武警醫(yī)院急診科，陜西 西安 710032 2.武警工程大學武警醫(yī)院口腔中心，陜西 西安 710032 3.西安市第九人民醫(yī)院口腔科，陜西 西安 710038

骨質疏松具有較高的發(fā)病率，尤其是女性絕經后因雌激素的缺乏可導致每年骨量丟失達到3%～5%，嚴重影響中老年女性患者的生活。骨質結構和功能的變化是骨髓干細胞生物學活性變化的結果。骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs) 是目前研究較多的成體干細胞之一，在適宜的誘導下具有向骨、軟骨、脂肪、神經等多向分化潛能，也是組織工程中較理想的種子細胞[1,2]。

大量資料提示雌性大鼠去除卵巢后機體雌激素和骨密度將迅速下降，在短時間內極好地模擬絕經后骨質疏松癥(osteoporosis postmenopausal，OPM)的病理生理變化，是較為理想的動物觀察模型[3]；有學者發(fā)現骨質疏松對頜骨的影響在程度和時效上均弱于全身其他骨骼[4]，這種差異是否也表現在干細胞的生物學活性尚不確切。本實驗通過構建骨質疏松模型進行頜骨和股骨來源的BMSCs增殖和成骨分化能力的比較研究，旨在觀察骨質疏松對不同部位骨髓基質干細胞增殖和成骨分化的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和材料

1.1.1實驗動物：健康雌性未孕SD大鼠40只(購于第四軍醫(yī)大學動物中心)，18 w齡，體質量(160.12±7.12) g，同等條件下分籠適應性飼養(yǎng)1 w 后，隨機分為對照組及實驗組。實驗過程嚴格遵照第四軍醫(yī)大學動物倫理委員會準則。

1.1.2實驗試劑及儀器：DMEM培養(yǎng)基(Gibco，美國)；胎牛血清(杭州四季青生物工程有限公司)；地塞米松(Sigma，美國)；L-谷氨酰胺(Gibco, 美國)；抗壞血酸(Sigma，美國)；0.25%胰蛋白酶(Amresco，美國)；青、鏈霉素(Gibco，美國)；CCK-8 檢測試劑盒 (博士德生物工程有限公司，武漢)。

超凈工作臺(蘇州 SW-CJ-1SD)；酶聯免疫檢測儀(南京華東DG5032)；二氧化碳恒溫孵箱(Forma，美國)；離心機(Kubota，日本)；六孔培養(yǎng)板(Nunc公司, 美國)；96孔培養(yǎng)板(Nunc公司, 美國)；倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)((Olympus,日本)。

1.2 實驗方法

1.2.1去卵巢骨質疏松大鼠模型的建立：清潔級SD大鼠20只，經2%戊巴比妥鈉麻醉腹腔注射麻醉生效后，消毒鋪巾, 自背部切開，完整摘除雙側卵巢，關閉術區(qū)。術后定量喂食, 自由飲水, 飼養(yǎng)溫度20～25℃, 相對濕度為40%～70%。

1.2.2實驗分組：16只未去卵巢大鼠和術后10 w建模成功的16只去卵巢大鼠分成4組各8只分別用于提取原代頜骨及股骨骨髓間充質干細胞。4只未去卵巢大鼠用于體內實驗。

1.2.3大鼠骨髓基質細胞的分離及培養(yǎng)：采用全骨髓貼壁法分別培養(yǎng)去卵巢大鼠和健康大鼠的頜骨骨髓基質干細胞(mBMSCs)和股骨骨髓基質干細胞(fBMSCs)。大鼠處死后即刻浸泡于75%乙醇中10 min，于超凈工作臺下剝離下頜骨，拔出牙齒，暴露骨髓腔；切取雙側股骨，清理骨表面組織，去除股骨兩端，露出骨髓腔，用DMEM 培養(yǎng)基經2 mL注射器反復沖洗骨髓腔，轉移沖洗液至離心管中，1000 r/min離心5 min，棄上清，重復離心2次，用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基輕輕吹打制備單細胞懸液，并接種于60 mm2培養(yǎng)皿中，標記，于37 ℃，5% CO2孵箱培養(yǎng)48 h，貼壁細胞即為BMSCs，原代細胞鋪滿瓶底約85%時即常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.2.4骨髓基質干細胞增殖能力

1.2.4.1CCK-8 實驗：調整四組第二代細胞以每孔100 μL，2×103個/孔密度接種于96孔板，各組分別于接種后第1、3、5、7d加入CCK-8溶液10 μL/孔，孵育4 h后酶標儀測定450 nm處吸光度。操作嚴格按照CCK-8試劑盒的步驟說明進行。

1.2.4.2MTT分析：將四組干細胞分別以2×103/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板，按0.2 mL/孔加入培養(yǎng)液，37℃下5%CO2孵箱中連續(xù)培養(yǎng)7d，隔日換液。連續(xù)6 d每組每日定時測量6個孔，加入20 μL 5 mg/mL的MTT液，繼續(xù)孵養(yǎng)4 h。去除孔內培養(yǎng)液上清液，每檢測孔加入150 μL的DMSO，低速震蕩10 min，確保結晶物充分融解。酶聯檢測儀測量490 nm波長處各孔吸光度(OD)，分別以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制生長曲線。

1.2.5骨髓基質干細胞膜片的制備與體內移植

1.2.5.1體內異位移植實驗：將增殖狀態(tài)良好的第3代BMSCs胰酶消化5 min，調整細胞懸液密度，以5×105個數量分別均勻接種于直徑90 mm培養(yǎng)皿，加入10 mL DMEM培養(yǎng)液(含10%FBS、50 μg/mL 抗壞血酸)，隔日換液，連續(xù)孵育10 d后培養(yǎng)皿出現底部貼合緊密，邊緣微卷的乳白色膜樣物質，此即為成熟的BMSCs單層細胞膜片。

1.2.5.2體內異位移植實驗：A 網膜下移植：4只SD大鼠經2%苯巴比妥鈉麻醉，固定、腹部脫毛、消毒鋪巾，腹部橫切口暴露大網膜，于網膜中份分離兩層網膜制備移植囊，分別將4種干細胞膜片與TCP復合置于植床內，適度內折固定，復位網膜，關閉創(chuàng)口。B 組織學評價：觀察6 w處死動物，完整切取移植物，10%福爾馬林固定，沖洗，脫鈣，系列脫水、石蠟包埋、切片，HE染色，光鏡觀察。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS13.0軟件對實驗數據進行統(tǒng)計分析，進行單因素方差分析。

2 結果

2.1 去卵巢骨質疏松大鼠模型

本組20只去卵巢大鼠因4只出現手術并發(fā)癥先后死亡，其余16只大鼠在去卵巢后體質量2w內平均增加37+8.1g，術后8w時經股骨骨密度檢測顯示BMD平均降低了97%，證實了模型的建立。

2.2 BMSCs形態(tài)學觀察

本實驗健康及骨質疏松狀態(tài)下原代BMSCs均貼壁迅速，二者貼壁速度及形態(tài)學特征均未見顯著性差異。4組細胞接種6 d后倒置相差顯微鏡下均分布較為均勻，貼壁細胞形態(tài)呈多樣化，以紡錘形為主，短梭形、多角形、星形等均可察見。8d后可見梭形細胞呈漩禍狀集落生長，其間散在少許圓形細胞，集落間呈現融合趨勢。頜骨和股骨BMSCs間以及健康與骨質疏松狀態(tài)下BMSCs間細胞貼壁及增殖速度未見明顯差異，傳代后4類細胞均生長均勻，胞體明顯增加，傾于均一的長梭形。

2.3 4種骨髓基質干細胞增殖情況

采用CCK-8法檢測OD值，比較不同部位及全身骨狀況對BMSCs的影響，結果顯示，隨著培養(yǎng)時間的延長，BMSCs的增殖活性呈升高趨勢；骨質疏松狀態(tài)下頜骨及股骨BMSCs的增殖速度初期與健康狀態(tài)下的細胞無顯著性差異(P>0.05)，3d后增殖速度則逐漸緩慢于健康組(P<0.05)；健康組頜骨和股骨不同部位間兩種BMSCs的OD值比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，骨質疏松狀態(tài)下頜骨來源BMSCs后期的增殖能力明顯優(yōu)于股骨來源的BMSCs(P<0.05)。見圖1。

2.4 MTT分析

4組細胞不同時間段的單因素方差分析結果顯示，去卵巢組在同等時間條件下與未去卵巢組比較，1d時總體均數差異無顯著統(tǒng)計學意義，2d后各時段均數差異具有顯著統(tǒng)計學 意義(P<0.05)。由此可見，骨質疏松對BMSCs的增殖的影響具有時間依賴性。頜骨和股骨BMSCs在健康骨質環(huán)境下，細胞的OD值各時間段均未出現統(tǒng)計學差異，骨質疏松狀態(tài)下頜骨的增殖速度初期與股骨BMSCs無顯著性差異(P>0.05)，48h后增殖速度則逐漸快于對照組(P<0.05)；提示骨質疏松對BMSCs的增殖可能存在著部位因素影響。見表1。

表1 不同部位及骨質狀況培養(yǎng)的BMSCs的吸光度(OD)值Table 1 Optical density of cultured BMSCs in different location and bone condition

注：去卵巢組內比較，aP<0.05；去卵巢股骨BMSCs與未去卵巢股骨BMSCs比較，bP<0.05；去卵巢頜骨BMSCs與未去卵巢頜骨BMSCs比較，cP<0.05； 未去卵巢股骨BMSCs 與去卵巢頜骨BMSCs比較，dP<0.05

2.5 不同來源BMSCs細胞膜片的性能

4類細胞采用低密度接種法均能獲取骨髓基質干細胞膜片，膜片的成熟時間為7～10 d，去卵巢組BMSCs的成膜及成熟時間略慢于未去卵巢組。動態(tài)觀察顯示，從成骨誘導第三天開始就能觀察到細胞外基質的沉積，相對而言未去卵巢組BMSCs基質分泌量及分布較骨髓基質干細胞更為迅速、均勻，后期鏡下觀察未見顯著差異。4種膜片隨孵育時間增長，細胞外基質大量分泌，細胞極性化排列更為整齊緊密、胞體更豐滿，細胞的梭形外形變得相對圓潤，細胞突起伸展自然且完整，細胞間有序地連接，細胞復層化趨勢更為明顯。成熟的膜片厚度上未見明顯差異，剝離后均能迅速收縮。

4種膜片的大網膜移植結果，顯示體內移植6w后，在TCP誘導下均可形成不均質的礦化物沉積和纖維樣組織穿通，似牙周膜/牙骨質復合體樣結構；去卵巢組BMSCs膜片組再生的纖維束更為粗大，走形不一致，僅見少量的礦化物質的生成，頜骨來源BMSCs組較股骨來源BMSCs再生礦化物能力強；未去卵巢組頜骨來源BMSCs組較股骨來源BMSCs組纖維穿通性更明顯，表面礦化沉積更均衡，有滿意的牙骨質/牙周膜樣復合體的形成(見圖2)。

圖1 不同部位及骨質狀況對BMSCs增殖能力的影響Fig.1 The effect different location and bone condition on the proliferation of cultured BMSCs

3 討論

骨質疏松是一種以骨量減少為特征的骨代謝性疾病，其發(fā)病因素眾多,各種誘因導致的病理歸宿均為骨組織成骨能力弱于破骨能力、骨微結構破壞、骨量丟失、骨強度下降，增加患者骨折的風險[5-7]。骨組織的健康是骨形成與骨吸收之間動態(tài)平衡的結果，成骨細胞和破骨細胞的生物學活性及狀態(tài)直接影響著骨組織的轉歸。骨髓間充質干細胞廣泛存在于全身骨髓組織和松質骨內，作為成骨細胞的前體細胞，具有成骨、成脂、成軟骨等多向分化能力，對于調控骨吸收和骨形成的相對平衡起著至關重要作用[8,9]。隨著現代分子生物學技術的深入運用，大量資料證明BMSCs的異常表現與骨質疏松癥的發(fā)病密切相關。干細胞的生物學活性極大程度上受骨髓局部微環(huán)境的調控，機體激素水平、營養(yǎng)狀況以及局部應力和炎癥變化等因素均可使微環(huán)境中細胞因子發(fā)生改變，繼而通過調節(jié)成骨細胞的生存時間及狀態(tài)來適應內環(huán)境的變化，當BMSCs的功能異常導致骨吸收-骨形成的偶聯失調時將導致骨質疏松的發(fā)生[10,11]。對OPM的BMSCs生物學狀態(tài)的研究尚存爭議，有學者發(fā)現OPM患者BMSCs對成骨誘導分化的敏感性和鈣沉積程度均明顯下降；也有學者觀察到OPM患者因雌激素缺乏，BMSCs的多向分化和增殖能力適應性增強以滿足骨吸收而代償性地增加骨形成，進而導致骨重建的失衡。這些研究結果均提示在骨質疏松狀態(tài)下BMSCs的生物學活性異常，其活性對于疾病的發(fā)展及轉歸具有重要意義。

膜片技術通過細胞外基質的大量沉積進而有序地將細胞連接成一種不需要外源性材料，完全由細胞及細胞外基質組成的片狀結構。膜片內這些精細構建的復雜的信號及結構系統(tǒng)可以提高細胞的生物學活性，更便于對干細胞的生長、發(fā)育及分化過程進行全方位的調控及干預，是干細胞移植定向分化的一個重要的研究方向[12]。

目前關于骨質疏松對全身骨組織和口腔骨組織的影響是否具有差異性尚存爭議，但多數數據顯示由雌激素缺乏所引起的骨質疏松對全身骨組織與頜骨的作用是不同步的，頜骨結構在骨質疏松早期尚無明顯改變，相對滯后于全身骨組織[13]。頜骨發(fā)育于顱神經嵴源外胚間充質，具有獨特的膜內成骨機制，這些資料均提示頜骨來源的BMSCs具有BMSCs的生物學特性，但依然可能存在著一定的部位差異性。本組將4種細胞膜片與骨替代物的異位移植擬觀察四種BMSCs在成骨分化方面的性能差異，結果顯示頜骨來源的BMSCs能夠形成不均質的礦化物沉積和纖維樣組織穿通，再生類牙周膜/牙骨質復合體樣結構的能力較股骨來源的BMSCs相對較強，這證實了BMSCs分化潛能的區(qū)域性，頜骨來源的BMSCs傾向于向頜面部組織細胞分化，更有利于牙源性組織工程的應用。在礦物質的誘導下骨質疏松狀態(tài)的股骨來源的BMSCs的成骨活性有所降低，移植6w未見顯著的礦物質沉積，僅有大量的無序的成纖維組織的再生，但在同等骨條件下其頜骨來源的BMSCs依然表現出一定的成骨分化能力；細胞實驗也提示健康和去卵巢骨質疏松大鼠的骨髓間充質干細胞培養(yǎng)未見形態(tài)學的顯著差異；但BMSCs的增殖實驗發(fā)現接種初期去卵巢骨質疏松大鼠與健康狀態(tài)下的細胞增殖速度無顯著性差異，隨培養(yǎng)時間的延長，各類BMSCs的增殖活性均出現顯著差異性，骨質疏松狀態(tài)下干細胞的活性顯著弱于健康組，但骨質疏松狀態(tài)下頜骨來源的干細胞后期的增殖能力雖然較健康組有所減弱，但明顯強于股骨來源的BMSCs，本組結果部分印證了上述研究，但這是否提示骨質疏松狀態(tài)下頜骨來源的BMSCs的生物學活性受影響的程度相對較小，尚待進一步探討。