大鼠心肌缺血模型制備方法的比較及改進(jìn)淺析

張世田，龐路路，唐漢慶*，黃岑漢

(1.右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533000； 2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，南寧 530000)

大鼠心肌缺血模型制備方法的比較及改進(jìn)淺析

張世田1，龐路路2，唐漢慶1*，黃岑漢1

(1.右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533000； 2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，南寧 530000)

雖然大鼠冠心病心肌缺血模型的制備方法在許多文獻(xiàn)記載中描述比較詳細(xì)，實(shí)用價(jià)值比較高，并被諸多學(xué)者選擇作為研究人類疾病及藥物藥理作用的動物疾病模型，但其操作性和可行性仍有一定不足。本文通過實(shí)驗(yàn)重新選擇冠脈結(jié)扎部位、簡化操作步驟、改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方法重新造模，取得了滿意的效果。本文就大鼠冠心病心肌缺血模型制備方法的選擇、具體操作過程、影響因素等進(jìn)行綜合評述，為研究者選擇合適的動物疾病模型提供參考。

冠心??；心肌缺血；動物模型；方法；心臟；手術(shù)

動物疾病模型是人類研究疾病的重要工具，在生物醫(yī)學(xué)研究中廣泛應(yīng)用[1]。制備具有與疾病相似度高、重復(fù)性好，盡可能模擬人類疾病的發(fā)生、發(fā)展?fàn)顟B(tài)及典型病理變化等優(yōu)點(diǎn)的動物疾病模型，用于探索疾病的病因、發(fā)病機(jī)制、治療和預(yù)防，是動物實(shí)驗(yàn)研究到臨床研究過程中必不可少的一步，動物疾病模型的準(zhǔn)確制備為臨床研究和治療提供很好的研究平臺。盡管已有很多參考文獻(xiàn)記載冠心病心肌缺血模型的具體操作過程，但對于初次研究者，在實(shí)際研究或操作過程中，一些細(xì)節(jié)問題相關(guān)文獻(xiàn)沒有具體描述或描述不清，導(dǎo)致造模失敗或成功率較低，多走一些彎路，造成一些不必要的損失。為提高大鼠冠心病心肌缺血模型制備的成功率，下面以結(jié)扎大鼠左心回旋支為例，介紹冠心病心肌缺血模型制備過程中改進(jìn)的一些方法和建議,為后續(xù)研究者為此動物疾病模型的制作提供參考和指導(dǎo)。

1 動物心肌缺血模型與臨床冠心病的區(qū)別

動物心肌缺血模型的制備是通過對健康動物冠狀動脈采取手術(shù)結(jié)扎或藥物阻斷冠狀動脈供血，引起心肌缺血、缺氧導(dǎo)致心肌壞死。臨床冠心病[2]，是在多種危險(xiǎn)因素，如年齡、吸煙、高血壓、高脂血癥、糖尿病、肥胖、高同型半胱氨酸血癥等原因，在冠狀動脈血管內(nèi)壁逐步引起冠狀動脈粥樣硬化病變導(dǎo)致血管腔狹窄、閉塞，造成心肌缺血、缺氧甚至壞死而導(dǎo)致的心臟病。從病因和病理變化過程來看兩者有著本質(zhì)的區(qū)別，而缺血后的病理生理變化和轉(zhuǎn)歸兩者有很大的相似性。因此，冠狀動脈心肌缺血模型與臨床冠心病既有區(qū)別，又有一定程度的相似性，在借用該動物模型進(jìn)行生物醫(yī)學(xué)研究時(shí)，應(yīng)該根據(jù)研究的目的和意義，正確選擇和利用動物疾病模型與人類疾病的相似點(diǎn)作為研究的方向。

2 心肌缺血模型動物及造模方法的比較與選擇

2.1 心肌缺血模型動物選擇

常用的實(shí)驗(yàn)動物有小型豬、犬、貓、兔、大鼠等[3]，動物越大，其生理學(xué)特性、結(jié)構(gòu)及功能越與人接近，動物越小，器官越小，結(jié)構(gòu)和功能差異越大，手術(shù)操作的難度增大。大鼠具有體型大小適中，價(jià)格低廉，適應(yīng)性強(qiáng)，繁殖快，切口出血少，抗感染能力強(qiáng)，易飼養(yǎng)管理、給藥方便等優(yōu)點(diǎn)，是冠心病心肌缺血模型制作的良好動物選擇。根據(jù)多次實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論，體重一般選擇在250 ～ 300 g之間成年Wistar或SD大鼠造此疾病模型比較合適[4]，體重太小，耐受性差，心臟太小，不易操作，成活率低；體重太大，適應(yīng)及可塑性差，死亡率高。因此，動物疾病模型，不僅要選擇合適的動物，還要根據(jù)臨床疾病的特點(diǎn)，依據(jù)動物年齡和體重，判斷最佳的造模時(shí)間。

2.2 心肌缺血模型造模方法選擇

大鼠冠心病心肌缺血模型比較成熟的的制作方法有開胸手術(shù)結(jié)扎法和藥物法兩種[3]，開胸手術(shù)法是通過開胸后直視下做冠狀動脈結(jié)扎，阻斷其血流，致使心肌缺血壞死，如果結(jié)扎一段時(shí)間，使冠狀動脈再通，那就是心肌缺血再灌注模型。開胸手術(shù)法目的明確，方法簡單，結(jié)扎部位準(zhǔn)確，造模成功率高，但手術(shù)創(chuàng)傷、感染、定位不準(zhǔn)確、操作不熟練等原因，易造成實(shí)驗(yàn)動物損傷、手術(shù)并發(fā)癥等原因死亡而導(dǎo)致造模失敗。藥物法常使用異丙腎上腺素(isoprenaline，ISO)或垂體后葉素(pituitrin，Pit)[5]，通過尾靜脈注射，引起心肌需氧量增大、冠狀動脈痙攣、收縮，導(dǎo)致心肌缺血壞死，不同劑量的藥物造成不同程度心肌缺血性損傷，此方法簡單，但缺血的程度、部位、梗死范圍很難作出定量和定性分析，導(dǎo)致造模的準(zhǔn)確性無法判斷。鑒于兩種模型的優(yōu)缺點(diǎn)，多數(shù)人一般選擇造模準(zhǔn)確度高、可控性好的直視下開胸手術(shù)冠脈結(jié)扎法。

3 大鼠冠脈的解剖特點(diǎn)及其結(jié)扎部位選擇

大鼠心臟冠狀動脈走行及分支與人有很大的區(qū)別，心臟的血液供應(yīng)既來自冠狀動脈，也來自起源于頸內(nèi)動脈和鎖骨下動脈的冠外動脈[1]。通過解剖大鼠可知心臟腹面冠狀動脈走行不明顯(圖1)，而在心臟背面的左心回旋支和右冠脈走行清晰(圖2)，左心回旋支主干支及其末梢分支支配左心室(圖3)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[6]，冠脈結(jié)扎采取的部位多是左心耳下緣與肺動脈圓錐之間，進(jìn)行直視下結(jié)扎或盲扎，但通過實(shí)驗(yàn)解剖多只大鼠觀察得知，左心耳下緣與肺動脈圓錐之間腹面走行的左冠狀動脈(圖3)，血管位置細(xì)而隱藏，走行不明顯，而繞左心室側(cè)面向腹面走行，支配左心室的左回旋支主干及其末梢分布比較清晰，可在其分支比較密集的末梢處結(jié)扎。相比之下，此處血管走行明顯、密集，結(jié)扎時(shí)動脈容易發(fā)現(xiàn)，心肌較厚，不容易穿透心肌，是很好的結(jié)扎部位。結(jié)扎回旋支主干易導(dǎo)致心肌大面積壞死，死亡率較高，而結(jié)扎末梢處，梗死面積大小可依據(jù)結(jié)扎血管的數(shù)量來決定，有一定的可控性，死亡率較低。由于心臟供血豐富，血管密集，也可在左心室外壁按照上述方法采取盲扎法，同樣可引起部分心肌壞死，達(dá)到同樣的造模效果(圖4)。

圖1 大鼠心臟腹面圖Fig.1 Ventral view of the rat heart

圖2 大鼠心臟背面圖Fig.2 Back view of the rat heart

圖3 大鼠心臟側(cè)面圖Fig.3 Lateral view of the rat heart

圖4 心肌缺血模型(蒼白處為壞死區(qū))Fig.4 External appearances of a model rat of myocardial ischemia (The circle indicates a pale necrotic area)

4 心肌缺血模型的制作過程

(1)術(shù)前準(zhǔn)備：手術(shù)器械酒精常規(guī)消毒，備好碘伏消毒液、生理鹽水、無菌紗布、棉棒、備皮工具(手術(shù)剪或理發(fā)器)、大鼠解剖板，開口器(開瞼器或回形針自制開口器)、小手術(shù)無影燈等。

(2)麻醉、備皮：術(shù)前稱重，按照0.35 mL/100 g，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，1 ～ 2 min之后，判斷大鼠意識和麻醉程度，然后在解剖板上固定四肢，四肢連接心電圖機(jī)，打印正常狀態(tài)下的肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖，用手術(shù)剪或理發(fā)器等備皮工具于氣管切開部位和開胸部位備皮，手術(shù)區(qū)域用碘伏常規(guī)消毒。

(3)氣管插管：用手術(shù)剪在頸部正中，做一縱行約1 cm切口(切口盡量要小)，逐層分離皮膚淺筋膜，筋膜下組織(注意保護(hù)甲狀腺)、頸前肌肉，暴露氣管，用兩把小的止血鉗固定氣管，用大號注射器針頭開口或者眼科剪在第2、3軟骨環(huán)處做一橫向切口(切口盡量要小于氣管插管，以防漏氣)，行氣管插管，達(dá)到合適的深度，打開調(diào)整好的呼吸機(jī)(頻率80次/min，吸呼比1∶1，潮氣量3 ～ 4 mL/100 g)，插管用膠布固定(不用手術(shù)線固定)，切口敷以生理鹽水紗布保護(hù)。

(4)開胸結(jié)扎：氣管插管后，在心臟波動最明顯、胸骨左緣1 cm處作縱行切口，逐層鈍性分離胸大肌和前鋸肌，暴露3、4肋間，順肋間隙方向用止血鉗鈍性分離肋間肌至胸腔，用開口器撐開兩肋骨，看到粉色海綿狀的肺臟和跳動的心臟，如果切口不在結(jié)扎部位，可剪斷附近肋骨，尋找結(jié)扎部位。用鑷子剝離心包膜，用濕生理鹽水棉簽分離心臟附近心包及肺組織，尋找左心室回旋支及其末梢，用手指擠壓胸廓固定心臟，用6-0的手術(shù)縫合線結(jié)扎包含末梢血管的心肌組織(寬度和深度約0.10 × 0.15 cm)或根據(jù)血管的走行盲扎含有血管的心肌組織，結(jié)扎心肌周圍顏色變暗，留線在心臟，4-0手術(shù)縫合線迅速縫合肋骨，擠壓兩側(cè)胸壁排除胸腔內(nèi)空氣，縫合肌肉和皮膚，消毒切口。拔出氣管插管，對齊并縫合氣管前肌和皮膚，消毒頸部切口(手術(shù)總過程約20 min左右)。

(5)術(shù)后處理：術(shù)后完成Ⅱ?qū)?lián)心電圖記錄，肌肉注射10萬U(105U)青霉素，預(yù)防感染(也可不用)，標(biāo)號后將大鼠放回帶有屏障系統(tǒng)籠內(nèi)飼養(yǎng)，定期觀察死亡及傷口愈合情況，作相應(yīng)處理。

5 影響造模成功的關(guān)鍵因素

通過實(shí)驗(yàn)過程，總結(jié)以下6條作為造模成功的關(guān)鍵因素。

(1)術(shù)前準(zhǔn)備：術(shù)前準(zhǔn)備要充分，盡量無菌操作，手術(shù)切口盡量要小，以減少并發(fā)癥的發(fā)生。

(2)氣管插管[7]：大鼠呼吸道相對較長而窄，即使使用動物喉鏡，直視下氣管插管成功率仍然比較低，建議氣管切開為主，氣管插管深度要合理，根據(jù)氣管長度確定插管的深度。

(3)麻醉[8]：爭取一次麻醉成功，如麻醉失敗，及時(shí)更換大鼠。避免反復(fù)加量麻醉，增加麻醉劑量容易引起大鼠耐受性低、麻醉過量致死。

(4)呼吸[9]：呼吸是影響造模成功的最關(guān)鍵因素，開胸后發(fā)生氣胸，結(jié)扎冠狀動脈及閉胸縫合短時(shí)間內(nèi)不可能完成，為提高存活率，必須用動物專用呼吸機(jī)。根據(jù)大鼠的個體因素，調(diào)整呼吸機(jī)參數(shù)，呼吸以能夠看到胸廓正常起伏為準(zhǔn)，起伏幅度太低或開胸后看不到肺說明通氣不足，正常情況下，能看到粉色肺覆蓋在心臟周邊，說明通氣正常，如發(fā)現(xiàn)肺萎縮，心臟顏色紫黯、快速室顫，呼吸深快，即是缺氧表現(xiàn)，要及時(shí)查找原因，改善通氣質(zhì)量。

(5)手術(shù)過程：盡量短時(shí)間(20 min左右)熟練完成操作，減少術(shù)后并發(fā)癥。切口要定位準(zhǔn)確，避開胸骨左緣大血管，以免失血過多；盡量不剪斷肋骨，減少損傷，保護(hù)組織完整性，預(yù)防感染，提高成活率。

(6)結(jié)扎部位選擇：根據(jù)梗死面積的需要，結(jié)扎左心室回旋支末梢動脈和心肌組織，避免結(jié)扎其主干，以免梗死面積過大心肌不能代償而死亡，導(dǎo)致造模失敗。

6 小結(jié)

以上是冠心病心肌缺血模型制作過程中的一些比較、改進(jìn)及分析，用改進(jìn)后的方法結(jié)扎左心室回旋支末梢動脈多次造模，4周后大鼠的成活率均在82%以上，與結(jié)扎左冠狀動脈前降支相比(存活率71.4%)[8]，此方法顯著提高了此動物疾病模型的成功率和存活率，且該方法可控性好，操作簡便，符合臨床冠心病心肌缺血梗死的疾病特征，既節(jié)約成本，又提高實(shí)驗(yàn)效率，值得推廣和借鑒。

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Comparison and improvement of the methods for establishment ofrat models of myocardial ischemia

ZHANG Shi-tian1， PANG Lu-lu2， TANG Han-qing1*， HUANG Cen-han1

(1.Youjiang Medical University for Nationalities, Baise Guangxi 533000, China； 2.Guangxi University of ChineseMedicine, Nanning 530000)

The method for preparation of models of myocardial ischemia in rats have been well described in the literature, are of practical value and have been chosen by many researchers for pharmacological studies of drugs for human diseases. However, there is still lack in some details of their operability and practicability. We re-selected the coronary artery ligation site, simplified the procedures and improved the experimental method for preparation of the models, and made satisfactory result. In this paper we will review the selection of method for preparing myocardial ischemia model in rats, describe some details of the surgical operation, explored the influencing factors and so on, and provide a reference for selecting most appropriate animal model in research.

Coronary heart disease; Myocardial ischemia; Animal model; Establishment methods; Heart; Surgery

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(項(xiàng)目批準(zhǔn)號81460658)。

張世田(1980-)，男，碩士研究生在讀，研究方向：冠心病中西醫(yī)結(jié)合治療的基礎(chǔ)與臨床研究。E-mail: 93625430@qq.com

唐漢慶(1976-)，男，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向：民族醫(yī)藥與中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)研究。E-mail: phdtanghanqing@163.com

研究進(jìn)展

R-33

A

1671-7856(2017) 07-0098-04

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.07.018

2017-01-06