不同組織來源間充質(zhì)干細(xì)胞體外成骨分化能力的比較研究

趙剛 劉微微 高偉瑋 馬潔

天津市康婷生物工程有限公司，天津 300385

骨組織缺損是一種因外傷、腫瘤切除、感染等因素引起的骨質(zhì)流失從而形成的較大間隙，這一問題在臨床較為常見并且較難處理[1,2]。隨著骨組織工程技術(shù)的不斷發(fā)展，這一問題得到了一定程度的解決。骨組織工程需要可降解的支架材料和合適的種子細(xì)胞?？山到庵Ъ懿牧涎芯康娜藛T越來越多，取得的成果也十分顯著，但是種子細(xì)胞的選擇一直困擾著研究人員。早期研究人員選用骨細(xì)胞和骨基質(zhì)細(xì)胞作為種子細(xì)胞，但是這種細(xì)胞取材困難，體外增殖能力較弱，不易作為真正的種子細(xì)胞[3]。隨后，研究人員將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)作為種子細(xì)胞應(yīng)用于骨組織工程，以此來修復(fù)骨缺損，并且取得了一定的成效，但是BMSCs的活力及細(xì)胞數(shù)量與供體年齡呈負(fù)相關(guān)，限制了其的應(yīng)用[4-8]。因此，尋找一種替代BMSCs的細(xì)胞勢(shì)在必行。經(jīng)研究證實(shí)分離培養(yǎng)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ASCs)和臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSCs)的方法簡(jiǎn)便，分離培養(yǎng)出的細(xì)胞在體外具有較強(qiáng)的增殖能力、多向分化潛能以及低免疫原性等優(yōu)點(diǎn)[9-12]。因此，ASCs和UC-MSCs被認(rèn)為是骨組織工程中非常有前景的種子細(xì)胞。有研究表明，I型膠原(COL I)是骨組織標(biāo)志性代表因子，ALP是骨再生早期的代表性因子，骨鈣素(OCN)是骨再生后期代表性因子，Osterix是骨再生過程調(diào)控骨基質(zhì)形成的轉(zhuǎn)錄因子[13-16]。因此，本研究旨在通過對(duì)ASCs、BMSCs和UC-MSCs體外成骨能力的研究尋找優(yōu)勢(shì)干細(xì)胞種類，為骨組織工程修復(fù)骨缺損提供一定的數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1主要試劑：DMEM/Ham’sF-12、磷酸緩沖液(Hyclone公司)；胎牛血清(百靈公司)；青鏈霉素(華北制藥)；cck-8(上海同仁)；I型膠原酶、胰蛋白酶、堿性磷酸酶試劑盒、茜素紅(Sigma)；Trizol(Invitrogen公司)；real-time PCR試劑盒SYBR Premix Ex TaqTMII、反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimScriptTMRT Master Mix(TakaRa公司)；CD14-PE、CD34-PE、CD44-PE、CD45-PE、CD90-PE、CD105-PE(BD公司)；Ficoll淋巴分離液(GE公司)，氯化十六烷基吡啶(上海試劑一廠)。

1.1.2組織：脂肪、骨髓和臍帶組織，取自天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)：脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)：獲取無菌的脂肪組織，無菌條件下將脂肪組織剪碎，加入0.075%的I型膠原酶，消化90 min；1500 r/min離心5 min，棄上清和未消化的脂肪組織；磷酸緩沖液重懸沉淀，1500 r/min，離心5 min；完全培養(yǎng)液(DMEM/F-12+10%FBS)重懸沉淀，計(jì)數(shù)，將細(xì)胞以1×106/cm2接種至培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，3d后換液，去除未貼壁的細(xì)胞。

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)：獲取無菌的臍帶組織，無菌條件下剝離臍帶組織的外膜和臍帶組織內(nèi)動(dòng)、靜脈，分離出華通氏膠并剪碎至2～3 mm3，將剪碎的華通氏膠組織塊貼于培養(yǎng)瓶底面，2 h后向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)添加適量完全培養(yǎng)液，1 w之后換液。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)：獲取無菌的骨髓，用磷酸緩沖液沖洗骨髓，1500 r/min離心5 min，去上清；加入與沉淀等體積的磷酸緩沖液，混合均勻；按照骨髓：Ficoll=1∶1的體積比例，將骨髓緩慢加入Ficoll液面上，2000 r/min離心20 min；吸取間白膜層單核細(xì)胞，加入磷酸緩沖液沖洗，1500 r/min離心5 min，棄上清；用完全培養(yǎng)液重懸沉淀，計(jì)數(shù)，以1×106/cm2的細(xì)胞密度接種至培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。

上述3種細(xì)胞于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2細(xì)胞增殖能力測(cè)定：取P3代上述3種MSCs，并以2×103個(gè)/孔接種至96孔板，采用CCK8法連續(xù)8d測(cè)定其吸光值。

1.2.3細(xì)胞表型鑒定：取P3代MSCs，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA室溫消化2 min，1500 r/min，離心5 min；收集沉淀，磷酸緩沖液重懸細(xì)胞，過40 μm濾網(wǎng)，制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，加入FBS進(jìn)行封閉；棄去FBS，用磷酸緩沖液清洗3次；將細(xì)胞制成1×108/L的細(xì)胞懸液，取100μL分別加入相應(yīng)量的PE標(biāo)記鼠抗人抗體CD14、CD34、CD44、CD45、CD90和CD105，避光40 min，離心，磷酸緩沖液清洗1次；上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.2.4細(xì)胞成骨誘導(dǎo)后染色鑒定：取P3代MSC以一定密度接種至6孔板中，次日實(shí)驗(yàn)組更換為成骨誘導(dǎo)液(10 mmol/Lβ-甘油磷酸、10-7mol/L地塞米松、50 μg/mL抗壞血酸)，對(duì)照組更換為H-DMEM+10%FBS，3 d更換1次成骨誘導(dǎo)液，成骨誘導(dǎo)9d后做堿性磷酸酶染色；3種MSCs成骨誘導(dǎo)后茜素紅染色鑒定：茜素紅染色后定量分析時(shí)，使用氯化十六烷基吡啶溶解鈣結(jié)節(jié)，570 nm處測(cè)OD值。

1.2.5細(xì)胞成骨誘導(dǎo)后分子水平鑒定：采用Trizol法提取3種MSCs成骨誘導(dǎo)9 d和18 d后細(xì)胞RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，然后進(jìn)行RT-qPCR。引物設(shè)計(jì)：按照NCBI GenBank的人COL1、ALP、Osterix、OCN和GAPDH的mRNA序列，排除與人其他基因的同源性后設(shè)計(jì)、合成引物。

表1 3種骨再生相關(guān)基因PCR引物Table 1 The PCR primers of osteogenesis-related genes

RT-qPCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s；55退火30 s；72延伸45 s；39個(gè)循環(huán)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

圖2 3種MSCs增殖曲線Fig.2 The growth curve of the three MSCs cells

圖3 3種MSCs的流式檢測(cè)A:ASC0s，B:BMSCs，C:UC-MSCsFig.3 The flow cytometry analysis of the three MSCs

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

P3代三種MSCs倒置顯微鏡下觀察到的細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞均呈長(zhǎng)梭狀，集落式旋渦式生長(zhǎng)。

圖1 3種MSCs倒置顯微鏡下觀察到的細(xì)胞形態(tài)(100×)Fig.1 The cell morphology of the three MSCs under phase contract microscope (100×)

2.2 細(xì)胞增殖能力比較

3種P3代MSC傳代后1～3 d處于潛伏期，此時(shí)細(xì)胞沒有明顯的增殖；3～5 d進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)細(xì)胞增殖活躍；5 d之后細(xì)胞進(jìn)入平臺(tái)期，細(xì)胞增殖趨于平緩。

2.3 細(xì)胞表型的鑒定

P3代ASCs、BMSCs和UC-MSCs流式鑒定結(jié)果，CD14、CD34和CD45表達(dá)率均低于1%，CD44、CD90和CD105的表達(dá)率均高于97%。

圖4 三種MSCs成骨誘導(dǎo)9dALP染色(100×)Fig.4 ALP staining of the three MSCs cells (100×)

圖5 3種MSCs成骨誘導(dǎo)18 d茜素紅染色(100×)Fig.5 Alizarin red staining of the three MSCs cells (100×)

2.4 細(xì)胞成骨誘導(dǎo)后染色鑒定MSCs成骨誘導(dǎo)9 d后染色

2.4.1ALP染色：P3代3種MSCs成骨誘導(dǎo)9d后堿性磷酸酶(ALP)染色，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)均有大量成骨分化蛋白ALP表達(dá)。

2.4.2茜素紅染色：P3代3種MSCs成骨誘導(dǎo)18 d后茜素紅染色可以看到實(shí)驗(yàn)組有大量礦化鈣結(jié)節(jié)產(chǎn)生(如圖5)，BMSCs成骨誘導(dǎo)所形成的礦化鈣結(jié)節(jié)與UC-MSCs無顯著性差異，但顯著性高于ASCs(如圖6)。

2.5 細(xì)胞成骨誘導(dǎo)后分子水平比較

2.5.1細(xì)胞成骨誘導(dǎo)9 d：P3代3種MSCs成骨誘導(dǎo)9 d后，實(shí)驗(yàn)組COLI、ALP和Osterix 3種基因均高表達(dá)(如圖7)；3種MSCs成骨誘導(dǎo)9 d后，UC-MSC實(shí)驗(yàn)組的COLI基因表達(dá)顯著性高于BMSCs，ASCs和UC-MSCs實(shí)驗(yàn)組的ALP基因表達(dá)顯著性低于BMSCs，ASCs實(shí)驗(yàn)組的Osterix基因表達(dá)顯著性低于BMSCs，UC-MSCs實(shí)驗(yàn)組的Osterix基因表達(dá)與BMSCs無顯著性差異(如圖8)。

2.5.2細(xì)胞成骨誘導(dǎo)18 d：P3代3種MSCs成骨誘導(dǎo)18d后，實(shí)驗(yàn)組COLI、OCN和Osterix 3種基因均顯著性高表達(dá)(如圖9)；ASCs和UC-MSCs實(shí)驗(yàn)組的COLI基因表達(dá)顯著性高于BMSCs，ASCs和UC-MSCs實(shí)驗(yàn)組的OCN基因表達(dá)顯著性低于BMSCs，ASCs實(shí)驗(yàn)組的Osterix基因表達(dá)與BMSCs無顯著性差異，UC-MSCs實(shí)驗(yàn)組的Osterix基因表達(dá)顯著性低于BMSCs(如圖10)。

圖6 3種MSCs礦化能力的定量分析Fig.6 Quantitative analysis of the mineralization ability in three MSCs*P<0.05 compared with BMSCs group

圖7 3種MSCs成骨誘導(dǎo)9d后COLI、ALP和Osterix基因表達(dá)Fig.7 The gene expressions of Osterix, ALP, and COL1 in three MSCs induced after 9 days**P<0.01compared with control group

圖8 比較3種MSCs成骨誘導(dǎo)9d后COLI、ALP和Osterix基因的表達(dá)(P<0.05)Fig.8 Comparison of the gene expressions of COLI, ALP, and Osterix among the three MSCs induced after 9 days*P<0.05 compared with BMSCs

3 討論

自體BMSCs作為骨組織工程治療骨缺損的金種子細(xì)胞，但是自體BMSCs存在著取材難、易對(duì)患者帶來二次傷害等不足之處[8,9]。本研究希望通過對(duì)不同來源MSCs體外成骨能力的比較，找到一種優(yōu)勢(shì)干細(xì)胞作為骨組織工程的種子細(xì)胞。

本研究通過體外實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)3種MSCs細(xì)胞均呈長(zhǎng)梭型，且細(xì)胞呈漩渦式生長(zhǎng)；3種MSCs的P3代細(xì)胞在3～5 d處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，說明3種MSCs在體外增殖方面無顯著性差異。通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)3種MSCs表面標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)3種MSCs細(xì)胞表面均表達(dá)CD44、CD90和CD105且表達(dá)率均高于97%，說明ASCs和UC-MSCs與BMSCs在細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)方面無顯著性差異，均屬于MSCs范疇。進(jìn)一步通過體外染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)3種MSCs成骨誘導(dǎo)后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)均表達(dá)成骨分化蛋白ALP和礦化蛋白。茜素紅染色后定量分析發(fā)現(xiàn)UC-MSCs和BMSCs在鈣結(jié)節(jié)形成方面無顯著性差異。

圖9 3種MSCs成骨誘導(dǎo)18 d后COLI、OCN和Osterix基因表達(dá)Fig.9 The gene expressions of Osterix, ALP, and COL1 in three MSCs induced after 18 days**P<0.01compared with control group

圖10 比較3種MSCs成骨誘導(dǎo)18 d后COLI、OCN和Osterix基因的表達(dá)Fig.10 Comparison of the gene expressions of COLI, ALP, and Osterix among the three MSCs induced after 18 days*P<0.05 compared with BMSCs

經(jīng)研究證實(shí)骨再生過程經(jīng)歷了早期和后期兩個(gè)階段，ALP是骨再生早期的代表性因子，骨鈣素(OCN)是骨再生后期的代表性因子，COL1是骨組織再生過程以及骨組織的代表性因子，Osterix基因是在骨再生過程中調(diào)控骨基質(zhì)的形成[17-21]。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法比較3種MSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)后Osterix、ALP、OCN和COLI基因的表達(dá)，比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)3種MSCs實(shí)驗(yàn)組的四種與骨再生相關(guān)的基因均顯著性高表達(dá)于對(duì)照組。而ASCs和UC-MSCs實(shí)驗(yàn)組的ALP和OCN基因的表達(dá)顯著性低于BMSCs組；但是比較COLI基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ASCs和UC-MSCs較BMSCs顯著性高表達(dá)；比較Osterix基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)成骨誘導(dǎo)9d時(shí)，ASCs的Osterix基因較BMSCs顯著性低表達(dá)，但是成骨誘導(dǎo)18d時(shí)，ASCs實(shí)驗(yàn)組的Osterix基因較BMSCs顯著性高表達(dá)；由此說明3種MSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)后，其成骨再生相關(guān)基因表達(dá)的時(shí)序性存在著一定的差異。由此得出ASCs和UC-MSCs經(jīng)過成骨誘導(dǎo)后，決定成骨再生相關(guān)因子的基因與BMSCs誘導(dǎo)組基因表達(dá)趨勢(shì)相一致，進(jìn)一步說明ASCs和UC-MSCs可替代BMSCs作為骨組織工程的種子細(xì)胞來治療骨缺損。

本研究將為骨組織工程選擇種子細(xì)胞提供新的思路，為臨床上應(yīng)用骨組織工程治療骨缺損提供可靠的數(shù)據(jù)支持，為骨組織工程更好的治療骨缺損提供幫助。