CD163+腫瘤相關(guān)巨噬細胞在常見上皮性皮膚腫瘤中的分布

周文明 張 偉 申小平 劉 志 李世軍 陸洪光

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·論著·

CD163+腫瘤相關(guān)巨噬細胞在常見上皮性皮膚腫瘤中的分布

周文明1，2張 偉1申小平1劉 志1李世軍1陸洪光1

目的： 檢測CD163+腫瘤相關(guān)巨噬細胞在皮膚鱗狀細胞癌、基底細胞癌、鮑溫病、日光性角化病中的分布。方法： 采用免疫組織化學法(MaxVision法)檢測CD163標記的腫瘤相關(guān)巨噬細胞在正常皮膚、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、鮑溫病、日光性角化病中的分布。結(jié)果： 每高倍鏡視野下正常皮膚、鮑溫病、日光性角化病真皮淺層中CD163+巨噬細胞個數(shù)為(9.5000±1.71594)、(43.9200±9.98716)和(49.4000±8.73830)個;基底細胞癌腫瘤間質(zhì)中為(42.1724 1±11.73234)，鱗狀細胞癌的腫瘤間質(zhì)中及腫瘤實質(zhì)內(nèi)為(65.8421±14.05649)。結(jié)論： CD163+腫瘤相關(guān)巨噬細胞可能與皮膚上皮性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。

腫瘤相關(guān)巨噬細胞； 皮膚鱗狀細胞癌； 基底細胞癌； 鮑溫?。?日光性角化??； CD163

鱗狀細胞癌、基底細胞癌、鮑溫病、日光性角化病是皮膚常見的腫瘤，隨著人類壽命的延長及生活方式的改變，環(huán)境污染的加重，上述腫瘤發(fā)病率有增加的趨勢，目前一些研究表明這些腫瘤的發(fā)生與紫外線、長期慢性刺激等原因引起的細胞自身DNA突變有關(guān)。Scott等研究表明腫瘤的發(fā)生除基因突變因素外，還與由大量淋巴細胞、血管、淋巴管、纖維細胞、巨噬細胞、細胞外基質(zhì)等在腫瘤細胞周圍組成的腫瘤微環(huán)境相關(guān)[1]。其中存在于腫瘤實體及其周圍組織中的巨噬細胞稱為腫瘤相關(guān)巨噬細胞(tumor associated macrophages, TAM)，主要是M2型巨噬細胞，常伴隨實體腫瘤存在于腫瘤細胞周圍及其間質(zhì)組織中。CDl63是編碼在12p13.3上的跨膜蛋白，并僅限于單核細胞和巨噬細胞譜系，以往研究認為是M2型腫瘤相關(guān)巨噬細胞特異性較高的一個標志物[2,3],能促進腫瘤的進展。因此，我們試圖通過免疫組化標記觀察CD163+腫瘤相關(guān)巨噬細胞在皮膚常見上皮性腫瘤中的分布情況，并比較不同皮膚腫瘤間分布的差異性，探討CD163+腫瘤相關(guān)巨噬細胞在皮膚上皮性腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中作用及意義。

1 資料與方法

1.1 資料收集 本研究收集貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院皮膚科2008-2016年經(jīng)組織病理學證實的皮膚上皮性腫瘤病變的活檢存檔蠟塊，鱗狀細胞癌19例,男9例、女10例，曝光部位15例、非曝光部位4例，最大年齡88歲、最小年齡17歲，平均71.35歲；鮑溫病25例，男15例、女10例，最大年齡84歲、最小年齡50歲，平均66.77歲，均位于非曝光部位；日光性角化病20例，男6例，女14例，最小年齡25歲(繼發(fā)于著色性干皮病)，最大年齡87歲，平均71.38歲；基底細胞癌29例，男12例、女17例，曝光部位27例、非曝光部位2例，最大年齡82歲、最小年齡33歲，平均61.89歲；10例正常皮膚來源于整形外科整形術(shù)后遺棄的皮膚，所有標本經(jīng)10%的中性福爾馬林溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，所有HE切片均由兩位病理醫(yī)生閱片。

1.2 主要試劑 即用型鼠抗人單克隆抗體CD163、即用型快速免疫MaxVisionTM檢測試劑盒及DAB顯色劑均購自福州邁新生物技術(shù)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 常規(guī)石蠟包埋，4 μm切片,防脫多聚賴氨酸玻片撈片，60℃烘考2 h，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 免疫組織化學(MaxVision)陽性對照由福州邁新生物技術(shù)有限公司提供，陰性對照用PBS代替一抗。石蠟切片脫蠟，水化，檸檬酸高壓修復抗原，按試劑盒說明書進行操作，DAB顯色，蘇木素復染，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡觀察。

1.4 結(jié)果判定 CD163定位于的胞膜或胞質(zhì)，陽性表現(xiàn)為細胞質(zhì)或細胞膜棕黃色顆粒沉積，CD163陽性細胞即M2型TAM，首先低倍鏡(×100)觀察切片TAM密集區(qū)域，然后隨機選取5個高倍鏡視野(×400)，計數(shù)陽性細胞的數(shù)量，取平均值，相隔15天后再次用上述方法計數(shù)陽性細胞數(shù)量，兩次結(jié)果的平均值納入最后統(tǒng)計。

2 結(jié)果

2.1 每高倍鏡視野下(×400)，正常皮膚真皮淺層中僅見少量CD163+TAM，數(shù)量為(9.5000±1.71594)個；鮑溫病、日光性角化病的真皮淺層見大量的CD163+TAM，數(shù)量分別為(43.9200±9.98716)個、(49.4000±8.73830)個;基底細胞癌的腫瘤間質(zhì)中見大量的CD163+TAM浸潤，數(shù)量為(42.1724±11.73234)個、鱗狀細胞癌的腫瘤間質(zhì)中及腫瘤實質(zhì)內(nèi)見大量的CD163+TAM浸潤，數(shù)量為(65.8421±14.05649)個(圖1)。

2.2 在鱗狀細胞癌的腫瘤實質(zhì)中易見CD163+TAM，在鮑溫病、日光性角化病、基底細胞癌的腫瘤實質(zhì)中幾乎未見CD163+TAM(圖1)。

2.3 CD163+TAM在皮膚腫瘤組織中均有較多浸潤，與正常皮膚相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；鮑溫病、日光性角化病、基底細胞癌中CD163+TAM的分布差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；鮑溫病、日光性角化、基底細胞癌與皮膚鱗狀細胞癌中的CD163+TAM比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表1)。

表1 正常對照組及皮膚上皮性腫瘤組織中CD163+TAM兩兩比較

注：正常對照組 (N);鮑溫病(BD);日光性角化病(AK);基底細胞癌(BCC);鱗狀細胞癌(SCC)

3 討論

腫瘤相關(guān)巨噬細胞來源于骨髓中的造血祖細胞，進入血液循環(huán)后變成單核細胞，進而遷移至腫瘤組織中分化而成。TAM具有高度的異質(zhì)性和可塑性，在不同的微環(huán)境中可活化形成不同的表型，巨噬細胞根據(jù)環(huán)境不同大致可極化為經(jīng)典活化型巨噬細胞(M1型)及替代活化型巨噬細胞(M2型),M1型巨噬細胞主要由腫瘤壞死因子TNF-α，干擾素IFN-γ 所誘導分化，具有很強的呈提抗原能力， 通過分泌產(chǎn)生白細胞介素 IL-12，IL-23等其他活性氧化物， 從而能夠殺滅微生物和發(fā)揮抗腫瘤作用。M2型巨噬細胞是由IL-4、IL-10、IL-13、CSF-1 誘導分化，促進腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移[4]。Schmieder等[3]研究指出，在腫瘤發(fā)病的開始階段招募到腫瘤部位的單核細胞接受促炎癥信號分化成M1型巨噬細胞，隨后M1型巨噬細胞向M2型巨噬細胞即TAM轉(zhuǎn)化，促進腫瘤的進一步發(fā)展。由于巨噬細胞膜表面趨化因子受體存在差異性表達，腫瘤組織能夠通過分泌趨化因子選擇性的募集M2型極化的TAM，從而使之參與免疫抑制性腫瘤微環(huán)境的形成[5]。Van Overmeire等[6]研究認為，組織氧含量低，TAM表達上調(diào)，而侵襲性強的腫瘤細胞生長迅速，腫瘤組織內(nèi)及其周圍形成低氧環(huán)境，利于TAM的聚集。大量研究表明腫瘤組織中M2型腫瘤相關(guān)巨噬細胞浸潤明顯增多，M2型巨噬細胞通過分泌組織基質(zhì)金屬蛋白酶促進基質(zhì)重塑，破壞基底膜，通過分泌釋放促血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor VEGF)、轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor B，TGF-β)促進血管、淋巴管的生成和參與機體的免疫抑制反應，以適應及促進腫瘤細胞的生長，并為腫瘤細胞遷移、浸潤和轉(zhuǎn)移開辟了道路,發(fā)揮促癌作用[7-10]。此外有報道，在肺癌、乳腺癌、甲狀腺癌、前列腺癌、黑素瘤、淋巴瘤等腫瘤中TAM高表達，患者往往生存率低，死亡率高、預后差[11-14，3，8],但在結(jié)腸癌腫瘤中 TAM高表達，患者生存率高，預后好[15]。Lundholm等研究認為腫瘤相關(guān)巨噬細胞在前列腺癌與結(jié)腸癌中浸潤增加表現(xiàn)出兩種截然不同的預后，這主要是因為在結(jié)腸癌中有大量的Th1細胞及細胞毒性T細胞，而前列腺癌中主要是未活化的初始T細胞[14]。殷芳等分別用M1、M2型巨噬細胞與黑素細胞株A375培養(yǎng)，M2型巨噬細胞促進A375細胞的增殖、侵襲和遷移，M1型巨噬細胞抑制A375細胞的增殖、侵襲和遷移[15]，表明M2型巨噬細胞是腫瘤惡性生物學行為的“助推器”。

①正常對照組真皮淺層；②鮑溫病真皮淺層；③日光性角化真皮淺層；④基底細胞癌腫瘤間質(zhì)；⑤鱗狀細胞癌腫瘤間質(zhì)；⑥鱗狀細胞癌腫瘤實質(zhì)

圖1 CD163+TAM在不同皮膚組織中的分布(IHC,×400)

國內(nèi)鮮有報道皮膚常見上皮性腫瘤與TAM的關(guān)系的研究，大部分腫瘤的發(fā)生、發(fā)展需經(jīng)過癌前病變、原位癌、最后發(fā)展為浸潤癌，是一個多因素、多階段、逐漸的演變過程，日光性角化病、鮑溫病、鱗狀細胞癌屬于鱗狀上皮來源的不同發(fā)展階段腫瘤，且我們已知鱗狀細胞癌比基底細胞癌具有更加惡性的生物學行為，對于我們研究CD163+TAM在皮膚常見上皮性腫瘤中的發(fā)生發(fā)展中的作用更為有利。我們的研究表明，鮑溫病、日光性角化病的真皮淺層及基底細胞癌、鱗狀細胞癌的腫瘤間質(zhì)中見大量的CD163+TAM浸潤，提示在腫瘤細胞分泌的細胞因子及高代謝情況下造成腫瘤組織周圍缺氧等因素促進了CD163+TAM募集；在鱗狀細胞癌的腫瘤實質(zhì)中易見CD163+TAM，在鮑溫病、日光性角化病、基底細胞癌的腫瘤實質(zhì)中幾乎未見CD163+TAM，提示可能為基底膜及在HE染色下基底細胞癌腫瘤實質(zhì)周圍的收縮間隙作為一個屏障阻止CD163+TAM的滲入，同時也阻止了腫瘤細胞進入周圍間質(zhì)，使得腫瘤細胞無法通過間質(zhì)血管及淋巴管實現(xiàn)遠處器官轉(zhuǎn)移，這可能是基底細胞癌罕見遠處轉(zhuǎn)移的原因之一，同時提示皮膚上皮性腫瘤中瘤巢實質(zhì)內(nèi)存在CD163+TAM與腫瘤的惡性潛能相關(guān)可能。鮑溫病、日光性角化病、基底細胞癌中的CD163+TAM分布差異無統(tǒng)計學意義，與其三種腫瘤均為局部病變相一致，而其三種局部病變中CD163+TAM的密度與鱗狀細胞癌相比均明顯低于鱗狀細胞癌，差異有統(tǒng)計學意義，表明在皮膚上皮性常見腫瘤中CD163+TAM的密度隨著腫瘤生物學行為惡性潛能的增加上調(diào)。我們推測，一方面，腫瘤細胞分泌的細胞因子及迅速生長造成的低氧環(huán)境促進了巨噬細胞向CD163+TAM分化及募集在腫瘤周圍，另一方面，CD163+TAM細胞分泌的細胞因子促進新血管和淋巴管生成，破壞基底膜，腫瘤周圍組織重塑，以適應及促進腫瘤細胞的生長，并為腫瘤細胞遷移、浸潤和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件，腫瘤細胞與CD163+TAM兩者相輔相成，形成一種共生的環(huán)境。Kakizaki等[16]在皮膚原發(fā)性CD30+淋巴細胞增殖性病變中淋巴瘤樣丘疹病與皮膚原發(fā)性CD30+大細胞間變性淋巴瘤中CD163+TAM的構(gòu)成比較研究與我們的研究相一致，表明隨著腫瘤的進展，CD163+TAM逐漸增多。

巨噬細胞在不同的細胞因子作用下實現(xiàn)M1型向M2型或M2型向M1型巨噬細胞的轉(zhuǎn)化，從而對腫瘤因子作用起促進或抑制的不同作用。

而Pettersen等[17]研究皮膚鱗癌患者癌組織時發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞發(fā)生多種極化， 其中有M1型、M2型，還存在一類同時表達M1和M2型的亞型。我們的數(shù)據(jù)表明鱗狀細胞癌組織中炎細胞絕大多數(shù)是CD163陽性，提示該腫瘤組織中主要是M2型或同時表達M1和M2型的亞型。Tjiu等的研究表明在基底細胞癌中，環(huán)氧化酶2誘導腫瘤相關(guān)巨噬細胞的增多促進腫瘤細胞的侵襲及血管生長[18]。Li研究發(fā)現(xiàn)鱗狀細胞癌細胞與巨噬細胞共培養(yǎng)將誘導巨噬細胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)α誘導蛋白8家族樣蛋白2(TNF-α induced protein8like2, TNFAIP8L2, TIPE2)，消耗TIPE2后巨噬細胞與鱗狀細胞癌細胞共培養(yǎng)后M2表型減少，而鱗狀細胞癌組織中發(fā)現(xiàn)在巨噬細胞中高表達TIPE2的患者的總的5年生存率明顯降低，因此認為TIPE2在腫瘤相關(guān)巨噬細胞和皮膚鱗狀細胞癌之間起一個橋梁作用[19]，綜上所述，M2型腫瘤相關(guān)巨噬細胞促進了皮膚常見上皮性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展，因此可以將CD163+腫瘤相關(guān)巨噬細胞作為腫瘤分子治療的一個靶點，特別是對無法外科手術(shù)切除、術(shù)后影響美觀及侵襲性轉(zhuǎn)移性的病變具有一定的意義。

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(收稿：2017-01-15 修回：2017-03-11)

Detect of CD163+tumor associated macrophages in common skin epithelial tumors

ZHOUWenming1，2,ZHANGWei1,SHENXiaoping1,LIUZhi1,LIShijun1,LUHongguang1.

1.DepartmentofDermatology,AffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China; 2.People'sHospitalofTongren,Guizhou,Tongren554300,China

Correspondingauthor:LUHongguang,E-mail：hongguanglu@hotmail.com

Objective: To detect the distribution of CD163+tumor associated macrophage in skin squamous cell carcinoma, basal cell carcinoma, Bowen's disease and actinic keratosis. Methods: The distribution of CD163+tumor associated macrophages under in the normal skin,skin squamous cell carcinoma, basal cell carcinoma, Bowen's disease and actinic keratosis were detected by the immunohistochemitry method (MaxVision). Results: The number of CD163+tumor associated macrophage in the upper dermis of the normal skin, Bowen's disease and actinic keratosis were (9.5000±1.71594), (43.9200±9.98716) and (49.4000±8.73830) respectively and 42.17241±11.73234 in the tumor stroma of basal cell carcinoma, 65.8421±14.05649 in the tumor stroma and parenchyma of the skin squamous cell carcinoma. Conclusion: The CD163+tumor associated macrophages may play an important role in the occurrence and development of the common skin epithelial tumors.

tumor associated macrophage; skin squamous cell carcinoma; basal cell carcinoma; Bowen's disease; actinic keratosis; CD163

貴州醫(yī)科大學學科建設經(jīng)費資助(編號：0215025100104)

1貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院皮膚科，貴州貴陽,550004 2貴州省銅仁市人民醫(yī)院，貴州銅仁,554300

陸洪光，E-mail：hongguanglu@hotmail.com