昆蟲蛻皮激素受體研究進(jìn)展

王菁菁，胡瓊波

昆蟲蛻皮激素受體研究進(jìn)展

王菁菁，胡瓊波*

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院農(nóng)藥系，廣州 510642)

昆蟲的蛻皮激素(molting hormone，MH)是甾醇類激素，在昆蟲體內(nèi)的活性形式為20-羥基蛻皮酮(20-hydroxyecdysone，20E)。在昆蟲的正常發(fā)育過程中，昆蟲的蛻皮、變態(tài)和繁殖受到蛻皮激素的調(diào)控。昆蟲蛻皮激素受體(ecdysone receptor，EcR)和超氣門蛋白(ultraspiracle，USP)均屬于核受體超家族成員，具有核受體的結(jié)構(gòu)特征，包括A/B域(轉(zhuǎn)錄激活域transactivation domain)、C域(DNA結(jié)合域DNA-binding domain，DBD)、D域(鉸鏈域hinge region)、E域(配體結(jié)合域ligand binding domain，LBD)和F域。蛻皮激素受體在昆蟲蛻皮、變態(tài)和繁殖等重要的生命過程中的級聯(lián)反應(yīng)啟動位置，對昆蟲的生長發(fā)育和繁殖的正常完成有著非常重要的作用。蛻皮激素通過與蛻皮激素受體和超氣門蛋白組成的復(fù)合體相互作用，然后啟動一系列級聯(lián)反應(yīng)的過程。本文介紹了EcR和USP的結(jié)構(gòu)和功能，以及它們與蛻皮激素相互作用的機(jī)理，并對EcR在農(nóng)業(yè)害蟲防治等方面的應(yīng)用進(jìn)行了介紹，并討論了研究中遇到的問題以及對未來的研究進(jìn)行展望。

蛻皮激素受體；超氣門蛋白；核受體；20-羥基蛻皮酮(20E)；異質(zhì)二聚體

核受體(nuclear receptor，NRs)是一類擴(kuò)散并能與特異性配體結(jié)合的細(xì)胞內(nèi)信號蛋白，它們是配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，通過與配體結(jié)合而調(diào)控基因表達(dá)。NRs對機(jī)體的生長發(fā)育、新陳代謝等多種生理過程發(fā)揮重要功能。昆蟲蛻皮激素受體(ecdysone receptor，EcR)和超氣門蛋白(ultraspiracle，USP)均屬于核受體超家族成員，在昆蟲蛻皮、變態(tài)和繁殖等重要的生命過程中的級聯(lián)反應(yīng)啟動位置，對昆蟲的生長發(fā)育和繁殖的正常完成有著非常重要的作用。蛻皮激素是昆蟲調(diào)控蛻皮及變態(tài)發(fā)育的重要激素，它的活性形式是，20-羥基蛻皮酮(20-hydroxyecdysone，20E)，20E的最早靶基因是蛻皮激素的受體EcR/USP復(fù)合體，MH通過與EcR和USP的復(fù)合體結(jié)合，調(diào)控下游基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控昆蟲發(fā)育時期或組織對激素信號的特異生物學(xué)應(yīng)答，稱為20E信號途徑。近年來，對EcR和USP的研究逐漸深入，在EcR和USP的基因的克隆測序、結(jié)構(gòu)特征和功能確認(rèn)的方面涉及了更廣泛的昆蟲，同時，EcR和USP與蛻皮激素的級聯(lián)反應(yīng)調(diào)控機(jī)理和分子的作用方式方面的研究也取得了很多進(jìn)展。EcR在的農(nóng)業(yè)害蟲防治和人類醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用有著十分重要研究價值和研究前景。

1 蛻皮激素受體的結(jié)構(gòu)

1.1 蛻皮激素受體的結(jié)構(gòu)

自從對黑腹果蠅Drosophilamelanogaster的EcR和USP基因在上世紀(jì)的九十年代被克隆以來(Henrichetal., 1990)，已經(jīng)有國內(nèi)外許多學(xué)者對鱗翅目、同翅目、直翅目、蜚蠊目、雙翅目等的諸多昆蟲的EcR和USP基因進(jìn)行克隆測序以及相關(guān)的研究。這些昆蟲的EcR均屬于核受體超家族(Vanackeretal.,1998)，它們有著核受體基因家族的成員具有的的共同的結(jié)構(gòu)特征，一個典型的核受體分子從N端起，都是由A/B域(轉(zhuǎn)錄激活域transactivation domain)、C域(DNA結(jié)合域DNA-binding domain，DBD)、D域(鉸鏈域hinge region)、E域(配體結(jié)合域ligand binding domain，LBD)和F域5個部分組成。

圖1 核受體的結(jié)構(gòu)示意圖(Kingjones and Thummel, 2005)Fig.1 The stucture of nuclear receptor

A/B域：此結(jié)構(gòu)中，氨基酸序列長度和同源性有著較大的變異，有著很大的可變性；其長度不一，由50至500多個氨基酸組成，特定位置的酪氨酸、絲氨酸和蘇氨酸殘基能受不同信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的相關(guān)激酶作用而磷酸化，繼而影響受體和配體的親和力和轉(zhuǎn)錄活性。目前已知的昆蟲EcR有EcR-A、EcR-B1、EcR-B2 3種亞型，它們的主要區(qū)別就在于A/B結(jié)構(gòu)域的不同，最大的不同表現(xiàn)在A/B結(jié)構(gòu)域的N端部分，它們的C端基本相同；目前僅在黑腹果蠅中發(fā)現(xiàn)3個亞型同時存在，其他昆蟲中僅發(fā)現(xiàn)EcR-A或EcR-B1型；這3種亞型在昆蟲的變態(tài)發(fā)育中的發(fā)育階段和組織特異性，有著不同的生物學(xué)功能(Jindraetal., 1996)。EcR-A主要存在于前胸和氣管芽中，EcR-B1主要存在于如唾液腺或脂肪體等的幼蟲組織中。例如，EcR-B2亞型對恢復(fù)黑腹果蠅胚胎發(fā)育階段，幼蟲能否正常發(fā)育有重要的作用。A/B結(jié)構(gòu)域的缺失，會使得EcR失去正常的轉(zhuǎn)錄激活功能(Tranetal., 2001)。該域具有依賴于配體的轉(zhuǎn)錄激活功能(activation function 1,AF-1)。

C域：DNA結(jié)合域在EcR的5個功能區(qū)中具有最高的保守性，N端的66至68個氨基酸能形成專一識別DNA的α-螺旋，包含了特殊的高度保守的鋅指結(jié)構(gòu)，C-X2-C-X13-C-X2-C(鋅指Ⅰ)和 C-XS-C-X9-C-X2-C(鋅指Ⅱ)，每個鋅指結(jié)構(gòu)由4個半胱氨酸和中心的一個鋅離子螯合而成(Wickert and Selbig, 2002)。使得昆蟲的蛻皮激素在EcR/USP形成復(fù)合體后，能特異性識別蛻皮激素受體反應(yīng)元件(ecdysone respone elements，ECRE)，進(jìn)而引起下游的級聯(lián)反應(yīng)。ECRE具有高度兼并性的不完全回紋結(jié)構(gòu)。C端還具有A-box和T-box的特殊結(jié)構(gòu)。ECRE能夠與A-box氨基酸殘基結(jié)合，T-box能夠使得A-box正確定位到ECRE的作用(V?gtlietal., 1998)。C結(jié)構(gòu)域有很強(qiáng)的可塑性，對黑腹果蠅的α-螺旋等多個位點(diǎn)的氨基酸進(jìn)行突變處理后，測定這些位點(diǎn)與hsp27的結(jié)合能力，實(shí)驗結(jié)果得出黑腹果蠅的EcR與hsp27結(jié)合能力幾乎不受影響，只有少量的位點(diǎn)突變后使得其與hsp的結(jié)合能力下降(Mareketal., 2004)。因為該域具有較高的保守性，所以DNA結(jié)合域可用作為核受體基因鑒定的典型結(jié)構(gòu)序列。

D域：鉸鏈域?qū)cR與USP能形成二聚體有著重要的作用。鉸鏈域的保守程度比較高。其結(jié)構(gòu)具有T-box和A-box，它們的作用分別是能夠識別DNA和與DNA具有高度的親和性(Bergmanetal., 2004)。

E域：配體結(jié)合域同樣具有較高的保守性，但其程度僅次于DNA結(jié)合域，所以，配體結(jié)合域也如同DNA結(jié)合域一樣，能夠作為核受體基因鑒定的典型結(jié)構(gòu)序列。其具有222至226個氨基酸組成，具有依賴配體的轉(zhuǎn)錄激活功能(activation function 2，AF2)。經(jīng)過對昆蟲EcR結(jié)合域晶體結(jié)構(gòu)的分析，發(fā)現(xiàn)昆蟲的LBD都是由12個α-螺旋反向排列形成“三明治”結(jié)構(gòu)，有一個疏水袋裝結(jié)構(gòu)，使之能與配體結(jié)合，稱為配體結(jié)合袋(Billasetal., 2003)。配體例如蛻皮激素的某些基團(tuán)一旦與配體袋內(nèi)的不同的氨基酸殘基接觸，就會使袋內(nèi)構(gòu)象發(fā)生改變，使得位于配體結(jié)合袋頂端的α-螺旋12封閉袋口，進(jìn)而開始下游基因的轉(zhuǎn)錄。α-螺旋12的C端的AF2,其能夠幫助EcR/USP復(fù)合體與共激活子(coactivators)的結(jié)合(Billa, 2003)。有研究還表明，配體結(jié)合域還能介導(dǎo)與熱休克蛋白的相互作用(Niedziela-Majkaetal., 2000)。

圖2 二聚體配體結(jié)合域結(jié)構(gòu)(Hill et al., 2012)Fig.2 The structure of ligand-binding domain of heterodimer

F域：在核受體超家族中，僅有少量的核受體具有F結(jié)構(gòu)域；昆蟲的EcR具有此結(jié)構(gòu)域，存在于α-螺旋12的后方，為不保守的序列。在昆蟲中，不同昆蟲的F結(jié)構(gòu)域長度有著明顯的不一致。在黑腹果蠅中，保留F結(jié)構(gòu)域的EcR與去掉F域EcR具有一樣的轉(zhuǎn)錄激活能力，此結(jié)果表明F結(jié)構(gòu)域不是EcR行使其轉(zhuǎn)錄功能的必須結(jié)構(gòu)。昆蟲的USP就不具有此結(jié)構(gòu)(Huetal., 2003)。此結(jié)構(gòu)域可能參與配基的精確識別和抑制因子的招募(Ruseetal., 2002)。

圖3 EcR和USP的結(jié)構(gòu)示意圖(Hill et al., 2012)Fig.3 Structure of ecdysone receptor and ultraspiracle

僅當(dāng)EcR單獨(dú)存在時，不同的蛻皮激素是不能與其結(jié)合的，只有當(dāng)USP與EcR形成復(fù)合體時，蛻皮激素才能與二者的復(fù)合體結(jié)合。USP與EcR的結(jié)構(gòu)類似，在N末端具有高度可變區(qū)，具有轉(zhuǎn)錄激活作用；DNA結(jié)合區(qū)具有豐富的半胱氨酸和鋅指結(jié)構(gòu)，它能順DNA螺旋旋轉(zhuǎn)并與之結(jié)合；在C末端具有激素結(jié)合區(qū)，能夠與配基結(jié)合、與熱休克蛋白結(jié)合、使受體二聚化和轉(zhuǎn)錄激活的作用；具有鉸鏈區(qū)，是短序列，或有與轉(zhuǎn)錄因子相作用和啟動受體合體向核內(nèi)移動的功能。最近的USP構(gòu)象研究發(fā)現(xiàn)，其存在一個開放的、空閑的配體結(jié)合帶袋(Renetal., 2014)。USP在昆蟲體內(nèi)有兩種亞型，分別是USP1和USP2，果蠅中僅有1種亞型存在，在一些鱗翅目、直翅目、鞘翅目等昆蟲中已經(jīng)鑒定出來有兩種USP亞型。

1.2 不同昆蟲的EcR蛋白序列對比

昆蟲的變態(tài)發(fā)育主要分為完全變態(tài)和不完全變態(tài)發(fā)育，大多數(shù)的昆蟲都屬于這兩種類型的變態(tài)發(fā)育。在這兩種變態(tài)類型中選取了不完全變態(tài)的東亞飛蝗Locustamigratoriamanilensis(Meyen)、白背飛虱Sogatellafurcifera和完全變態(tài)的小菜蛾P(guān)lutellaxylostella、黑腹果蠅Drosophilamelanogaster。在NCBI下載其EcR的蛋白序列，用DNAMAN進(jìn)行蛋白序列對比，結(jié)果如圖4所示。這四種昆蟲的EcR蛋白序列有一定的相似性，在DNA結(jié)合域和配體結(jié)合域的序列高度相似，A/B域相似度不高的原因可能是因為所選取的EcR蛋白不是同一個亞型。到底是哪個區(qū)域決定了昆蟲的兩種變態(tài)發(fā)育類型目前還不清楚。

圖4 4種昆蟲EcR蛋白序列對比 Fig.4 EcR protein sequence alignment of four insects

將4種蛋白的序列進(jìn)行同源性分析，結(jié)果如圖5所示。東亞飛蝗和白背飛虱的同源性為65%，小菜蛾和黑腹果蠅的同源性為55%，兩種類型變態(tài)的昆蟲為51%，說明同種類型變態(tài)的昆蟲的EcR蛋白結(jié)構(gòu)在一定程度上具有較高的相似度。

圖5 4種昆蟲EcR蛋白序列同源性分析Fig.5 EcR protein sequence homology analysis of four insects

2 蛻皮激素受體的作用方式與功能

昆蟲的EcR在調(diào)控昆蟲的生長發(fā)育、變態(tài)和繁殖等生命過程處在關(guān)鍵的啟動位置。在現(xiàn)有的節(jié)肢動物核受體的研究中，昆蟲EcR是唯一已知配體的核受體，EcR的配體為蛻皮激素。昆蟲的蛻皮激素是一類類固醇激素的總稱，包括20E、百日青甾酮(PonA)、α-蛻皮酮以及β-蛻皮酮等，與EcR作用的天然蛻皮激素的活性形式為20E(趙小凡，2010)。

Yao等(1993)證明EcR與DNA及配體(如20E)有很高的親和性，僅當(dāng)EcR和USP結(jié)合形成異二聚體時，蛻皮激素才能結(jié)合到EcR上，形成20E-EcR/USP復(fù)合體。EcR/USP復(fù)合體與其他二型受體不同之處在于它們同激素的結(jié)合方式，單獨(dú)EcR和USP是不能與激素結(jié)合的，只有兩者的復(fù)合物才能與不同的蛻皮激素結(jié)合；該結(jié)合具有選擇性和特異性，這些特性是由EcR決定的，并不是由二者的復(fù)合體決定的。不少研究都證明EcR的突變會影響特異性結(jié)合；USP的結(jié)合域的功能僅僅是促進(jìn)激素的結(jié)合。

EcR、USP和蛻皮激素形成的復(fù)合體再與靶標(biāo)基因啟動子的蛻皮激素應(yīng)答元件EcRE結(jié)合，并啟動一系列級聯(lián)反應(yīng)。當(dāng)20E存在時，其與EcR結(jié)合導(dǎo)致抑制蛋白被激活蛋白抑制，從而激活轉(zhuǎn)錄；當(dāng)20E不存在時，EcR和USP形成的雜二聚體，雖然能結(jié)合到蛻皮酮反應(yīng)基因的啟動子區(qū)域，但是由于一組抑制蛋白存在，使得前后基因的轉(zhuǎn)錄沒有激活。20E一旦進(jìn)入EcR配體結(jié)合域的配體結(jié)合袋，其構(gòu)象立即發(fā)生變化，與共阻遏子分離且與共激活子相作用，開始靶基因的轉(zhuǎn)錄(Kolchanovetal., 1999)。啟動靶基因的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后，EcR立即與蛻皮激素分離，下游基因開始表達(dá)，昆蟲得以正常地完成整個蛻皮過程。

埃及伊蚊Aedesaegypti點(diǎn)突變的實(shí)驗表明，EcR對蛻皮激素有專一性，埃及伊蚊EcR529位的苯丙氨酸是決定依賴于配體的DNA結(jié)合活性和配體專一性的關(guān)鍵點(diǎn)。同時，EcR的空間結(jié)構(gòu)有很強(qiáng)的適應(yīng)性和柔韌性，使得其能與USP結(jié)合后起著穩(wěn)定LBD空間結(jié)構(gòu)的作用(Renetal., 2014)。

昆蟲蛻皮激素與EcR的作用方式非常的保守。對鱗翅目、鞘翅目和雙翅目等的昆蟲的異二聚體EcR/USP與天然的蛻皮激素如百日青甾酮結(jié)合形成的復(fù)合體的配體結(jié)合域的晶體結(jié)構(gòu)時發(fā)現(xiàn)，EcR與百日青甾酮或蛻皮激素類類似物雙酰肼類先導(dǎo)化合物結(jié)合的形狀和配體的結(jié)合位點(diǎn)幾乎一致，形成范德華力的氨基酸種類和順序也幾乎一致(Piotretal., 2006)。

由于EcR、USP和EcR/USP與20E相互作用時在亞細(xì)胞水平研究的較少，相關(guān)文獻(xiàn)也鮮有報道，所以目前對它們在亞細(xì)胞水平的分布不是很了解。從這兩年的在亞細(xì)胞水平的定位研究顯示，EcR在經(jīng)過20E的作用后就會大量的進(jìn)入細(xì)胞核和部分的進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，USP則主要在細(xì)胞核中起作用(Huangetal., 2015)。

EcR和USP在昆蟲的生長發(fā)育、變態(tài)和繁殖方面有著重要作用。EcR在各個發(fā)育時期的脂肪體、卵巢、前胸腺和表皮等多個組織中有所表達(dá)。與大多數(shù)的基因一樣，EcR與USP在昆蟲的不同發(fā)育的時期或在不同的組織中具有不同的表達(dá)特征，說明其在這些時期或者組織中有著不同的功能(Heetal., 2015)。

20E最初的靶標(biāo)是蛻皮激素受體基因EcR，DmEcR基因的表達(dá)產(chǎn)物與DmUSP表達(dá)的產(chǎn)物結(jié)合，從而介導(dǎo)20E的許多調(diào)節(jié)功能。DmEcR基因編碼兩個蛋白亞型，EcR-A、EcR-B1和EcR-B2，EcR-A和EcR-B是選擇性啟動造成的，EcR-B1和EcR-B2是選擇性剪切造成的。在昆蟲的變態(tài)發(fā)育中，DmEcR-A和DmEcR-B1會分別在不同的時期和在不同的組織中表達(dá)，這是因為20E作用的空間特異性。EcR蛋白在成蟲體內(nèi)組織中是廣泛存在的，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)、脂肪體、腸以及雄雌蟲的生殖器官中。

對EcR不同亞型的研究發(fā)現(xiàn)，EcR-A只有很微弱的轉(zhuǎn)錄激活作用，而EcR-B是有效的配體調(diào)控的轉(zhuǎn)錄激活因子，蛻皮激素主要與EcR-B1受體結(jié)合，直接調(diào)控一小部分早期基因的轉(zhuǎn)錄。在果蠅的胚胎發(fā)育時期，EcR在胚帶收縮和頭部卷繞這兩個過程中有著十分重要的作用。EcR-A的缺失或者突變會使得果蠅在蛹的中期發(fā)育停滯(Davisetal., 2005)，表明EcR-A在體軸形成后且成體分化前是必須的結(jié)構(gòu)。通過基因手段使得EcR-B1位點(diǎn)的突變，所有的試驗果蠅幼蟲不能正常的進(jìn)入蛹期，但EcR-B1和EcR-B2兩個位點(diǎn)同時突變，大部分果蠅的發(fā)育停滯在幼蟲期，大部分果蠅的生長受阻，不能正常的進(jìn)入蛹期(Maves and Schubiger, 1998)，說明EcR-B1是昆蟲完成正常變態(tài)發(fā)育所必須的結(jié)構(gòu)(Sustar and Schubiger, 2005)。不同昆蟲或不同時期的占主要表達(dá)的EcR同工體在不同的昆蟲中表達(dá)是有很大差異的，例如，在鱗翅目昆蟲如家蠶BombyxmoriLinnaeus和煙草天蛾Manducasexta的EcR-B1主要在幼蟲中表達(dá)(Tan and Palli, 2008)，果蠅的EcR-B1主要在幼蟲組織中表達(dá)，EcR-A主要在成蟲盤表達(dá)，在鞘翅目昆蟲馬鈴薯甲蟲中的EcR-A在幼蟲中比EcR-B1表達(dá)的要多的多(Tanihara, 2009)。EcR-B2在果蠅的馬氏管的形成和發(fā)育起著重要作用(Gautametal., 2015)。

EcR與不同的USP亞型結(jié)合形成不同的異二聚體，發(fā)揮著相同或不相同的功能。USP能與EcR-B1亞型形成異二聚體，USP在此復(fù)合體中不行使任何的轉(zhuǎn)錄激活功能，它的作用僅僅是對EcR產(chǎn)生異構(gòu)效應(yīng)，加強(qiáng)了EcR與DNA和20E結(jié)合的活性。在沒有配體情況下，USP能夠行使阻遏蛋白的功能(Ying and Dufau, 2004)。也有研究表明，在變態(tài)早期缺少USP的條件下，轉(zhuǎn)錄才能正常發(fā)生，說明在20E表態(tài)過程中，只有在去除阻遏因子，USP才能使得昆蟲正常的完成變態(tài)發(fā)育。USP基因的突變或缺失會使得昆蟲不能正常完成變態(tài)發(fā)育，例如成蟲盤的分化和中腸的形成都不能正常完成。母系的USP基因缺失的胚胎會在胚胎發(fā)育后期出現(xiàn)胚胎絨毛膜缺陷而致死的現(xiàn)象，而合子的USP基因的缺失會導(dǎo)致大部分試驗昆蟲在幼蟲時期就死亡，存活幼蟲則會在二齡期會多長出一對尾部氣門(Oroetal., 1992)，表明一齡幼蟲在的表皮在蛻皮時發(fā)生缺陷。

EcR和USP在昆蟲的神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)調(diào)控方面發(fā)揮著重要的作用。在果蠅的神經(jīng)發(fā)育中，在煙草天蛾和果蠅的研究中，發(fā)現(xiàn)在其變態(tài)發(fā)育中，神經(jīng)元的重組需要EcR-B1的表達(dá)。在神經(jīng)膠質(zhì)和神經(jīng)元中，特別是蕈形體軸突修剪階段，EcR是必不可少的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件。蕈形體在果蠅的大腦中是非常重要的結(jié)構(gòu)，控制果蠅的嗅覺和記憶。γ神經(jīng)元是蕈形體重的一個重要結(jié)構(gòu)，在重組階段之前，EcR-B1能在γ 神經(jīng)元中表達(dá)病控制其的修剪(Leeetal., 2000)。EcR或USP的基因缺失，會導(dǎo)致果蠅翅的感覺神經(jīng)元過早的分化；果蠅眼部和神經(jīng)元的發(fā)育會受到抑制(Schubiger and Truman, 2000)。

在昆蟲的生長發(fā)育中，必然有著新組織的生長和衰老組織的程序性死亡，現(xiàn)已證實(shí)，一部分的核受體基因，包括昆蟲的EcR，會參與調(diào)控細(xì)胞的程序性死亡。程序性死亡在腹側(cè)神經(jīng)元中已經(jīng)被報道，并且受到EcR-A表達(dá)的調(diào)節(jié)(Robinowetal., 1993)。EcR-B1和EcR-B2能調(diào)控肽能神經(jīng)元的程序性死亡，并且能誘導(dǎo)視神經(jīng)葉的程序性死亡(Choietal., 2006)。在對昆蟲EcR研究的深入，以及對核受體家族成員的深入研究，能夠?qū)θ说暮耸荏w方面研究會有啟示，EcR在神經(jīng)方面的研究會使得人類在止疼藥方面的研究有所進(jìn)展。

3 EcR研究的問題與展望

3.1 EcR在害蟲防治研究展望

昆蟲不能正常的完成變態(tài)發(fā)育，不能完成蛻皮，幼蟲就不能發(fā)育成健康的成蟲，而是變成沒有生命力的、取食量低的和不能繁殖的個體。因此，利用藥物阻斷昆蟲的正常生命過程，如阻斷其蛻皮過程，就能達(dá)到控制害蟲種群的目的。通過測定新化合物與EcR/USP的親和性來確定其殺蟲活性的大小，能提供一種新的殺蟲活性物質(zhì)的篩選新方式，此方法不僅技術(shù)體系快速、準(zhǔn)確、靈敏，而且可以高通量篩選和長期使用。將蛻皮激素接受子HHR3重組到苜蓿銀紋夜蛾Autographacaliforica多角體病毒中，構(gòu)建了綠色熒光蛋白標(biāo)記和多角體蛋白包裝的基因重組病毒，可將其通過消化道感染棉鈴蟲，導(dǎo)致棉鈴蟲的幼蟲生長緩慢、不能正常蛻皮和種群數(shù)量下降(Shaoetal., 2007)。蛻皮激素類似物RH-2485可以促進(jìn)棉鈴蟲致死性脫皮，能夠在實(shí)驗室和田間試驗有良好的控制種群的效果(Zhaoetal., 2003)。

雖然對棉鈴蟲的EcR研究不是很透徹，但有研究者依舊在植物源的殺菌劑中尋找了一些檸檬苦素類似物，并與商業(yè)化的殺蟲劑蟲酰肼通過硅片法對比。結(jié)果表示試驗中所用的6種植物源化合物都能夠與棉鈴蟲的EcR配基結(jié)合與的活性位點(diǎn)結(jié)合。其結(jié)合能從-10.54～12.22 kcal/mol超過了昆蟲生長調(diào)節(jié)劑和蟲酰肼RH5992。在結(jié)合作用中有兩個因子非常重要，一是殘基Cys508和Asn504，在氫鍵作用很常見。二是疏水袋殘基Asn504、Met507、Val416、Tyr408和Thr343。研究者還發(fā)現(xiàn)一個芳香環(huán)3-7附近的受體和1-3末端的疏水基有最低的藥效特征。通過對EcR的天然類似物的研究能幫助我們在利用天然化合物在害蟲的化學(xué)防治提供環(huán)境友好型的和對人類無毒、低毒的藥物(Yadavetal., 2015)，能夠更好的控制農(nóng)業(yè)害蟲和人類疾病治療相關(guān)藥物的研發(fā)。

昆蟲EcR啟動轉(zhuǎn)錄的功能可以被用作研究轉(zhuǎn)基因表達(dá)調(diào)控開關(guān)。EcR配體結(jié)合袋內(nèi)不同位點(diǎn)氨基酸突變導(dǎo)致的對不同類型化合物的不同反應(yīng)能夠用來開發(fā)多基因調(diào)控系統(tǒng)?；诶ハxEcR建立的基因開關(guān)在轉(zhuǎn)基因動物身上有著十分有價值的研究前景，受體和配體都是外源，可以安全、準(zhǔn)確的調(diào)控基因表達(dá)，對哺乳動物無害。黑腹果蠅DmEcR和PonA建立的基因開關(guān)早已成功在哺乳動物細(xì)胞中利用(劉永杰等，2007)。

本課題組研究發(fā)現(xiàn)，生防菌綠僵菌的代謝產(chǎn)物綠僵菌素A與家蠶的EcR可能具有結(jié)合力。通過模擬對接等相關(guān)試驗的分析，綠僵菌素A很可能與家蠶的EcR結(jié)合，但能否結(jié)合或具體的結(jié)合位點(diǎn)還需要進(jìn)一步的研究和證明。此研究能夠更進(jìn)一步的闡明EcR的作用方式和綠僵菌素A在昆蟲體內(nèi)的靶標(biāo)確認(rèn)，且為EcR在生物農(nóng)藥的發(fā)展中提供新思路。

深入了解EcR的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機(jī)制和探索一些能與EcR和USP結(jié)合的新化合物，使得EcR的研究在農(nóng)業(yè)和醫(yī)學(xué)上有潛在的價值。20E拮抗劑和類似物能與EcR/USP復(fù)合體相互作用，是有效的昆蟲生長調(diào)節(jié)劑，并且此類物質(zhì)對動物低毒且對環(huán)境具有安全性，使得它能在在農(nóng)業(yè)害蟲防治方面有應(yīng)用；在桑葉中加入20E能夠縮短上蔟時間，能在蠶絲生產(chǎn)上大大的縮短時間；并且在人類醫(yī)學(xué)藥物的研制方面也有應(yīng)用，為新藥的研發(fā)提供堅實(shí)的理論基礎(chǔ)，并且EcR/USP的基因開關(guān)逐漸在臨床上開始嘗試(李康等，2011)。

也許在未來的發(fā)展中利用果蠅、家蠶等模式昆蟲的功能基因組與遺傳研究成果繼續(xù)深入研究蛻皮激素EcR/USP的生物作用，并將基因組和轉(zhuǎn)基因方法應(yīng)用到其他昆蟲EcR/USP的研究中。通過大量構(gòu)建EcR和(或)USP模型進(jìn)行活體和離體實(shí)驗，以深入研究EcR/USP的功能和級聯(lián)調(diào)控機(jī)理。相信在不久的將來昆蟲EcR/USP的應(yīng)用價值會以全新的面貌呈現(xiàn)在我們的面前。

3.2 目前EcR和USP研究的問題

近些年，由于EcR的研究價值不斷升高，越來越多的學(xué)者選擇其進(jìn)行研究，研究的深度和廣度都比以前擴(kuò)大了。越來越多的昆蟲的EcR基因的序列被克隆，結(jié)構(gòu)功能被闡明的越來越透徹，從最初的模式昆蟲雙翅目的果蠅EcR的深入研究，到現(xiàn)在鱗翅目、鞘翅目、同翅目和直翅目的部分昆蟲也在漸漸地被科學(xué)工作者研究。雖然人們對EcR和USP的研究逐漸增多，對EcR的調(diào)控機(jī)理逐漸清晰，但還是有大量問題需要解決。對EcR和USP的克隆測序和結(jié)構(gòu)功能的研究主要集中在鱗翅目和雙翅目，其他目的昆蟲如。昆蟲的EcR處在昆蟲的發(fā)育、變態(tài)和繁殖等重要生命過程的級聯(lián)調(diào)控的其實(shí)位置，具有種類或類群的特異性，今后還要更加全面的描述各種各類昆蟲的EcR和USP的結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)，才能更加全面的深入了解。

對EcR和USP的分布還不是太了解，對EcR和USP在和20E相互作用時在細(xì)胞中的亞細(xì)胞水平的分布也還不是很了解，對各個亞型的分布還需要更深入研究；USP的定位至今還未被確定。各個亞型在不同昆蟲或不同時期的作用還需要進(jìn)行深入的探索，EcR-B2在昆蟲變態(tài)發(fā)育中的作用了解的還不是很透徹，還需要更精確的基因手段來確定它們的作用。只有在明確USP的自然配體之后，才能清楚USP的真實(shí)作用。研究EcR和USP的表達(dá)控制不僅對于了解昆蟲內(nèi)分泌調(diào)控具有有重要的作用意義，還對了解蛻皮激素和保幼激素與其他生物過程的相互作用有意義。此外，細(xì)胞內(nèi)蛋白和蛻皮激素滴度、代謝速率以及促進(jìn)因子的親和性等轉(zhuǎn)錄水平的影響也還不確定。這些問題對于轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建，特別是轉(zhuǎn)基因開關(guān)的利用是至關(guān)重要的。

References)

Bergman T, Henrich VU, Lezzi M.Ligand control of interactioninvivobetween ecdysteroid receptor and ultraspiracle ligand-binding domain [J].BiochemicalJournal, 2004, 378 (Pt 3): 779-784.

Billas IML, Thomas I, Jean-Marie G,etal.Structural adaptability in the ligand-binding pocket of the ecdysone hormone receptor [J].Nature, 2003, 426 (6962): 91-96.

Choi YJ, Lee G, Park JH.Programmed cell death mechanisms of identifiable peptidergic neurons inDrosophilamelanogaster[J].Development, 2006, 133 (11): 2223-2232.

Davis MB, Carney GE, Robertson AE,etal.Phenotypic analysis of EcR-A mutants suggests that EcR isoforms have unique functions duringDrosophiladevelopment [J].DevelopmentalBiology, 2005, 282 (2): 385-396.

Gautam NK, Verma P, Tapadia MG.Ecdysone regulates morphogenesis and function of malpighian tubules inDrosophilamelanogasterthrough EcR-B2 isoform [J].DevelopmentalBiology, 2014, 398 (2): 163-176.

He H, Xi G, Lu X.Molecular cloning, characterization, and expression analysis of an ecdysone receptor homolog inTeleogryllusemma(Orthoptera: Gryllidae) [J].JournalofInsectScience, 2015, 15 (1): 22.

Henrich VC, Sliter TJ, Lubahn DB,etal.A steroid/thyroid hormone receptor superfamily member inDrosophilamelanogasterthat shares extensive sequence similarity with a mammalian homologue [J].NucleicAcidsResearch, 1990, 18 (14): 4143-4148.

Hill RJ, Billas IML, Bonneton F,etal.Ecdysone receptors: From the Ashburner model to structural biology [J].AnnualReviewofEntomology, 2013, 58 (1): 846-852.

Hu X, Cherbas L, Cherbas P.Transcription activation by the ecdysone receptor (EcR/USP):Identification of activation functions [J].MolecularEndocrinology, 2003, 17 (4): 716-731.

Huang LX, Gong YG, Gu J,etal.Expression, subcellular localization and protein-protein interaction of four isoforms of EcR/USP in the common cutworm [J].InsectScience, 2015, 22 (1): 95-105.

Jindra M, Malone F, Hiruma K,etal.Developmental profiles and ecdysteroid regulation of the mRNAs for two ecdysone receptor isoforms in the epidermis and wings of the tobacco hornworm,Manducasexta[J].Developmentalbiology, 1996, 180 (1): 258-272.

King-Jones K, Thummel CS.Nuclear receptors-a perspective fromDrosophila[J].NatureReviewsGenetics, 2005, 6 (4): 311-323.

Kolchanov NA, Ananko EA, Podkolodnaya OA,etal.Transcription Regulatory Regions Database (TRRD): Its status in 1999 [J].HydrotechnicalConstruction, 1978, 12 (11): 1084-1087.

Lee T, Marticke S, Sung C,etal.Cell-autonomous requirement of the USP/EcR-B ecdysone receptor for mushroom body neuronal remodeling inDrosophila[J].Neuron, 2000, 28 (3): 807-818.

Li K, Li S, Cao Y.Transcriptional regulation by 20-hydroxyecydsone and its nuclear receptor EcR-USP [J].ActaEntomologicaSinica, 2011, 54 (8): 933-937.[李康, 李勝, 曹陽.蛻皮激素與其受體EcR-USP的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制[J].昆蟲學(xué)報, 2011, 54 (8): 933-937]

Liu YJ, Xu PJ, Li YW,etal.Progress in ecdysone receptor (EcR) and insecticidal mechanisms of ecdysteroids [J].ActaEntomologicaSinica, 2007, 50 (1): 67-73.[劉永杰, 徐蓬軍, 李艷偉, 等.昆蟲蛻皮激素受體及其類似物的殺蟲機(jī)制研究進(jìn)展[J].昆蟲學(xué)報, 2007, 50 (1): 67-73]

Marek O, Monika S, Agnieszka K,etal.Plasticity of the ecdysone receptor DNA binding domain [J].MolecularEndocrinology, 2004, 18 (9): 2166-2184.

Maves L, Schubiger G.A molecular basis for transdetermination inDrosophilaimaginal discs:Interactions between wingless and decapentaplegic signaling [J].Development, 1998, 125 (1): 115-124.

Niedziela-Majka A, Kochman M, Andrzej O.Polarity of the ecdysone receptor complex interaction with the palindromic response element from thehsp27 gene promoter [J].EuropeanJournalofBiochemistry, 2000, 267 (2): 507-519.

Oro AE, Mckeown M, Evans RM.The Drosophila retinoid X receptor homolog ultraspiracle functions in both female reproduction and eye morphogenesis [J].Development, 1992, 115 (2): 449-462.

Piotr D, Iwona G, Tomasz K,etal.The DNA-binding domain of the ultraspiracle drives deformation of the response element whereas the DNA-binding domain of the ecdysone receptor is responsible for a slight additional change of the preformed structure [J].Biochemistry, 2006, 45 (3): 668-675.

Ren B, Peat TS, Streltsov VA,etal.Unprecedented conformational flexibility revealed in the ligand-binding domains of theBovicolaovisecdysone receptor (EcR) and ultraspiracle (USP) subunits [J].ActaCrystallographica, 2014, 70 (7): 1954-1964.

Robinow S, Talbot WS, Hogness DS,etal.Programmed cell death in theDrosophilaCNS is ecdysone-regulated and coupled with a specific ecdysone receptor isoform [J].Development, 1994, 119 (4): 1251-1259.

Ruse MD, Privalsky ML, Sladek FM.Competitive cofactor recruitment by orphan receptor hepatocyte nuclear factor 4alpha1:Modulation by the F domain [J].Molecular&CellularBiology, 2002, 22 (6): 1626-1638.

Schubiger M, Truman J.The RXR ortholog USP suppresses early metamorphicprocesses inDrosophilain the absence of ecdysteroids [J].Development, 2000, 127 (6): 1151-1159.

Shao H, Dong DJ, Mang X,etal.Reconstruction of AcMNPV withHelicoverpahormone receptor 3 and its effect on theHelicoverpalarvae [J].BiocontrolScience&Technology, 2007, 17 (1): 95-104.

Sustar A, Schubiger G.A transient cell cycle shift inDrosophilaimaginal disc cells precedes multipotency [J].Cell, 2005, 120 (3): 383-93.

Tan A, Palli SR.Edysone receptor isoforms play distinct roles in controlling molting and metamorphosis in the red flour beetle,Triboliumcastaneum[J].Molecular&CellularEndocrinology, 2008, 291 (1-2): 42-49.

Tanihara O.Examination of the anti-monopoly law of the People’s Republic of China : Analysis from a viewpoint of the anti-monopoly laws of Japan & U.S.A [J].AoyamaLawReview, 2009, 50 (16): 4114-4128.

Tran HT, Askari HB, Shaaban S,etal.Reconstruction of ligand-dependent transactivation ofChoristoneurafumiferanaecdysone receptor in yeast [J].MolecularEndocrinology, 2001, 15 (7): 1140-1153.

Vanacker JM, Delmarre C, Guo X,etal.Activation of the osteopontin promoter by the orphan nuclear receptor estrogen receptor related alpha [J].CellGrowth&DifferentiationtheMolecularBiologyJournaloftheAmericanAssociationforCancerResearch, 1998, 9 (12): 1007-1014.

V?gtli M, Elke C, Imhof MO,etal.High level transactivation by the ecdysone receptor complex at the core recognition motif [J].NucleicAcidsResearch, 1998, 26 (10): 2407-2414.

Wickert L, Selbig J.Structural analysis of the DNA-binding domain of alternatively spliced steroid receptors[J].JournalofEndocrinology, 2002, 173 (3): 429-436.

Yadav RP, Ibrahim KS, Gurusubramanian G,etal.In silico docking studies of non-azadirachtin limonoids against ecdysone receptor ofHelicoverpaarmigera(Hübner) (Lepidoptera: Noctuidae) [J].MedicinalChemistryResearch, 2015, 24 (6): 1-11.

Yao TP, Forman BM, Jiang Z,etal.Functional ecdysone receptor is the product of EcR and Ultraspiracle genes [J].Nature, 1993, 366 (6454): 476-479.

Ying Z, Dufau ML.Genesilencing by nuclear orphan receptors [J].Vitamins&Hormones, 2004, 68 (6): 1-48.

Zhao XF, Li ZM, Wang JX,etal.Efficacy of RH-2485, a new non-steroidal ecdysone agonist, against the cotton boll worm;Helicoverpaarmigera(Lepidoptera: noctuidae) in the laboratory and field [J].CropProtection, 2003, 22 (7): 959-965.

Zhao XF.Progress in insect molting hormone signaling transduction pathways [J].ChineseBulletinofLifeSciences, 2010 (12): 1208-1214.[趙小凡.昆蟲蛻皮激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑研究進(jìn)展[J].生命科學(xué), 2010 (12): 1208-1214]

A review of ecdysone receptor

WANG Jing-Jing, HU Qiong-Bo*

(Department of Pesticide, College of Agriculture, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

Molting hormone is one of steroid hormone and its active form is 20-hydroxyecdysone.In the process of development of insect, ecdysis, metamorphosis and reproduction are regulated and controlled by molting hormone.Ecdysone and ultraspiracle belong to nuclear receptor and have the same structural characteristic which include transactivation domain, DNA-binding domain, hinge region, ligand binding domain and F region.EcR locate in promoter region in the cascade reaction of ecdysis, metamorphosis and reproduction of insect and play a significant role in these processes.Molting hormone interact with heterodimer composed of EcR and USP and start cascade reaction.This paper introduce the structure and function of EcR and USP, mechanism of interaction with molting hormone and application of EcR in agricultural pest control and so on.We discuss the problems that study in EcR and research prospect in future.

Ecdysone receptor (EcR); ultraspiracle protein (USP); nuclear receptor (NR); 20-hydroxyecdysone (20E); heterodimer

王菁菁，胡瓊波.昆蟲蛻皮激素受體研究進(jìn)展[J].環(huán)境昆蟲學(xué)報，2017,39(3):721-729.

公益性行業(yè)(林業(yè))科研專項資金項目(201304408)

王菁菁，女，1993年生，碩士研究生，E-mail: wangjingjing968@126.com

*通訊作者Author for correspondence，E-mail: hqbscau@126.com

Received: 2016-04-08；接受日期Accepted: 2017-01-26

Q963;Q965

A

1674-0858(2017)03-0721-09