RIP1/3對創(chuàng)傷性腦損傷后神經元的作用及其機制研究

王宏斌 鄭新瑞 袁華 何芳梅

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RIP1/3對創(chuàng)傷性腦損傷后神經元的作用及其機制研究

王宏斌 鄭新瑞 袁華 何芳梅

目的 探討RIP1/3對創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)后神經元的影響及其作用機制。方法 將體外培養(yǎng)的皮層神經元分為4組：siRIP組、Nec-1預處理組、陰性質粒轉染組和對照組。通過慢病毒轉染法分別干涉RIP1、RIP3表達，建立離體TBI損傷模型，通過流式細胞學檢測劃傷后神經元存活情況。對體外培養(yǎng)的皮層神經元敲除RIP1/3，建立谷氨酸誘導神經元損傷模型，通過流式細胞學檢測谷氨酸刺激后神經元存活情況。結果 siRIP組及Nec-1預處理組機械性損傷后神經元存活率高于陰性質粒轉染組和對照組。Nec-1預處理組谷氨酸損傷后神經元存活率高于對照組，而siRIP組存活率與對照組和陰性轉染組比較未見顯著差異。結論 RIP1和RIP3可能對TBI誘導后神經元死亡有作用，而RIP1抑制劑Nec-1可能對TBI具有腦保護作用。RIP1/3與谷氨酸興奮毒性誘導細胞死亡無關，而Nec-1對于谷氨酸損傷具有潛在保護作用，并可能存在特異性靶點。

創(chuàng)傷性腦損傷 受體相互作用蛋白1/3 神經元 谷氨酸

創(chuàng)傷性腦損傷(Traumatic brain injury,TBI)是常見的外科損傷，也是神經外科的重要臨床疾病之一。全世界每年有近1億人因TBI而死亡或者住院，在目前現(xiàn)存人口中大約有60億人次曾經歷過TBI[1-3]，這給社會及民眾都造成了巨大的經濟和精神負擔。顱腦外傷中腦組織會先后經歷初次腦損傷和二次腦損傷。初次腦損傷往往時間迅速、難以防治，但相對的危害也較小，而繼發(fā)性腦損傷其中包括初次創(chuàng)傷后機體所發(fā)生的一系列病理生理反應如細胞凋亡、壞死、興奮性神經遞質毒性釋放、炎癥反應、氧自由基生成、神經脫髓鞘、白質病變以及癲癇等，因其機制復雜，并且易產生級聯(lián)效應，因而危害更大，可導致長期的運動和認知功能障礙。

受體相互作用蛋白(RIP)家族中的RIP1和RIP3可以誘導多種不同的細胞轉歸。已有研究證實其在細胞壞死與凋亡中發(fā)揮著重要作用，在炎癥因子等因素的刺激下RIP激活自身絲蘇氨酸激酶活性，從而介導細胞死亡。已有研究證實RIP蛋白在神經系統(tǒng)缺血和退行性變中有作用，但關于其對TBI的影響，因為機制復雜，而鮮有研究。因此，本研究的目的旨在初步探索TBI后RIP1及RIP3的表達變化以及RIP分子對于TBI后神經元的影響及作用。

1 材料與方法

1.1 材料及主要儀器

試驗孕2周昆明小鼠(25～30 g)培養(yǎng)于第四軍醫(yī)大學動物中心;FBS、Neurobasal培養(yǎng)液、10%胎牛血清、B27添加劑、DMEM購自美國Gibco公司；PBS購自西安化學試劑廠；PLL、L-谷氨酰胺、多聚賴氨酸、胰蛋白酶購自美國Sigma公司；NF200多克隆抗體購自武漢博士得公司；LDH檢測試劑盒購自美國 BioVision 公司；5% CO2孵箱購自美國Forma公司；高速低溫離心機購自美國Beckman公司；光學解剖顯微鏡購自德國Leica公司；恒溫孵箱購自上海市儀器廠；電熱恒溫水浴鍋購自上海市醫(yī)療儀器廠；純水機購自美國Millipore公司；精密電子天平購自瑞士Mteeler公司；醫(yī)用離心機購自上海醫(yī)療儀器廠；透射電鏡購自日本Olympus公司；倒置相差顯微鏡購自德國Leica公司；UV2300分光光度計購自上海天美科學儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

于光學解剖顯微鏡下逐一剝離胎鼠的皮層結構。在4 ℃預冷的新鮮PBS液中剝去軟、硬腦膜和周圍血管組織；剝離后用D-Hanks液漂洗皮層，時間為5 min；用眼科剪剪碎漂洗過的組織，加入胰蛋白酶消化液(1.25 g/L，2 mL)，置于CO2濃度為5%的38 ℃恒溫孵箱中進行細胞消化，時間為20 min；室溫條件下用移液器吸去上層剩余的消化液，將消化后的腦組織轉移至含有DMEM與20%胎牛血清的無菌離心管中，靜置10 min，靜置后終止消化，用DMEM培養(yǎng)液再次漂洗細胞，時間5 min；使用膠頭滴管室溫下在DMEM細胞培養(yǎng)液(含20%胎牛血清)中將消化后的腦組織碎片緩慢吹打成為細胞懸液，靜置5 min后顯微鏡下觀察滴于細胞懸液計數(shù)板并計數(shù)細胞；預先用多聚賴氨酸包被60 mm培養(yǎng)皿1 d，之后用PBS液反復漂洗3～4遍，室溫下晾干備用，以4×105/cm2將細胞接種于35 mm培養(yǎng)皿上，培養(yǎng)液中加入終濃度為100 000 U/L的青-鏈霉素和谷氨酰胺(0.6 mmo1/L)；將細胞置于恒溫孵箱(設定同上)中進行培養(yǎng)，時間24 h，次日棄去青-鏈霉素培養(yǎng)液，用的DMEM培養(yǎng)液38 ℃下漂洗細胞2次，并更換為等量的含B27(20 m1/L)的Neurobasal培養(yǎng)液；每日于顯微鏡下觀察神經元生長狀況并拍照記錄；每隔3 d半量更換Neurobasal培養(yǎng)液。

1.2.2 建立離體TBI損傷模型

神經元體外培養(yǎng)第6 d將培養(yǎng)液替換成新鮮的不含抗生素的完全培養(yǎng)液；24 h后對于35 mm培養(yǎng)皿培養(yǎng)的神經元，將1×109TU/ml siRIP1或1×109TU/ml siRIP3分別加入到10 μL病毒稀釋液中，輕輕混勻，然后在細胞培養(yǎng)液中緩慢加入轉染試劑復合物并均勻混合，隨后38 ℃下50 ml/L CO2孵箱中孵育72 h以上。對照組僅替換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。神經元培養(yǎng)在第11 d將對照組和基因轉染組再各分2組，一半提前1 d加入使用濃度為50 μM的necrostatin-1，各組進行相應的試驗干預處理，每組6個培養(yǎng)皿；神經元在轉染空載體或siRIP1/3后72 h進行損傷；損傷方法采用Fаden等的實驗方法[4]，用10 μL微量移液器塑料槍頭，快速地機械性劃割，劃傷速度與力度盡量保持一致，以保證各組神經元損傷程度和范圍大體相同；采用本法造成的損傷模型具有較高的穩(wěn)定性，能夠近似地在神經元上模擬機械性腦損傷的各種病理生理過程[5]。由此離體神經元TBI損傷模型分為4個小組，分別是siRIP組(分為RIP1干擾質粒轉染組及RIP3干擾質粒轉染組)、Nec-1預處理組、陰性質粒轉染組和單純損傷組。

1.2.3 轉染siRIP1/3后對神經元TBI損傷后細胞死亡率研究分析

神經元轉染siRIP1與siRIP并進行損傷24 h后采用Cell titer glo試劑盒檢測，此試劑盒是利用對ATP水平的檢測來表明細胞存活率，具體方法如下：于96孔培養(yǎng)板中需要檢測的孔內加入20 uL的Cell titer glo 試劑，搖床上震蕩5 min，靜置10 min后用多功能酶標儀檢測化學發(fā)光。

1.2.4 流式細胞術檢測機械損傷神經元凋亡和壞死

用6孔板培養(yǎng)細胞，神經元培養(yǎng)成功后根據各組要求建模，繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞生長達到50%～70%；將培養(yǎng)液移至離心管內，用PBS洗滌貼壁細胞1次，并加入適量胰酶消化細胞；室溫孵育，可使貼壁細胞輕輕吹打下來時吸除細胞消化液；務必避免胰酶過度消化細胞；貼壁細胞2 000 r/min消化離心5 min并收集；用PBS洗滌細胞2次2 000 r/min離心5 min收集1～5×105細胞；加入100 μL的1×Binding Buffer以懸浮細胞；加入5 μL Annexin V-PE和10 μL 7-AAD染液混勻，室溫、避光、反應15 min；補加380 μL的1×Binding Buffer，混勻；在1 h內進行流式細胞儀的觀察和檢測。

1.2.5 體外模型中干涉RIP1/3對谷氨酸誘導神經元死亡模型的影響

將體外培養(yǎng)的皮層神經元敲除RIP1/3。建立谷氨酸誘導神經元損傷模型。神經元培養(yǎng)的第11 d將對照組和基因轉染組再各分2組，各組進行相應的試驗干預處理，每組6個培養(yǎng)皿；神經元在轉染空載體或siRIP1/3后72 h進行谷氨酸損傷：加入谷氨酸500 μmol/L與10 μmol/L甘氨酸預處理12 h的混合液刺激神經元15 min后更換為正常培養(yǎng)液，過夜培養(yǎng)；轉染siRIP1/3后對神經元谷氨酸損傷后細胞死亡率進行分析。

1.2.6 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 RIP1/3干擾質粒轉染神經元

通過使用干擾RIP1與RIP3慢病毒載體轉染神經元發(fā)現(xiàn)，綠色熒光顯示病毒干擾效率較高，WB顯示過慢病毒干擾后RIP1與RIP3表達明顯下調(圖1)。

2.2 神經元存活情況

TBI后陰性質粒轉染組存活細胞明顯減少(36±3.8)%，而干擾RIP1或RIP3都可使存活率增加(72%，68%)。同時，使用Nec-1也有明顯效果(P<0.05)(圖2)。

注:1為單純損傷組;2為陰性質粒轉染組;3為RIP1干擾質粒轉染組;4為RIP3干擾質粒轉染組;5為Nec-1處理組圖1 RIP1/3干擾質粒轉染神經元分析

圖2 RIP1/3干擾質粒轉染神經元后細胞存活情況

2.3 流式細胞術檢測

流式細胞術檢測顯示陰性質粒轉染組與單純損傷組無顯著差異，干擾RIP1與RIP3后細胞凋亡與壞死與損傷組相比顯著減少(P<0.01)，而使用Nec-1組細胞存活率較干擾組更高(P<0.05)(圖3)。

2.4 谷氨酸誘導神經元死亡模型的細胞生存率

在對體外神經元以谷氨酸刺激后神經元生存率明顯下降(17.8±2)%，同時可以看到干擾RIP1或干擾RIP3對于神經元谷氨酸損傷細胞死亡率都無明顯影響，而同時添加Nec-1預處理組死亡率明顯下降(P<0.01)。使用炎癥因子TNF-α誘導離體神經元凋亡模型中干擾RIP1與干擾RIP3組生存率都明顯上升(P<0.01)，與Nec-1保護效果無顯著差異(圖4～5)。

3 討 論

TBI是神經外科的常見病、多發(fā)病，約占全身各處損傷的10%～15%。臨床上擁有極高的致殘、致死率。尤其是在戰(zhàn)創(chuàng)傷中顱腦損傷所致陣亡比例居首[6]。在美國每年因TBI而致死、致殘人數(shù)高達50,000和90,000人。在歐盟TBI的發(fā)生率高達100～800例/10萬人，顱腦損傷每年入院人數(shù)超過100萬例[7-9]。我國在上世紀80年代初TBI病死率高達10%左右[10-11]。目前隨著社會發(fā)展，交通和生產事故不斷增加，TBI在我國的發(fā)病率也呈不斷上升的趨勢。所以，TBI后神經細胞的損傷機制值得我們去深入研究。

圖3 神經元損傷后流式細胞術檢測

圖4 谷氨酸模型中RIP1/3干擾質粒轉染神經元存活情況

圖5 炎癥因子TNF-α誘導凋亡模型中RIP1/3干擾質粒轉染神經元存活情況

TBI后腦組織主要的病理變化就是神經元和膠質細胞的壞死和凋亡。Rink等人于1995年發(fā)現(xiàn)，在大鼠顱腦外傷模型中大腦皮質、白質區(qū)，海馬組織、齒狀回等結構中出現(xiàn)了大量包括神經元等的凋亡現(xiàn)象[12]。Conti等人發(fā)現(xiàn)在TBI后1和7 d分別存在2個不同的凋亡高峰，并且星形膠質細胞(astrocyte)和少突膠質細胞(oligodendroglia)等神經膠質細胞也參與到了神經元的凋亡活動中[13]。Williams等的研究表明，在TBI 1年后大腦白質區(qū)內仍能明顯地發(fā)現(xiàn)神經細胞凋亡[14]。

創(chuàng)傷后短時間內造成的神經元大量死亡多為直接損傷因素所導致的壞死，隨后細胞凋亡與壞死則同時存在于創(chuàng)傷區(qū)的組織中。TBI后大腦的血液循環(huán)受到影響，導致腦組織發(fā)生缺血缺氧反應，神經元與膠質細胞的生物膜功能出現(xiàn)障礙。這些病理反應反過來會使血管和細胞毒性的腦水腫發(fā)生，進一步加重了腦損傷。缺血與缺氧環(huán)境下亦可造成神經元的能量代謝失衡與各類興奮性氨基酸的過量釋放。神經元內Ca2+失衡，脂質、過氧化物和氧化自由基等也會發(fā)生變化。以上神經細胞微環(huán)境的改變促使調控細胞凋亡的基因如bcl-2和P53等表達上調或下調，激活Caspase及RIP蛋白家族等[15]，最終啟動了細胞的自殺程序。

2005年Degterevs關于缺血性腦損傷模型的細胞死亡機制探討中發(fā)現(xiàn)了necrostatin-1(Nec-1)。Nec-1是一種生物小分子，它可以抑制Fas/TNFR l的一種下游通路，即受體相互作用蛋白1(recepter interacting protein 1,RIP 1)所介導的細胞壞死，但卻不能抑制Fas/TNFR l依賴性的細胞凋亡。說明存在某種也可以受相應的分子調控的細胞壞死。由此一條可介導細胞程序性壞死的調控分子被發(fā)現(xiàn)了，而它被證明位于DD下游的信號通路[16]。Nec-l則被認為是這種程序性壞死的特異性阻斷劑，廣泛使用在相關實驗中。Nec-l作用于RIP 1與RlP 3的絲/蘇氨酸激酶活性位點，抑制了RIP 1與RIP 3的相互磷酸化。進一步阻礙了RIP1-RIP3-TNFR復合體II的形成，從而抑制細胞壞死[17]。在谷氨酸誘導的海馬神經元壞死[18]、小鼠大腦皮層神經元的缺血-再損傷灌注[19]、視網膜缺血損傷[20]以及阿爾茨海默病(Alzheimer's disease)、帕金森氏綜合征(Parkinson's disease)和亨廷頓氏舞蹈病(Huntington's disease)等多種神經疾病中都證實存在這種RIP1-RIP3蛋白所影響的程序性壞死[21-23]。

本實驗研究顯示，不論是干擾RIP1或RIP3都對TBI后神經元具有明顯的保護作用，其保護機制尚不清楚，可能通過多種途徑影響神經細胞損傷后凋亡、壞死、自噬與存活；同時RIP1的抑制劑Nec-1也具有神經保護作用，進一步說明受體相互作用蛋白在TBI后調節(jié)神經元死亡具有重要作用。Nec-1對于神經元的保護作用比單純干擾RIP蛋白更強，提示Nec-1可能還存在著其他神經保護作用。

谷氨酸是大腦皮層內最具代表性的興奮性神經遞質；它與神經元的發(fā)育、死亡、信息傳遞和突觸的可塑性以及神經系統(tǒng)疾病密切相關。TBI后谷氨酸大量釋放產生神經毒性，在神經系統(tǒng)損傷中發(fā)揮著獨特作用，是其他系統(tǒng)損傷所少有的。一直以來Necrostatin-1都被認為是RIP1/3蛋白磷酸化的特異性抑制劑[24]。其作為特異性的程序性壞死抑制劑而被廣泛應用。Xu等發(fā)現(xiàn)nec-1在HT-22海馬神經元系中可以抑制谷氨酸引起神經興奮毒性[19]。也有實驗證實Nec-1對于腦缺血模型具有保護作用。但是通過上述實驗可以看出RIP1/3蛋白對于谷氨酸誘導的神經細胞死亡不具有保護作用，因此nec-1對于谷氨酸神經興奮毒性的保護靶點可能不是RIP1/3。這與之前報道的推斷存在矛盾。同時干涉RIP1/3并未降低谷氨酸細胞毒性，也說明RIP1/3可能不是神經興奮性毒性的下游作用分子(圖6)。王玉田院士研究小組發(fā)現(xiàn)谷氨酸對GABA受體有增強變構作用，研究發(fā)現(xiàn)神經元損傷后釋放大量谷氨酸達到一定閾值時谷氨酸會與抑制性GABA受體結合，產生神經抑制效果，有益于保護神經元生存[25]。Nec-1對谷氨酸損傷性神經元模型的保護作用，是否是其促進谷氨酸與GABA受體結合導致，有待進一步系統(tǒng)研究。

圖6 Nec-1對TBI后不同細胞凋亡通路的影響模型

TBI后腦組織尤其是神經元的反應十分復雜，有研究認為最初的創(chuàng)傷可能導致?lián)p傷級聯(lián)效應，引發(fā)多種病理生理過程。本研究證實RIP1與RIP3所誘導的細胞凋亡或程序性壞死也參與其中，并且這種死亡方式與谷氨酸的興奮性神經毒性無關，而RIP1的抑制劑necrostatin-1對于谷氨酸損傷的保護作用提示其不僅僅是RIP蛋白的特異性抑制劑，其在TBI中可能存在其他的作用靶點。以上研究結果為進一步探究TBI后細胞分子生物學機制提供了一些參考。在這一方面的后續(xù)研究將對于臨床開發(fā)創(chuàng)傷性顱腦損傷防治藥物具有重要意義。

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(2016-07-17收稿)

The effect and mechanism of RIP1/3 on neurons after traumatic brain injury

WangHongbin,ZhengXinrui,YuanHua,etal.

DepartmentofRehabilitationandPhysiotherapy,XijingHospital,TheFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032

Objective To investigate the effect and mechanism of RIP1/3 on neurons after traumatic brain injury (TBI).Methods The cultured cortical neurons were divided into four groups:siRIP group,Nec-1 pretreatment group,negative plasmid transfection group and control group.The TBI damage model was established by interfering with the expression of RIP1 and RIP3 through lentiviral transfection,respectively.The RIP3 damage model was established,and the survival rate of neurons was detected by flow cytometry.Results After mechanical injury,the survival rate of neurons in the siRIP group and in the Nec-1 pretreatment group was higher than that in the negative plasmid transfection group and in the control group.After glutamate stimulation,the survival rate of neurons in the Nec-1 pretreatment group was higher than that in the control group.siRIP3 group or siRIP1 group showed no significant difference in the survival rate of neurons when contrasted with the negative control transfection group.Conclusion RIP1 and RIP3 may play a role in neuronal death induced by TBI,RIP1 inhibitor Nec-1 may have a function in brain protection for TBI.RIP1 and RIP3 have no effect on neuron cell death induced by glutamate excitotoxicity.Nec-1 has a potential protective effect on glutamate injury,probably suggesting a specific target.

Traumatic brain injury RIP1/3 Neuron Glutamate

國家科技部國際合作專項項目(編號2013DFA32610)；國家自然科學基金資助項目(81271450)；陜西省國際科技合作與交流計劃項目(2015KW-035)

710032 西安，第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院康復理療科[王宏斌(共同第一作者，碩士在讀) 袁華(通訊作者)]，神經外科 [鄭新瑞(共同第一作者)]; 西安交通大學醫(yī)學部研究生院康復與理療專業(yè)[何芳梅]

R741

A

1007-0478(2017)01-0045-06

10.3969/j.issn.1007-0478.2017.01.012