miR-203及其下游靶基因p63和survivin在瘢痕疙瘩皮損中的表達(dá)

莊 樂 馬偉元

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·論著·

miR-203及其下游靶基因p63和survivin在瘢痕疙瘩皮損中的表達(dá)

莊 樂 馬偉元

目的： 檢測瘢痕疙瘩皮損中miR-203及其下游靶基因p63和survivin mRNA的表達(dá)。方法： Real-time PCR法檢測30例瘢痕疙瘩皮損及30例健康對(duì)照皮膚中miR-203、p63和survivin mRNA的表達(dá)。結(jié)果： 與健康對(duì)照皮膚相比，瘢痕疙瘩皮損中miR-203表達(dá)明顯下調(diào)，其表達(dá)量為對(duì)照組的0.32±0.16倍(P<0.05)，靶基因p63和survivin mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，其表達(dá)量分別為對(duì)照組的3.90±0.84倍和5.11±0.93倍(均P<0.05)。經(jīng)Pearson相關(guān)性分析，miR-203與survivin間呈負(fù)相關(guān)(r=-0.40，P<0.05)，miR-203與p63間呈負(fù)相關(guān)(r=-0.51,P<0.05)。結(jié)論： miR-203及其下游靶基因p63和survivin可能參與了瘢痕疙瘩的發(fā)病過程。

miR-203； p63； survivin； 瘢痕疙瘩

瘢痕疙瘩是人類皮膚受損、創(chuàng)面愈合后局部組織過度纖維化的結(jié)果，成纖維細(xì)胞的大量增生和膠原的過度沉積是瘢痕疙瘩的組織病理學(xué)改變[1]。以往的研究證實(shí)，p63和凋亡抑制基因(survivin)在瘢痕疙瘩皮損中高表達(dá)[2,3]，且參與成纖維細(xì)胞異常增殖和膠原蛋白分泌等病理過程，但其具體的調(diào)控機(jī)制不清?；虮磉_(dá)受到多個(gè)層面和多條途徑的調(diào)控，目前microRNA調(diào)控基因表達(dá)和表觀遺傳學(xué)研究成為了熱點(diǎn)問題。其中miR-203參與皮膚發(fā)育、穩(wěn)態(tài)及功能維持，是皮膚中重要的調(diào)控因子[4]。目前研究證實(shí)，miR-203為survivin和p63上游重要的調(diào)控基因[5,6]。本研究擬通過real-time PCR技術(shù)檢測瘢痕疙瘩皮損中miR-203、survivin和p63 mRNA的表達(dá)情況，統(tǒng)計(jì)分析其表達(dá)水平的相關(guān)性，從mircoRNA角度解釋瘢痕疙瘩皮損中p63和survivin基因表達(dá)上調(diào)的原因。

1 材料和方法

1.1 臨床資料 收集2013年1月至2014年7月，我科病理室保存的瘢痕疙瘩患者蠟塊標(biāo)本30例。其中男性15例，女性15例，年齡19～46歲，平均37.6歲。 另選取30例健康皮膚為對(duì)照組，兩組在年齡、性別、取材部位上相匹配。本研究獲醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 材料與試劑 石蠟組織總RNA提取試劑盒、石蠟組織microRNA提取試劑盒購于北京百泰克生物技術(shù)公司，一步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green I實(shí)時(shí)定量PCR kit購于瑞士羅氏公司，DEPC及RNase free水購于北京索萊寶生物技術(shù)公司，氯仿、異丙醇、無水乙醇等均為分析純，購于國藥集團(tuán)上海試劑公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 總RNA和microRNA的提取 將蠟塊標(biāo)本整修去除組織周圍盡量多的石蠟，10 μM厚連續(xù)切片，取4張切片裝入一個(gè)無RNase的Ep管中，二甲苯脫蠟，無水乙醇徹底洗滌并晾干,后續(xù)提取步驟嚴(yán)格按照microRNA和總RNA提取試劑盒的說明書進(jìn)行。微量紫外分光光度計(jì)測定總RNA的純度和濃度。

1.3.2 Real-time PCR檢測miR-203、survivin及p63的表達(dá) MA Weiyuan采用一步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，microRNA的反轉(zhuǎn)錄采用加尾法。SYBR green I染料法進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)，miR-203以U6作為內(nèi)參照，引物購自廣州復(fù)能基因有限公司，survivin和p63以GAPDH作為內(nèi)參照。survivin、p63及GAPDH引物均由 Primer Premier 6.0 軟件設(shè)計(jì)，BLAST驗(yàn)證引物特異性，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，具體引物序列為：survivin上游5ˊ-GACCACCGCATCTCTACATTC-3ˊ，下游5ˊ-TGCTTTTTATGTTCCTCTATGGG-3ˊ，p63上游5ˊ-GAAACCAGAGATGGGCAAGTC-3ˊ下游5ˊ-GCTTCGTACCATCACCGTTCT-3ˊ，GAPDH上游5ˊ-ACAGTCAGCCGCATCTTCTT-3ˊ，下游5ˊ-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3ˊ。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)熱3 min；95℃12 s，60℃ 40 s，40個(gè)循環(huán)。△Ct值=目的基因的Ct值-同組內(nèi)參的Ct值，△△Ct=△Ct實(shí)驗(yàn)組-△Ct對(duì)照組，2-△△Ct值即為實(shí)驗(yàn)組目的基因較對(duì)照組目的基因表達(dá)的倍數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 miR-203、survivin、p63在瘢痕疙瘩皮損中的表達(dá) 采用real-time PCR技術(shù)檢測30例瘢痕疙瘩皮損與30例健康對(duì)照皮膚組織中miR-203、survivin、p63的表達(dá)水平。通過熒光定量 PCR 擴(kuò)增曲線，產(chǎn)物到達(dá)平臺(tái)期，對(duì)融解曲線分析，可以看到單一的峰型，說明擴(kuò)增產(chǎn)物有較高的特異性。PCR 產(chǎn)物采用比較Ct法定量，根據(jù) 2- △△Ct值計(jì)算基因的起始模板量，從而反映出在不同樣本的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，瘢痕疙瘩皮損中miR-203的表達(dá)較健康對(duì)照皮膚明顯下調(diào)，其表達(dá)量為對(duì)照組的0.32±0.16倍(t=22.73，P<0.05)，survivin和p63在瘢痕疙瘩皮損中的表達(dá)較健康對(duì)照皮膚明顯上調(diào)，其表達(dá)量分別為對(duì)照組的5.11±0.93倍(t=24.87，P<0.05)，3.90±0.84倍(t=17.11，P<0.05)。結(jié)果如圖1～3所示。

圖1 Real-time PCR法檢測瘢痕疙瘩皮損與健康對(duì)照組皮膚組織中miR-203 mRNA的相對(duì)表達(dá)量，瘢痕疙瘩皮損中miR-203的表達(dá)顯著下調(diào)(*P<0.05) 圖2 Real-time PCR法檢測瘢痕疙瘩皮損與健康對(duì)照組皮膚組織中survivin mRNA的相對(duì)表達(dá)量，瘢痕疙瘩皮損中survivin的表達(dá)顯著上調(diào)(*P<0.05) 圖3 Real-time PCR法檢測瘢痕疙瘩皮損與健康對(duì)照組皮膚組織中p63 mRNA的相對(duì)表達(dá)量，瘢痕疙瘩皮損中p63的表達(dá)顯著上調(diào)(*P<0.05)

2.2 瘢痕疙瘩皮損中miR-203與sruvivin、p63表達(dá)的相關(guān)性經(jīng)Pearson相關(guān)性分析，miR-203與survivin兩者之間呈負(fù)相關(guān)(r=-0.40，P<0.05)，miR-203與p63兩者之間呈負(fù)相關(guān)(r=-0.51,P<0.05)。

3 討論

成纖維細(xì)胞在瘢痕疙瘩的形成、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸過程中處于中心地位，而成纖維細(xì)胞中膠原蛋白合成異常導(dǎo)致的細(xì)胞外基質(zhì)代謝異常是瘢痕疙瘩發(fā)病的重要因素[7，8]。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞與正常真皮成纖維細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上并沒有明顯差異，但在功能上卻明顯不同。與正常成纖維細(xì)胞相比，瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞合成膠原蛋白的能力明顯提高[9]。成纖維細(xì)胞增殖、凋亡及分化的異常，是多個(gè)層面、多條途徑、多種方式調(diào)控異常導(dǎo)致的病理表現(xiàn)。目前研究普遍認(rèn)為，瘢痕疙瘩中存在過度表達(dá)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)，過度表達(dá)的TGF-β通過各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路最終導(dǎo)致了膠原蛋白的過度合成和分泌。除合成過度外，瘢痕疙瘩組織中還存在膠原蛋白降解的異常，最終致使膠原蛋白合成大于分解，過度的膠原蛋白沉積引發(fā)了瘢痕疙瘩皮損的形成[9]。miR-203是一種具有高度皮膚特異性的microRNA，在皮膚發(fā)育中起著調(diào)控細(xì)胞增殖和分化的開關(guān)作用[4]。miR-203 在增殖細(xì)胞中高表達(dá)，能夠抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)并促進(jìn)細(xì)胞分化[10]。本研究結(jié)果證實(shí)，瘢痕疙瘩皮損中miR-203表達(dá)水平較健康對(duì)照皮膚明顯下調(diào)。由此推測，低表達(dá)的miR-203可能參與瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞異常增殖和膠原蛋白過度分泌的病理過程。

目前生物信息學(xué)研究證明，survivin和p63都是miR-203進(jìn)化保守的靶基因之一。survivin主要在細(xì)胞周期G2/M期表達(dá),定位于細(xì)胞有絲分裂的紡錘體,具有促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂的作用。此外，survivin還可以直接抑制Caspase-3和Caspase-7蛋白的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡[11]。本研究發(fā)現(xiàn)瘢痕疙瘩皮損中survivin mRNA的表達(dá)水平較健康對(duì)照皮膚組織明顯上調(diào)，這與國內(nèi)外的研究結(jié)果均一致[2]。survivin作為凋亡抑制蛋白(IAP)家族的重要成員[12]，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的凋亡抑制因子之一，和瘢痕疙瘩的形成有密切關(guān)系。survivin的高表達(dá)與瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的異常增殖和分化有關(guān)，同時(shí)也參與瘢痕組織中毛細(xì)血管的新生過程[13]。p63基因是腫瘤抑制基因p53家族成員之一，其在細(xì)胞死亡、分化、腫瘤發(fā)生中扮演重要角色[14]，控制著成纖維細(xì)胞的增殖和分化。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，p63 mRNA在瘢痕疙瘩皮損中表達(dá)上調(diào)，這與國外的研究結(jié)果一致[3]。高表達(dá)的p63基因能夠通過特異性的結(jié)合到啟動(dòng)子區(qū)域，阻斷腫瘤抑制基因p53的功能[15，16]，從而在瘢痕疙瘩中發(fā)揮重要作用。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，miR-203 mRNA的表達(dá)水平與survivin mRNA的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，與p63 mRNA的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。由此推測，miR-203的異常表達(dá)可能導(dǎo)致survivin和p63基因表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖、抑制其凋亡，參與了皮損的形成過程。

綜上所述，miR-203可能通過調(diào)控其下游靶基因survivin、p63的異常表達(dá)參與瘢痕疙瘩皮損的形成過程。

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(收稿：2017-01-10 修回：2017-02-22)

Expression of miR-203 and its downstream targets p63 and survivin in the keloid lesions

ZHUANGLe,MAWeiyuan.

Departmentofdermatology,QiluHospitalofShandongUniversity,Jinan250012,China.

Correspondingauthor:MAWeiyuan,E-mail:dermatologyqlh@163.com

Objective: To detect the RNA expression levels of miR-203 and its downstream targets p63 and survivin in the lesions of keloid. Methods: The RNA levels of miR-203 and its downstream targets p63 and survivin from 30 lesions and 30 normal controls were detected by the quantitative real-time PCR technique. Results: The expression level of miR-203 in the lesions of keloid was dramatically down-regulated which was 0.32±0.16 of the normal controls (P<0.05). While the expression levels of p63 and survivin in the lesions of keloid were sharply up-regulated which were 3.90±0.84 times and 5.11±0.93 times than those in the normal controls respectively (P<0.05). Conclusion: miR-203 and its downstream targets p63 and survivin are probably involved in the pathogenesis of keloid.

miR-203; p63; survivin; keloid

山東省自然科學(xué)基金資助(編號(hào)：ZR2014MP007)

山東大學(xué)齊魯醫(yī)院皮膚科，濟(jì)南，250012

馬偉元，E-mail：dermatologyqlh@163.com