羊傳染性膿皰皮炎（Orf）耐熱性活疫苗性能檢測(cè)

馮玲霞張述斌蒙 琦張海明

(1.甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所,甘肅平?jīng)?744000;2.華亭縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,甘肅華亭 744100)

羊傳染性膿皰皮炎（Orf）耐熱性活疫苗性能檢測(cè)

馮玲霞1張述斌1蒙 琦1張海明2

(1.甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所,甘肅平?jīng)?744000;2.華亭縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,甘肅華亭 744100)

為了確保疫苗的質(zhì)量、安全性和有效性，以最大效率地提高接種后的效應(yīng)作用，降低免疫接種后的不良反應(yīng)。將生產(chǎn)的3批羊傳染性膿皰皮炎（Orf）耐熱性活疫苗凍干后，觀察了其物理性狀，并對(duì)疫苗進(jìn)行了無菌檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)、真空度檢驗(yàn)、安全性檢驗(yàn)、效力檢驗(yàn)，以及剩余水分含量的測(cè)定。結(jié)果表明，生產(chǎn)的3批羊Orf耐熱性活疫苗，對(duì)羊安全有效，其各項(xiàng)指標(biāo)均符合標(biāo)準(zhǔn)，為合格疫苗，可放心使用。

羊傳染性膿皰皮炎（Orf） 耐熱性 活疫苗 性能指標(biāo) 測(cè)定

羊傳染性膿皰皮炎（Contagiousecthyma，CE）俗稱“羊口瘡（Orf）”，是由痘病毒科副痘病毒屬的羊感染傳染性膿皰皮炎病毒（orf virus，ORFV）引起綿羊和山羊的一種急性、高度接觸性人獸共患傳染病。該病傳染性強(qiáng)，發(fā)病率高，尤以3～6月齡羔羊最為易感，且常呈群發(fā)性流行。通常發(fā)病率高達(dá)84.10%，死亡率為10%～40%左右，給養(yǎng)殖業(yè)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。本病的潛伏期為4～7d，發(fā)病后以口唇等處皮膚和黏膜丘疹、膿皰、潰瘍并結(jié)成疣狀厚痂為特征。傳染源為病羊及隱性感染羊，尤其是病羊痂皮帶毒時(shí)間長(zhǎng)，是最危險(xiǎn)的傳染源。本病無明顯的季節(jié)性，但以春季多發(fā)，一旦發(fā)生，常呈流行性。成年羊發(fā)病較少，呈散發(fā)，由于病毒抵抗力較強(qiáng)，羊群一旦被污染不易清除，可連續(xù)危害多年。給世界各國(guó)養(yǎng)羊業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，并對(duì)人類健康造成很大的威脅。而傳統(tǒng)的活疫苗熱穩(wěn)定性和保護(hù)功能差，對(duì)冷鏈的要求高，2～8℃條件下，保存期只有3～6個(gè)月，大多需在-15℃以下保存，這給疫苗的儲(chǔ)存和運(yùn)輸帶來很大困難，容易因免疫失敗而造成疫病的流行。

1 試驗(yàn)材料

1.1 試驗(yàn)用毒株

生產(chǎn)疫苗的HCE種毒由甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所鑒定、保管和供應(yīng)。

1.2 試驗(yàn)用細(xì)胞

犢牛睪丸細(xì)胞由“羊傳染性膿皰皮炎耐熱性活疫苗的研究”項(xiàng)目組制備。

1.3 試驗(yàn)儀器

真空冷凍干燥機(jī)、Mettler Toledo DL31水分測(cè)定儀、高頻火花真空測(cè)定器、高壓蒸汽滅菌器、超凈工作臺(tái)、移液器、干燥箱等。

1.4 試驗(yàn)藥品及試劑

1.4.1 羊Orf活疫苗耐熱保護(hù)劑：由“羊傳染性膿皰皮炎耐熱性活疫苗的研究”項(xiàng)目組自行研制。

1.4.2 化學(xué)試劑：199培養(yǎng)基、水解乳蛋白、生理鹽水、Frey培養(yǎng)基、硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（T.G）、酪胨瓊脂（G.A）等。

2 試驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 物理性狀觀察

試制的3批羊Orf耐熱性活疫苗經(jīng)凍干后，體積幾乎沒有變化，顏色一致，疏松多孔，保持原來的結(jié)構(gòu)，未出現(xiàn)濃縮現(xiàn)象，呈微黃色海綿狀疏松團(tuán)塊，易與瓶壁脫離，加稀釋液后迅速溶解，立即恢復(fù)原來的狀態(tài)，且凍干前后病毒損失量不大。

2.2 無菌檢驗(yàn)

2.2.1 試驗(yàn)方法：將生產(chǎn)的每批凍干苗隨機(jī)抽取4支，用生理鹽水稀釋至原量，混合后接種硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（T.G）小管及酪胨瓊脂（G.A）斜面各2支，每支0.2mL，1支置于36±1℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；1支放置25±1℃培養(yǎng)，另設(shè)生理鹽水和空白對(duì)照管，觀察3～5d。

2.2.2 試驗(yàn)結(jié)果：經(jīng)觀察，接種疫苗的硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（T.G）小管、酪胨瓊脂（G.A）斜面及對(duì)照管在5d內(nèi)均無細(xì)菌生長(zhǎng)。

2.3 支原體檢驗(yàn)

2.3.1 試驗(yàn)方法：每批凍干疫苗隨機(jī)抽取4支，用生理鹽水稀釋至原量，混合后吸取5ml接種于小瓶改良的Frey培養(yǎng)基，再?gòu)男∑恐腥?.2ml移植接種于1小管液體培養(yǎng)基內(nèi)，將小瓶與小管同時(shí)放在37℃培養(yǎng)，每日觀察培養(yǎng)物顏色變化。經(jīng)5～7d后，培養(yǎng)物顏色未見變化，再?gòu)男∑恐腥?.2ml移植于另一管液體培養(yǎng)基內(nèi)，置37℃繼續(xù)培養(yǎng)觀察5～7d，如此重復(fù)3次，培養(yǎng)物顏色均無變化，在最后一次接種小管的培養(yǎng)物經(jīng)14d觀察后停止觀察。如果在觀察期內(nèi)，發(fā)現(xiàn)小瓶或任何一支小管培養(yǎng)物顏色出現(xiàn)明顯變化，pH值變化達(dá)±0.5時(shí)，應(yīng)立即移植于小管液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基，觀察在液體培養(yǎng)基中是否出現(xiàn)恒定的pH變化，及固體培養(yǎng)基上有無典型的“煎蛋”狀支原體菌落。

2.3.2 試驗(yàn)結(jié)果：結(jié)果顯示，在3次7d的反復(fù)培養(yǎng)和最后一次14d的培養(yǎng)中，小瓶和小管內(nèi)的培養(yǎng)基顏色均無變黃或變紅的現(xiàn)象，從而說明我們?cè)囍频娜呙缇鶡o支原體污染。

2.4 剩余水分測(cè)定

2.4.1 試驗(yàn)方法：采用真空烘干法。將準(zhǔn)確稱重的樣品放60℃～70℃真空干燥箱內(nèi)，在一定的減壓條件下，用五氧化二磷干燥一定時(shí)間到恒重，樣品減少的重量即等于含水量[2]。

計(jì)算公式：含水量%=（樣品干前重-干后重）/干前重×100 2.4.2 試驗(yàn)結(jié)果：疫苗的剩余水分測(cè)定結(jié)果見表1。

表1 羊Orf耐熱性活疫苗的剩余水分檢驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果表明，試制的3批羊Orf耐熱性活疫苗的剩余水分含量均未超過4%，符合國(guó)家對(duì)凍干疫苗剩余水分含量的要求。

2.5 真空度檢驗(yàn)

用高頻火花真空測(cè)定器對(duì)試制的3批疫苗逐一進(jìn)行真空度測(cè)定，結(jié)果3批耐熱性羊Orf弱毒凍干活疫苗均出現(xiàn)紫色輝光，表明試制的疫苗真空度均合格。

2.6 安全性檢驗(yàn)

2.6.1 試驗(yàn)方法：在平?jīng)鋈A亭縣某羊場(chǎng)選用6月齡健康羔羊2只，分別將試制的3批苗每只于口腔黏膜接毒5個(gè)頭份免疫劑量的耐熱性羊Orf弱毒凍干活疫苗，觀察10d。

2.6.2 試驗(yàn)結(jié)果：疫苗接種羔羊后，經(jīng)觀察，羔羊接種部位及口唇內(nèi)均未出現(xiàn)紅斑、水泡、膿皰、潰瘍等病變，接種部位劃痕在第3天完全消失。表明我們?cè)囍频?批疫苗安全檢驗(yàn)均合格，不具有致病性。

2.7 效力檢驗(yàn)

2.7.1 檢驗(yàn)方法：每批疫苗隨機(jī)抽取5瓶疫苗，按原量加生理鹽水稀釋混合后，用犢牛睪丸細(xì)胞測(cè)定其TCID50。要求疫苗TCID50≥10-5/0.1ml。

在平?jīng)鋈A亭某羊場(chǎng)購(gòu)買6月齡左右的健康羔羊8只，隔離飼養(yǎng)，隨機(jī)分成1個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組，共2組，每組4只羔羊。試驗(yàn)組每只羔羊于口腔黏膜劃痕接種試制的耐熱性羊Orf弱毒凍干活疫苗0.1ml。21d后，對(duì)試驗(yàn)組和對(duì)照組的每只羔羊用100ID50HCE強(qiáng)毒口腔黏膜劃痕攻擊，觀察10～15d。

2.7.2 檢驗(yàn)結(jié)果：經(jīng)測(cè)定，生產(chǎn)的3批羊Orf耐熱性活疫苗的病毒感染力分別為：20150316批疫苗的TCID50在10-7.2；20150328批疫苗的TCID50在10-7.3以上；20150406批疫苗的TCID50在10-7.1。符合該疫苗TCID50≥10-5/0.1mL的要求。

經(jīng)觀察，對(duì)照組羔羊攻毒后，7d內(nèi)全部在口唇部位出現(xiàn)羊口瘡典型病變，免疫組經(jīng)HCE強(qiáng)毒攻擊后僅有2只羔羊于攻毒后第3d在攻毒部位出現(xiàn)輕微紅腫，但隨后紅腫消失。其余羔羊均未出現(xiàn)任何羊口瘡病變。結(jié)果見表2。

表2 羊Orf耐熱性活疫苗對(duì)羔羊的保護(hù)效果

3 小結(jié)與討論

通過對(duì)試制的3批羊Orf耐熱性活疫苗各項(xiàng)性能指標(biāo)的測(cè)定，表明其各項(xiàng)指標(biāo)均符合《中華人民共和國(guó)獸用生物制品制造及檢驗(yàn)規(guī)程》的規(guī)定，為安全合格疫苗，可放心使用。

羊Orf耐熱性活疫苗的使用可有效控制羊Orf病的發(fā)生與流行，提高羊的生產(chǎn)性能，降低養(yǎng)殖風(fēng)險(xiǎn)，保障人民的身體健康。有利于減少羊Orf病對(duì)生態(tài)環(huán)境所造成的間接污染，可促進(jìn)生態(tài)環(huán)境的良性循環(huán)，顯示出了良好的應(yīng)用前景，具有顯著地社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。

[1] 王文成.獸用生物制品耐熱凍干保護(hù)劑的研究進(jìn)展[J].畜牧獸醫(yī)科技信息，2002，18（12）：7-10，15.

[2] 中華人民共和國(guó)獸用生物制品制造及檢驗(yàn)規(guī)程[S].中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部，2000：32-34.