基于轉(zhuǎn)錄組的沙棘木蠹蛾簡單重復(fù)序列特征分析

崔明明，陶 靜，宗世祥

基于轉(zhuǎn)錄組的沙棘木蠹蛾簡單重復(fù)序列特征分析

崔明明，陶 靜，宗世祥*

(北京林業(yè)大學(xué)林木有害生物防治北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083)

為開發(fā)沙棘木蠹蛾微衛(wèi)星信息，利用已獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對其EST-SSR位點(diǎn)進(jìn)行發(fā)掘，進(jìn)而分析其特征。結(jié)果發(fā)現(xiàn)含SSR的序列5126條，識別的SSR總數(shù)為7499個，SSR出現(xiàn)頻率為51.41%。微衛(wèi)星序列主要以單堿基重復(fù)為主，發(fā)生頻率為39.52%。研究共發(fā)現(xiàn)77種堿基重復(fù)基元，所占比例最高的為(A/T)n(73.74%)，其次是(AT/AT)n(3.37%)。微衛(wèi)星多為重復(fù)次數(shù)為10且長度為10 bp的短序列。研究結(jié)果為沙棘木蠹蛾的SSR分子標(biāo)記研究，遺傳多樣性分析，種群遺傳結(jié)構(gòu)以及關(guān)鍵性狀基因的發(fā)掘等研究奠定基礎(chǔ)。

沙棘木蠹蛾；轉(zhuǎn)錄組；微衛(wèi)星

簡單重復(fù)序列(simple sequence repeat，SSR)又稱作微衛(wèi)星(microsatellites)，普遍存在于真核生物基因組，是由若干個堿基組成的簡單串聯(lián)重復(fù)序列。SSR標(biāo)記是分子標(biāo)記手段的一種。現(xiàn)有常用的分子標(biāo)記手段，包括RFLP，RAPD，ISSR，AFLP，SSR，SNPs等，都各有其優(yōu)缺點(diǎn)(閆華超等，2006)，相比之下，SSR標(biāo)記具有數(shù)量豐富、分布廣泛、共顯性遺傳、多態(tài)性豐富等特點(diǎn)，且試驗(yàn)成本低，結(jié)果相對穩(wěn)定，操作簡單，是遺傳學(xué)背景研究非常有效的工具，被公認(rèn)為是遺傳學(xué)研究中最理想的分子標(biāo)記手段之一(Liuetal., 2013)，已被廣泛應(yīng)用于種群遺傳多樣性分析、動植物分類和進(jìn)化、遺傳圖譜的構(gòu)建、基因定位和克隆、分子標(biāo)記輔助育種、品種鑒定等領(lǐng)域(Lietal., 2002；Varshneyetal., 2005)。

SSR按來源分，有基因組SSR(g-SSR)和轉(zhuǎn)錄組來源的SSR(EST-SSR)(王東等，2014)。與g-SSR相比，EST-SSR標(biāo)記無需構(gòu)建基因組文庫、雜交、測序，避免了大量人力、物力和時間的投入，同時EST反映了基因組的編碼區(qū)域，直接獲得生物個體基因表達(dá)信息，因此EST-SSR多態(tài)性可能與基因功能直接相關(guān)(Eujayletal., 2002)。目前，昆蟲中已有黑翅土白蟻Odontotermesformosanus(Huangetal., 2012)、煙粉虱Bemisiatabaci(Xieetal., 2012)，細(xì)梢小卷蛾Rhyacionialeptotubula(Zhuetal., 2013)、黃粉蟲Tenebriomolitor(Zhuetal., 2013)、扶桑綿粉蚧Phenacoccussolenopsis(羅梅等，2014)、云南切梢小蠹Tomicusyunnanensis(袁遠(yuǎn)等，2014)、綠豆象Callosobruchuschinensis(Duanetal., 2014)、粘蟲Mythimnaseparate(胡艷華等，2015)、溝眶象Eucryptorrhynchuschinensis(武政梅等，2016)等借助現(xiàn)有的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)成功開發(fā)了EST-SSR。

沙棘木蠹蛾Eogystiahippophaecolus(Huaetal., 1990)是我國重要的鉆蛀性害蟲，主要分布在內(nèi)蒙、遼寧、山西、陜西、寧夏和甘肅等地，以幼蟲鉆蛀并取食沙棘Hippophaerhamnoides的根部和干部進(jìn)行危害，可導(dǎo)致沙棘整株枯死，嚴(yán)重影響了沙棘林的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)效益(路常寬等，2004；宗世祥等，2005a，2005b，2005c)。目前，有關(guān)沙棘木蠹蛾的研究主要在生物學(xué)生態(tài)學(xué)特性，災(zāi)害監(jiān)測和控制技術(shù)策略上，關(guān)于該昆蟲遺傳信息的研究僅見陶靜等利用AFLP分子標(biāo)記分析其種群遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)的報道(Taoetal., 2012)。沙棘木蠹蛾SSR分子標(biāo)記的開發(fā)，能進(jìn)一步揭示沙棘木蠹蛾的遺傳背景。此外，本課題組已經(jīng)完成了對沙棘木蠹蛾的轉(zhuǎn)錄組測序及組裝，得到了質(zhì)量較高的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，為開發(fā)EST-SSR提供了豐富的資源。為此，本研究基于沙棘木蠹蛾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)掘SSR位點(diǎn)，分析其組成及分布特征，為進(jìn)一步利用SSR分子標(biāo)記分析其種群間的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳分化以及構(gòu)建遺傳圖譜奠定基礎(chǔ)，也將為其功能基因的開發(fā)利用、比較基因組學(xué)的研究等提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

1.1.1 供試蟲源與處理

沙棘木蠹蛾幼蟲采自中國東北部遼寧省建平縣。經(jīng)過72 h的饑餓處理，用無菌水清洗干凈蟲體，液氮速凍后存于-80℃冰箱。利用液氮研磨法磨碎昆蟲樣本，用TRIzol法提取RNA，使用RNeasy Plus Mini Kit(No.74134；Qiagen，Hilden，Germany)試劑盒。提取的RNA用Nanodrop 8000(Thermo，Waltham，MA，USA)檢測濃度和A260/A280的值，經(jīng)檢測合格的樣品進(jìn)行下一步的測序工作。

1.1.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來源

測序工作由北京百邁克生物科技有限公司完成。原始數(shù)據(jù)已上傳到Sequence Read Archive(SRA)數(shù)據(jù)庫，登錄號為SRR4409152。

1.1.3 沙棘木蠹蛾EST-SSR的篩選

利用MISA軟件(MicroSAtellite identification tool, http://www.pgrc.Ipk-gatersleben.de/misa/)，對篩選得到的1 kb以上的Unigene序列進(jìn)行SSR位點(diǎn)搜索和分析。所檢測SSR位點(diǎn)包括單堿基重復(fù)、二堿基重復(fù)、三堿基重復(fù)、四堿基重復(fù)、五堿基重復(fù)和六堿基重復(fù)6類。篩選標(biāo)準(zhǔn)為單堿基重復(fù)至少10次，二堿基重復(fù)至少6次，三堿基至六堿基的最少重復(fù)均為5次。復(fù)合SSR兩個位點(diǎn)間最大間隔堿基數(shù)為100。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙棘木蠹蛾EST-SSR位點(diǎn)的數(shù)量與分布

對篩選得到的1 kb以上的Unigene共14587條序列進(jìn)行SSR分析。結(jié)果，包含SSR的序列有5126條，識別的SSR總數(shù)為7499個，其中3497條 Unigene只包含單個SSR位點(diǎn)，有1629條序列包含1個以上的SSR的序列。SSR發(fā)生頻率(含有SSR的Unigene數(shù)目與總Unigene的數(shù)目之比)為35.14%，SSR出現(xiàn)頻率(檢出SSR個數(shù)與總Unigene數(shù)目之比)為51.41%。平均每隔2568.01 bp就含有1個SSR位點(diǎn)。沙棘木蠹蛾轉(zhuǎn)錄組中SSR位點(diǎn)的序列總長度達(dá)到81383.15 bp，SSR 位點(diǎn)平均長度為20.86 bp，一至六堿基重復(fù)的SSR位點(diǎn)的平均長度分別為9.80、13.05、15.33、19.33、25.67、42.00 bp(表1)。

表1 沙棘木蠹蛾SSR 不同重復(fù)基元分布情況Table 1 Distribution of different repeat motifs in Eogystia hippophaecolus transcriptome

2.2 沙棘木蠹蛾EST-SSR基元類型和比例

沙棘木蠹蛾EST-SSR重復(fù)類型豐富，單核苷酸至六核苷酸重復(fù)都可以發(fā)現(xiàn)。從SSR位點(diǎn)數(shù)量上看，出現(xiàn)最多的為單核苷酸重復(fù)，占總SSR位點(diǎn)數(shù)量的76.88%，其次是二、三核苷酸重復(fù)，分別占11.64%和10.68%，四、五、六核苷酸重復(fù)類型的數(shù)量很少，總計不足1% (表1)。

轉(zhuǎn)錄組SSR中共觀察到77種重復(fù)基元，單核苷酸至六核苷酸種類分別有2、9、30、32、5、1種。在這77種重復(fù)基元中，以單堿基重復(fù)基元A/T數(shù)量占絕對優(yōu)勢，占總SSR的73.74%；其次是二堿基重復(fù)AT/AT以及單堿基重復(fù)G/C所占比例較高，分別為3.37%和3.13%；二堿基重復(fù)基元中，以AT/AT和TA/TA較多，占二堿基重復(fù)SSR總數(shù)的54.80%。在三堿基重復(fù)基元中GCG/CGC出現(xiàn)次數(shù)多占三堿基重復(fù)SSR的15.07%，其次是ATT/AAT、GGC/GCC和TAT/ATA，分別為12.08%、10.96%和8.72%；其他四堿基至六堿基重復(fù)基元類型雖多，但數(shù)量均較少，出現(xiàn)頻率均較低。不同類型的SSR重復(fù)基元的分布見圖1。

2.3 EST-SSR基元長度和重復(fù)次數(shù)

在識別的SSR的長度分布上，由于單堿基重復(fù)序列占的比重較大，基元長度為10 bp的占50.45%，長度為11 bp的占15.43%，其次是長度為12 bp(10.46%)和15 bp(8.01)的基元(見圖2)?；闹貜?fù)次數(shù)上，以重復(fù)10次的基元數(shù)量最多(54.02%)，其次是重復(fù)11次(16.73%)，重復(fù)6次(7.20%)和12次(5.26%)的基元。不同重復(fù)次數(shù)的位點(diǎn)個數(shù)分布見圖3。

圖1 基于重復(fù)基元類型的微衛(wèi)星分布Fig.1 Microsatellites distribution on different repeat motifs

圖2 沙棘木蠹蛾EST-SSR的長度分布圖Fig.2 Length distribution of EST-SSR in Eogystia hippophaecolus transcriptome

圖3 沙棘木蠹蛾EST-SSR重復(fù)次數(shù)分布圖Fig.3 Distribution of EST-SSR repeat frequency in Eogystia hippophaecolus transcriptome

3 結(jié)論與討論

隨著二代測序的發(fā)展，SSR的發(fā)掘不再局限于構(gòu)建SSR富集文庫方法以及高通量發(fā)掘已測得物種基因組的方法，越來越多的基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫高通量篩選微衛(wèi)星的研究結(jié)果表明，開發(fā)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)是一種高通量發(fā)掘SSR的有效方法(Lovinetal., 2009；Arthoferetal., 2011；Baietal., 2011)。

本研究通過對沙棘木蠹蛾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的篩選，從14587條Unigene中共識別了7499個SSR位點(diǎn)，分布在5126條Unigene序列上。SSR發(fā)生頻率為35.14%，SSR出現(xiàn)頻率為51.41%。平均每隔2568.01 bp就含有1個SSR位點(diǎn)，SSR位點(diǎn)平均長度為20.86 bp。沙棘木蠹蛾的轉(zhuǎn)錄組SSR出現(xiàn)頻率相較于其他昆蟲差異較大，如黑翅土白蟻轉(zhuǎn)錄組SSR出現(xiàn)頻率為9.98%(Huangetal., 2012)，煙粉虱為5.07%(Xieetal., 2012)，細(xì)梢小卷蛾為3.09%(Zhuetal., 2013)，粘蟲為1.93%(胡艷華等，2015)，溝眶象的10.36%(武政梅等，2016)。出現(xiàn)該現(xiàn)象的可能原因?yàn)椋阂皇俏锓N的特異性，可能沙棘木蠹蛾SSR的數(shù)量較為豐富；二是構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組的方法不同造成轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的差異，比如，構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組選用的昆蟲蟲態(tài)和數(shù)量上、測序和組裝所設(shè)置的參數(shù)的不同，都將造成轉(zhuǎn)錄組本身的Unigene數(shù)量上的差異；三是SSR位點(diǎn)的搜索方法或計算標(biāo)準(zhǔn)不同造成統(tǒng)計結(jié)果的差異，比如，本研究對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中長度在1 kb以上的Unigene進(jìn)行的SSR高通量的發(fā)掘，篩選標(biāo)準(zhǔn)為單堿基重復(fù)至少10次，即SSR長度最小設(shè)置為10 bp。相對于溝眶象的類似研究中，同樣是長度在1 kb以上的Unigene進(jìn)行的搜索，篩選標(biāo)準(zhǔn)為單堿基重復(fù)至少12次，但SSR長度最小設(shè)置為12 bp，而單堿基重復(fù)的數(shù)量又相對較多，造成了結(jié)果的較大差異。而對于扶桑綿粉蚧(羅梅等，2014)、云南切梢小蠹(袁遠(yuǎn)等，2014)的研究，均是搜索轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中所有的Unigene進(jìn)行SSR的發(fā)掘，且SSR長度最小設(shè)置為12 bp，這就引起了差異較大的比較結(jié)果。綜上三個原因，在進(jìn)行類似研究的比較分析時，要基于參數(shù)設(shè)置基本相同的前提下，或者將參數(shù)列出以作為參考。

在發(fā)掘得到的沙棘木蠹蛾轉(zhuǎn)錄組SSR中，單堿基重復(fù)類型的數(shù)量最高，二、三堿基的數(shù)量相當(dāng)。而綠豆象(Duanetal., 2014)、云南切梢小蠹(袁遠(yuǎn)等，2014)、溝眶象(武政梅等，2016)等昆蟲的 EST-SSR主要以三堿基重復(fù)為主。這是由于本研究篩選標(biāo)準(zhǔn)為單堿基重復(fù)至少10次，本研究中SSR長度為10 bp的總數(shù)占到50%以上，因此單堿基重復(fù)SSR數(shù)量在本研究中占到絕對優(yōu)勢。本研究中SSR重復(fù)基元中所占比例最高的為A/T，所占比為73.74%。即使將篩選標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置為單堿基重復(fù)至少12次，A/T所占比例達(dá)30.34%，在此篩選標(biāo)準(zhǔn)下占比依然最高，這與黃粉蟲(Zhuetal., 2013)、云南切梢小蠹(袁遠(yuǎn)等，2014)、扶桑綿粉蚧(羅梅等，2014)的轉(zhuǎn)錄組中SSR的分析結(jié)果近似。

SSR標(biāo)記作為一種高效的分子標(biāo)記手段，其缺點(diǎn)是SSR標(biāo)記具有特異性，必須進(jìn)行PCR檢測進(jìn)行驗(yàn)證(李明芳和鄭學(xué)勤，2004)。因此，在后期開發(fā)沙棘木蠹蛾SSR分子標(biāo)記上，要對SSR重復(fù)單元前后的序列設(shè)計引物，并對其穩(wěn)定性和多態(tài)性進(jìn)行驗(yàn)證。

本研究基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行沙棘木蠹蛾EST-SSR的高通量發(fā)掘，并對發(fā)掘到的EST-SSR的特征進(jìn)行了分析，結(jié)果得到了在種類和數(shù)量上均較為豐富的EST-SSR，進(jìn)一步證明了利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)掘SSR是一種高效可行的方法。研究結(jié)果豐富了沙棘木蠹蛾的分子標(biāo)記，對其種群遺傳結(jié)構(gòu)、種群遺傳多樣性以及功能基因的開發(fā)利用、比較基因組學(xué)的研究都具有重要的參考價值。

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Feature analysis of simple sequence repeats inEogystiahippophaecolustranscriptome

CUI Ming-Ming, TAO Jing, ZONG Shi-Xiang*

(Beijing Key Laboratory for Forest Pest Control, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China)

In order to exploit SSR information ofEogystiahippophaecolus, we identify EST-SSR loci and analyze their features according to the transcriptome ofE.hippophaecolus.Results show 5126 unigenes contain 7499 SSR loci in total (51.41%).Mononucleotide repeats predominated with an occurrence frequency of 39.52%.There are 77 kinds of repeat motifs existing inE.hippophaecolustranscriptome.(A/T)n (73.74%) is most frequent in all the repeat types, and next is (AT/AT)n (3.37%).Most of the SSR are less than ten times of repetition and are 10 bp in length.The results should contribute to researches in SSR marker, genetic diversity, population genetic structure and genomic signatures identification inE.hippophaecolus.

Eogystiahippophaecolus; transcriptome; microsatellites

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國家自然基金面上項(xiàng)目(31470651)

崔明明，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槔ハx分子生物學(xué)

*通訊作者Author for correspondence，E-mail: zongsx@126.com

Received: 2017-01-01；接受日期Accepted: 2017-02-23

Q963；S433.3

A

1674-0858(2017)03-065-06