拓撲異構(gòu)酶2α受抑癌基因p53的調(diào)控并調(diào)節(jié)前列腺癌細胞的增殖能力

梁婷婷，王永坤，王 堯

(1.吉林大學第一醫(yī)院 腫瘤中心，吉林 長春130021；2.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院 a骨科；b泌尿外科)

拓撲異構(gòu)酶2α受抑癌基因p53的調(diào)控并調(diào)節(jié)前列腺癌細胞的增殖能力

梁婷婷1，王永坤2a，王 堯2b*

(1.吉林大學第一醫(yī)院 腫瘤中心，吉林 長春130021；2.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院 a骨科；b泌尿外科)

目的 觀察TOP2α對前列腺癌細胞增殖能力的影響以及抑癌基因p53對TOP2α的調(diào)控能力。方法 以Lipofectamine2000試劑轉(zhuǎn)染針對p53和非特異性對照組的siRNA，干擾前列腺癌細胞C4-2中p53 的表達，采用Real-time PCR和Western Blot檢測細胞內(nèi)TOP2α的mRNA和蛋白水平表達變化；采用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法在293T細胞中過表達p53后檢測TOP2α蛋白水平的變化，明確p53對TOP2α表達的影響；采用BrdU標記法計算并檢測干擾或過表達TOP2α表達后對前列腺癌細胞增殖能力的影響，明確TOP2α對前列腺癌細胞增殖的調(diào)節(jié)能力。結(jié)果 干擾p53表達后細胞內(nèi)TOP2α mRNA的表達明顯升高，說明p53可以調(diào)節(jié)TOP2α的轉(zhuǎn)錄水平，進一步檢測干擾p53表達后，TOP2α的蛋白水平表達明顯升高；在細胞內(nèi)，過表達p53后檢測TOP2α的蛋白表達水平明顯下降；在C4-2細胞中干擾目標基因TOP2α的表達后，增殖細胞的百分比從(21.54±1.443)%下降至(13.78±0.4736)%(P<0.05)。同時，在C4-2細胞中過表達TOP2α后，增殖細胞的百分比從(20.84±2.082%)上升至(33.36±3.244)% (P<0.05)。結(jié)論 在前列腺癌細胞中，p53可以在mRNA和蛋白水平調(diào)節(jié)TOP2α的表達，TOP2α具有調(diào)節(jié)前列腺癌細胞增殖的能力。

腫瘤；前列腺癌；p53；TOP2α

(ChinJLabDiagn,2017,21:1261)

DNA拓撲異構(gòu)酶2α(TOP2α)在細胞DNA復制和轉(zhuǎn)錄過程中維持染色體的空間結(jié)構(gòu)具有重要的作用。研究表明，TOP2α可能參與調(diào)控了癌癥細胞的凋亡和增殖，其與肺非小細胞肺癌的腦轉(zhuǎn)移可能呈相關(guān)性，TOP2α的表達升高可以預測乳腺癌患者對于表阿霉素為主化療方案的反應(yīng)性等[1]。TOP2α可能在前列腺癌的發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用，高表達TOP2α的前列腺癌細胞表現(xiàn)出更強的侵襲性和增殖能力[2]，但其在前列腺癌細胞內(nèi)的具體作用機制尚不清楚。

p53是一個重要的抑癌基因，其在調(diào)控細胞的增殖、凋亡、DNA損傷修復等方面發(fā)揮了重要的作用[3]。超過70%的晚期前列腺癌患者的組織標本中出現(xiàn)p53基因的表達缺失[4]。p53是一個重要的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控大量下游基因的表達進而發(fā)揮生物學作用，其在前列腺癌細胞中調(diào)控的重要效應(yīng)因子是目前的研究熱點之一。本研究旨在檢測前列腺癌細胞中p53的表達和TOP2α表達的關(guān)系，以及TOP2α在前列腺癌細胞中的生物學作用。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

前列腺癌細胞系C4-2用含有10%牛胎血清、100 U/ml青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，293T細胞用含有上述抗生素的DEME培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 RNA干擾目標基因的表達

C4-2細胞在六孔板中均勻鋪板，24h后按照Lipofectamine2000試劑(購自美國Invitrogen公司)說明書進行干擾實驗，對照組(siCont)和實驗組siRNA劑量均為100pmol。對照組和TOP2α的siRNA購自Santa Cruz公司(sc-36695)，p53 siRNA購自IDT公司，序列為:5-AGUGUUUCUGUCAUCCAAAUACUCCAC。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染實驗

293T細胞鋪板生長24 h后，按照PolyJet轉(zhuǎn)染試劑(購自SignaGen公司)說明書轉(zhuǎn)染目標質(zhì)粒48 h，收集細胞并進行后續(xù)試驗。

1.4 Western blot實驗

收集細胞后進行裂解并檢測蛋白濃度，制備成1 mg/L的蛋白樣品。取適量樣品加入聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳分離，轉(zhuǎn)膜后，5%脫脂牛奶封閉30 mins，4℃一抗孵育過夜，PBST沖洗10 min×3次，室溫下二抗孵育2 h，PBST沖洗10 min×3次，加入化學發(fā)光試劑(ECL)發(fā)光液后，暗室顯影并洗片保存。 P53抗體購自Santa Cruz公司(sc-6243),TOP2α抗體購自Santa Cruz公司(sc165986)。

1.5 BrdU標記法檢測細胞增殖能力

C4-2細胞鋪板于24孔板，RNA干擾實驗干擾目標基因表達后48 h。加入10 μmol/L BrdU孵育2 h，-20℃下Carnoy’s固定液固定20 min，加入2 mol/L HCl和0.1 mol/L Boric酸性液后，3%過氧化氫處理10 min，10%山羊血清封閉1 h，4℃ BrdU一抗(購自Sigma公司，B2531)孵育過夜，37℃ 二抗(購自Life Technologies公司，A10521)孵育1 h。SYTOX Green(購自Life Technologies公司， S7020)染色20min。熒光顯微鏡下觀察并計數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1p53調(diào)控了TOP2α在前列腺癌細胞中轉(zhuǎn)錄水平的表達

在前列腺細胞C4-2中干擾p53的表達后，利用Real-timePCR技術(shù)檢測TOP2α的表達變化，可見TOP2α的表達明顯升高(P<0.05)。說明p53可以抑制TOP2α在轉(zhuǎn)錄水平的表達。

2.2p53調(diào)控了TOP2α在前列腺癌細胞中蛋白水平的表達

在前列腺細胞C4-2中干擾p53的表達后，利用WesternBlot檢測TOP2α在蛋白水平的表達變化，可見TOP2α的表達明顯升高。說明p53可以抑制TOP2α在蛋白水平的表達，見圖1。

2.3 在293T細胞中過表達p53可以抑制TOP2α的蛋白表達

在293T細胞中，轉(zhuǎn)入2.0μgGFP-p53后，利用WesternBlot檢測TOP2α在細胞中的表達變化，發(fā)現(xiàn)TOP2α的表達明顯受到抑制。說明p53的過表達可以抑制細胞中TOP2α的表達。本實驗中同時轉(zhuǎn)入0.5μgmyc-空載體作為表達對照。

2.4TOP2α調(diào)控了前列腺癌細胞C4-2的增殖能力

在C4-2細胞中干擾目標基因TOP2α的表達后，檢測到增殖細胞的百分比從(21.54±1.443)%下降至(13.78±0.4736)%(P<0.05)。同時，在C4-2細胞中過表達GFP-TOP2α的表達后，檢測到增殖細胞的百分比從(20.84±2.082%)上升至(33.36±3.244)% (P<0.05)。說明，TOP2α具有調(diào)控前列腺癌細胞增殖能力的功能，見圖2。

3 討論

前列腺癌嚴重威脅男性的生殖健康[5]。隨著普查力度的提高，在我國前列腺癌發(fā)病率的提升引人矚目。前列腺癌發(fā)病隱匿，常常無癥狀，在沒有大范圍普查的情況下，我國超過60%患者診斷為前列腺癌時已經(jīng)進入癌癥的中晚期，治療手段少并且常伴隨癌癥的轉(zhuǎn)移[6]。盡管近些年來，對于前列腺癌的系統(tǒng)治療進展迅速，放療、化療包括手術(shù)治療等方式一定程度緩解了患者疾病的進展程度，但總體治療效果依然有限[7]。

TOP2α在很多生物學過程中發(fā)揮重要的作用，例如DNA的復制、轉(zhuǎn)錄、修復和染色體的結(jié)構(gòu)維持與重建[8]。體外實驗顯示在細胞復制過程中TOP2α常高表達，可以作為增殖性標志物之一[9]。

A：在前列腺癌細胞C4-2中干擾p53的表達后，TOP2α的mRNA水平表達明顯上調(diào)(與對照組比較，*，P<0.05)； B：在前列腺癌細胞C4-2中干擾p53的表達后，TOP2α在蛋白水平的表達明顯上調(diào)；C：在293T細胞中，通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染過表達p53后，TOP2α的表達明顯降低；

圖1 在前列腺癌細胞中，p53在mRNA和蛋白水平調(diào)節(jié)了TOP2α的表達

A：在前列腺癌細胞C4-2中，過表達TOP2α后，檢測到細胞的增殖能力明顯升高(與對照組比較，*,P<0.05) B:干擾目標基因TOP2α的表達后，檢測到細胞的增殖能力明顯降低(與對照組比較，*,P<0.05)

圖2 TOP2α調(diào)節(jié)前列腺癌細胞的增殖能力

TOP2α表達的異常經(jīng)常和染色體結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定相關(guān)[8]。有報道認為TOP2α的高表達可能和細胞的侵襲性相關(guān)并發(fā)現(xiàn)其在多種惡性腫瘤中表達增高，包括前列腺癌，TOP2α的表達水平和前列腺癌的Gleason評分呈正相關(guān)[10]。

p53是一個重要的抑癌基因和轉(zhuǎn)錄因子，在多種腫瘤內(nèi)出現(xiàn)功能缺失[11]，超過70%的晚期前列腺癌出現(xiàn)p53 的功能缺失，但其發(fā)揮的重要作用尚不清楚。作為轉(zhuǎn)錄因子，p53可以調(diào)控多種基因的表達。前期研究發(fā)現(xiàn)，p53的缺失可以誘導前列腺內(nèi)PIN的發(fā)生(一種癌前病變)，以上研究結(jié)果說明p53可能調(diào)控了前列腺癌細胞的增殖能力并促進了前列腺癌的發(fā)生與發(fā)展。本研究結(jié)果顯示p53可以在mRNA和蛋白水平調(diào)控TOP2α在前列腺癌細胞中的表達，說明TOP2α可能是p53所調(diào)控的下游蛋白之一。

本研究結(jié)果表明，在前列腺癌細胞C4-2中干擾p53的表達，TOP2α在mRNA和蛋白水平表達會明顯升高，過表達p53后細胞內(nèi)的TOP2α蛋白表達會明顯減弱，TOP2α是p53所調(diào)控的下游基因之一。同時，干擾TOP2α的表達后增殖的前列腺癌細胞明顯減少，而過表達TOP2α后增殖細胞的數(shù)量明顯增強，說明，TOP2α在前列腺癌細胞中可以調(diào)控細胞的增殖能力。本研究結(jié)果表明，p53可能通過調(diào)節(jié)目標基因TOP2α在前列腺癌細胞中的表達調(diào)控了細胞的增殖。

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TOP2α，a novel p53 target gene,regulates proliferation of prostate cancer cells

LIANGTing-ting，WANGYong-kun,WANGYao.

(CancerCenter,TheFirstClinicalHospitalofJilinUniversity,Changchun130021,China)

Objective To investigate whether Topoisomerase (DNA) II alpha (TOP2α) promote prostate cancer cells proliferation and regulated by p53.Methods After inhibiting expression of p53 by interfering RNA (RNAi) in C4-2 cells using Lipofectamine2000,the mRNA and protein expression level were assessed by Real-time PCR and Western Blot.After transfecting GFP-p53 in 293T cells by according to the manufacturer’s instruction,the expression level of TOP2α was assessed by Western Blot.After knockdown TOP2α by RNAi in C4-2 cells,proliferation was tested by Bromodeoxyuridine incorporation assay (BrdU).Then,the BrdU assay was repeated after transfecting GFP-TOP2α.Results The mRNA and protein level were significant increased after transfection of siRNA against p53.Moreover,proliferation was further decreased from (21.54±1.443)% to(13.78±0.4736)% (P<0.05).At the meantime,after transfectiong GFP-TOP2α,proliferation was further increased from (20.84±2.082%)to(33.36±3.244)% (P<0.05).Conclusion Our findings suggest that p53 regulates the mRNA and protein level of TOP2α,and TOP2α could regulates proliferation ability of C4-2 cells.

Cancer；Prostate Cancer；p53；TOP2α

國家自然科學基金(81241027)

1007-4287(2017)07-1261-04

R737.25

A

2017-03-26)

*通訊作者