移植腎排異背景下血清多反應(yīng)性IgG對(duì)凋亡細(xì)胞反應(yīng)性升高并激活補(bǔ)體途徑

賈 丹，榮春書(shū)，童 嵐，高寶山*

(1．吉林大學(xué)第一醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130021；2．長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130021)

*通訊作者

移植腎排異背景下血清多反應(yīng)性IgG對(duì)凋亡細(xì)胞反應(yīng)性升高并激活補(bǔ)體途徑

賈 丹1，榮春書(shū)2，童 嵐1，高寶山1*

(1．吉林大學(xué)第一醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130021；2．長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130021)

抗體介導(dǎo)的排異反應(yīng)(Antibody mediated rejection，AMR)是腎移植后導(dǎo)致移植物失功的主要原因之一。而AMR的核心特征是受者循環(huán)中出現(xiàn)針對(duì)移植物的抗體，此類抗體包括移植前預(yù)存于體內(nèi)的抗體以及移植后新生抗體。當(dāng)抗體為特異性識(shí)別供者所表達(dá)的HLA抗原時(shí)則被稱為供者特異性抗體(Donor specific antibodies，DSA)，而當(dāng)抗體識(shí)別的是自身表達(dá)的抗原時(shí)則被稱為自身抗體。 研究發(fā)現(xiàn)在AMR過(guò)程中另一種形式的抗體[1]表現(xiàn)出廣泛的反應(yīng)性，此類抗體可以與多種毫不相關(guān)的抗原諸如雙鏈DNA、胰島素、磷酸脂多糖以及多態(tài)性HLA分子發(fā)生反應(yīng)。通過(guò)分子實(shí)驗(yàn)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，其中一個(gè)單克隆的多反應(yīng)性抗體由一個(gè)在循環(huán)中高度擴(kuò)增的記憶性B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，而這個(gè)單克隆的B細(xì)胞占據(jù)了AMR患者外周血B細(xì)胞的0.2%。值得關(guān)注的是，AMR患者血清所識(shí)別的HLA位點(diǎn)恰好與這個(gè)高度擴(kuò)增的B細(xì)胞克隆分泌的抗體所識(shí)別的HLA位點(diǎn)重合，此現(xiàn)象提示我們，多反應(yīng)性抗體的存在可對(duì)腎移植患者總體血清反應(yīng)性做出貢獻(xiàn)。

在小鼠中，多反應(yīng)性抗體由B1細(xì)胞產(chǎn)生，B1細(xì)胞作為固有B細(xì)胞的一個(gè)亞群，初始位于腹膜腔內(nèi)而并非淋巴組織，B1細(xì)胞被認(rèn)為分泌“自然抗體”，這些抗體可與程序性死亡的細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)并參與它們的清除。本文研究AMR過(guò)程中產(chǎn)生的多反應(yīng)性抗體對(duì)凋亡細(xì)胞作用，從而評(píng)估此背景下B1細(xì)胞的反應(yīng)性。

另一個(gè)重要問(wèn)題，即多反應(yīng)性抗體的臨床意義及其在AMR中的作用。目前已經(jīng)明確的是，DSA通過(guò)激活補(bǔ)體途徑介導(dǎo)移植物組織損傷，而補(bǔ)體途徑的激活可通過(guò)C4d分子沉積于移植物內(nèi)膜細(xì)胞來(lái)揭示。本研究通過(guò)探索多反應(yīng)性抗體是否也能激活補(bǔ)體途徑，從而評(píng)估其對(duì)AMR病理進(jìn)程造成的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究所用血清樣本來(lái)源于：(1)腎移植術(shù)后移植腎功能正常的患者30例；(2)腎移植術(shù)后出現(xiàn)移植腎AMR的患者18例；(3)健康志愿者5例。其中，移植腎功能正常組患者與AMR組患者在性別構(gòu)成、年齡、透析方式、移植前透析時(shí)間、原發(fā)病、體重指數(shù)、移植前誘導(dǎo)用藥、免疫抑制方案等方面均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

1.2 方法

1.2.1 凋亡細(xì)胞的制備 Jurkat細(xì)胞株0.5×106/ml與200 ng/ml抗FAS抗體于37℃孵育箱內(nèi)共孵育15小時(shí)。Annexin-V及7-AAD(BD公司)染色以確認(rèn)細(xì)胞凋亡。

1.2.2 血清IgG純化 將血清與純化緩沖液以1∶10混勻后加入預(yù)裝有吸附膠體及濾膜的純化容器，6000 rpm離心2 min，通過(guò)濾膜落入Eppendorf試管中的稀釋血清即純化后的IgG抗體，收集待用。

1.2.3 血清IgG對(duì)凋亡細(xì)胞的反應(yīng)性 將分別從腎移植患者及健康志愿者血清中純化的IgG抗體與1×106誘導(dǎo)凋亡后的Jurkat細(xì)胞株混勻，37℃孵育30 min，低溫洗滌二次，分別向標(biāo)本中加入FITC耦聯(lián)的抗IgG的二抗(Invitrogen公司)，4℃避光孵育30 min。低溫洗滌二次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)IgG對(duì)凋亡細(xì)胞的反應(yīng)性。反應(yīng)強(qiáng)度用平均熒光強(qiáng)度(MFI)表示。

1.2.4 C4d沉積實(shí)驗(yàn) 0.5×106Jurkat凋亡細(xì)胞分別與60 μl稀釋成1∶2的純化血清IgG于37℃孵育15 min。Hank's平衡鹽以1∶100稀釋健康志愿者血清做為補(bǔ)體來(lái)源加入樣本，37℃孵育15 min。低溫洗滌，于反應(yīng)體系中加入抗C4d二抗(Quidel公司)，4℃避光孵育30 min。低溫洗滌二次，加入FITC耦聯(lián)的鼠抗人IgG二抗(BD公司)，4℃避光孵育30 min。低溫洗滌后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞表面C4d沉積情況。C4d沉積強(qiáng)度用MFI表示。

1.2.5 移植腎活檢組織C4d及活化caspase-3免疫熒光染色 來(lái)自2例AMR患者移植腎穿刺組織，連續(xù)冰凍切片風(fēng)干30 min并于PBS液中漂洗，抗C4d抗體(1∶100，Quidel公司)及抗caspase-3抗體(1/50，BD公司)分別染色1 h，漂洗后加入羊抗兔IgG二抗(1/200，Vector公司)孵育30 min，漂洗后分別加入FITC-streptavidin (1/150，Vector公司)以及Cy3-streptavidin(1/5000，Jackson公司)。應(yīng)用Olympus BX60熒光顯微鏡觀察切片染色情況。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 Student非配對(duì)t檢驗(yàn)用以比較各組間血清IgG對(duì)凋亡細(xì)胞的反應(yīng)性及補(bǔ)體激活能力，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清IgG對(duì)凋亡細(xì)胞的反應(yīng)性比較

本研究分別檢測(cè)了健康志愿者、移植腎功能正?；颊摺MR患者血清IgG對(duì)凋亡細(xì)胞的反應(yīng)性，結(jié)果顯示(圖1)，分別與移植腎功能正常者及健康志愿者相比較，AMR患者血清IgG對(duì)凋亡細(xì)胞的反應(yīng)性顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0001，P=0.030)。

圖1 不同組別血清IgG對(duì)凋亡細(xì)胞的反應(yīng)性

2.2 血清IgG對(duì)補(bǔ)體激活能力的比較

在移植腎功能異常的病例中，可通過(guò)檢測(cè)移植物組織中C4d的沉積來(lái)揭示是否有補(bǔ)體途徑的參與。本研究中，我們利用體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腎移植患者及健康志愿者血清IgG與凋亡細(xì)胞反應(yīng)后能否激活補(bǔ)體途徑。如圖2所示，分別與移植腎功能正常者及健康志愿者相比較，AMR患者血清IgG與凋亡細(xì)胞反應(yīng)后，具有更強(qiáng)的補(bǔ)體激活能力，導(dǎo)致C4d沉積于靶細(xì)胞表面的強(qiáng)度顯著增加(P=0.0033，P=0.038)。

圖2 不同組別血清IgG激活補(bǔ)體途徑的能力

2.3 移植腎活檢組織中C4d與活化caspase-3的共區(qū)域化現(xiàn)象

AMR的典型病理特征是補(bǔ)體代謝產(chǎn)物C4d的沉積，而活化的caspase-3是細(xì)胞凋亡的證據(jù)。我們體外研究證實(shí)，AMR患者血清中純化的IgG抗體可以與凋亡細(xì)胞反應(yīng)并激活補(bǔ)體途徑。在移植腎組織中也觀察到了類似現(xiàn)象：對(duì)移植腎組織的熒光染色結(jié)果顯示，移植腎組織中C4d與活化的caspase-3的共區(qū)域化現(xiàn)象(圖3)，說(shuō)明細(xì)胞凋亡與補(bǔ)體途徑的激活可共存于發(fā)生AMR的移植腎組織中。

圖3 移植腎組織C4d及caspase-3熒光染色

3 討論

有學(xué)者研究報(bào)道[1]在AMR過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的一類抗體，既不是同種異體特異性也并非自身反應(yīng)性的，這類抗體可與廣泛的抗原諸如核酸及多態(tài)性HLA分子發(fā)生反應(yīng)，從而表現(xiàn)為多反應(yīng)性。盡管既往對(duì)多反應(yīng)性單克隆抗體的深度鑒定僅限于一個(gè)腎移植患者，但本研究將此發(fā)現(xiàn)擴(kuò)展至其他AMR的患者。結(jié)果顯示，相對(duì)于移植物功能正常的患者，AMR患者血清中多反應(yīng)性IgG的活性顯著升高。表明此類抗體作為免疫反應(yīng)的組成部分與AMR相關(guān)。然而多反應(yīng)性IgG的產(chǎn)生原因尚不明確。既往有報(bào)道[2]，自身抗體在細(xì)胞凋亡后可以與隱蔽抗原相結(jié)合，基于這個(gè)原因，我們不能排除部分多反應(yīng)性抗體是由于單克隆自身抗體的存在所致。

多反應(yīng)性抗體初始形式為IgM，其被認(rèn)為是免疫系統(tǒng)中自身反應(yīng)性的組成部分，也有研究發(fā)現(xiàn)類型轉(zhuǎn)換的多反應(yīng)性IgG[3,4]，但多與病理過(guò)程相關(guān)。例如在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中，多反應(yīng)性IgM通過(guò)類型轉(zhuǎn)換變成IgG后可能具有致病作用[5]。多反應(yīng)性IgM抗體如何轉(zhuǎn)換成致病性IgG尚不明確，但在多種環(huán)境下，自然抗體可因凋亡細(xì)胞的暴露而改變活性，AMR與移植腎多部位調(diào)亡細(xì)胞數(shù)量的增加密切相關(guān)，這個(gè)過(guò)程中凋亡細(xì)胞的爆發(fā)性增加可能觸發(fā)具有調(diào)亡細(xì)胞反應(yīng)性的B細(xì)胞的類型轉(zhuǎn)換，如果這個(gè)假設(shè)正確，多反應(yīng)性抗體可隨著移植物內(nèi)細(xì)胞凋亡的進(jìn)展而出現(xiàn)。

研究發(fā)現(xiàn)[1]，經(jīng)歷AMR的患者血液中出現(xiàn)高頻度的B細(xì)胞克隆，這個(gè)高頻度表明此B細(xì)胞克隆在體內(nèi)經(jīng)歷了擴(kuò)增，而這個(gè)過(guò)程與免疫球蛋白重鏈區(qū)的體細(xì)胞突變的累積以及相對(duì)應(yīng)永生化B細(xì)胞克隆表達(dá)CD27記憶性標(biāo)志是一致的。這個(gè)B細(xì)胞克隆也可與諸多自身抗原、HLA I類抗原以及凋亡細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)。我們認(rèn)為這個(gè)B細(xì)胞克隆并非特例，而是具有代表性的一個(gè)克隆。這類記憶性B細(xì)胞在生理?xiàng)l件下可分泌自然抗體IgM。移植物排異反應(yīng)過(guò)程中，在炎癥反應(yīng)的背景下，受到凋亡細(xì)胞刺激后，這些多反應(yīng)B細(xì)胞可擴(kuò)增，經(jīng)歷類型轉(zhuǎn)換重排后分泌IgG。類似凋亡細(xì)胞刺激導(dǎo)致的自然抗體和自身反應(yīng)性抗體的擴(kuò)增已在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)[6]。

C4d沉積是AMR的標(biāo)志。目前普遍接受的觀點(diǎn)是移植腎病理中發(fā)現(xiàn)的C4d沉積源于DSA與供體內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的HLA抗原相結(jié)合。我們的體外研究顯示，多反應(yīng)性的單克隆抗體及從AMR患者血清中純化的多反應(yīng)性IgG可以激活補(bǔ)體途徑，C4d沉積于靶細(xì)胞表面，我們也觀察到AMR患者移植腎組織中C4d與活化的caspase-3的共區(qū)域化現(xiàn)象，而這些移植腎組織中均可將檢測(cè)到凋亡細(xì)胞。綜合以上發(fā)現(xiàn)，說(shuō)明AMR患者中，除了DSA以外，血清中的多反應(yīng)性抗體也可導(dǎo)致C4d在移植物中的沉積。值得關(guān)注的是，Haidar等人[7]在腎移植患者中發(fā)現(xiàn)了紅細(xì)胞表面C4d沉積程度與ARM的相關(guān)性。既然紅細(xì)胞來(lái)源于器官移植受者，不會(huì)成為DSA的靶細(xì)胞，因此有理由假設(shè)多反應(yīng)性抗體很可能在此過(guò)程中發(fā)揮了作用。值得重視的是，C4d在紅細(xì)胞表面的沉積也被發(fā)現(xiàn)并作為系統(tǒng)性紅斑狼瘡進(jìn)展程度的標(biāo)志[8-10]。然而需要進(jìn)一步研究來(lái)明確這些具有補(bǔ)體激活能力的多反應(yīng)性抗體是否有細(xì)胞毒性，畢竟并非所有的C4d沉積都與移植物損傷有關(guān)[11]。

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