金銀花配方顆粒的位點(diǎn)特異性PCR鑒別研究

蔣超+屠李嬋+袁媛+黃璐琦+高偉+金艷

[摘要] 中藥配方顆粒已失去所有形態(tài)學(xué)辨識特征，傳統(tǒng)鑒定方法無法有效鑒定其真?zhèn)?。該文使用位點(diǎn)特異性PCR鑒別技術(shù)，根據(jù)金銀花trnL-trnF的一個(gè)SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性鑒別引物，對金銀花基原植物及配方顆粒進(jìn)行鑒定。經(jīng)過優(yōu)化DNA 提取方法后，藥材與配方顆粒均成功提取到DNA，金銀花基原植物及配方顆粒均可擴(kuò)增獲得約110 bp的條帶，混偽品無條帶。且BLAST結(jié)果比對證明PCR產(chǎn)物序列為金銀花trnL-trnF序列。該文研究結(jié)果表明，DNA分子鑒定方法可彌補(bǔ)性狀、顯微鑒別局限性，對中藥配方顆粒真實(shí)性進(jìn)行快速準(zhǔn)確的鑒定，為其生產(chǎn)、流通、用藥安全提供科學(xué)依據(jù)和保障。

[關(guān)鍵詞] 金銀花；配方顆粒；位點(diǎn)特異性PCR；分子鑒定

[Abstract] Traditional authentication method is hard to identify herb′s authenticity of traditional Chinese medicine（TCM） formula granules because they have lost all their morphological characteristics. In this study， a new allele-specific PCR method was established for identifying the authentication of Jinyinhua formula granule （made from Lonicerae Japonicae Flos） based on an SNP site in trnL-trnF fragment. Genomic DNA was successfully extracted from Lonicerae Japonicae Flos and its formula granules by using an improved spin column method and then PCR was performed with the designed primer. Approximately 110 bp specific bands was obtained only in the authentic Lonicerae Japonicae Flos and its formula granules， while no bands were found in fake mixed products. In addition， the PCR product sequence was proved from Lonicerae Japonicae Flos trnL-trnF sequence by using BLAST method. Therefore， DNA molecular authentication method could make up the limitations of character identification method and microscopic identification， and quickly identify herb′s authenticity of TCM formula granules， with enormous potential for market supervision and quality control.

[Key words] Lonicerae Japonicae Flos；formula granule；allele-specific PCR；molecular authentication

中藥配方顆粒是由單味中藥飲片經(jīng)水提、濃縮、干燥、制粒而成，在中醫(yī)臨床配方后，供患者沖服使用的粉狀或顆粒狀產(chǎn)品。配方顆粒具有攜帶方便、服用簡單、易于調(diào)制、適合工業(yè)化生產(chǎn)的特點(diǎn)，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了中藥同批內(nèi)產(chǎn)品物質(zhì)基礎(chǔ)的均質(zhì)性要求，解決了中藥長期以來質(zhì)量不均的問題[1]。自2001年7月，國家食品藥品監(jiān)督管理總局制定了《中藥配方顆粒管理暫行規(guī)定》規(guī)定配方顆粒納入中藥飲片管理范疇以來，中藥配方顆?？焖侔l(fā)展，經(jīng)過10余年的試點(diǎn)，中藥配方顆粒已超過600多品種，并廣泛應(yīng)用于600多家醫(yī)院中[2]。

然而，由于中藥配方顆粒已完全失去了傳統(tǒng)中藥飲片的鑒別特征，其鑒別與監(jiān)管已成為制約配方顆粒產(chǎn)業(yè)的瓶頸問題之一。由于生產(chǎn)、控制工藝的不同，中藥配方顆粒一直處于“試點(diǎn)”階段，尚缺乏統(tǒng)一可控的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，在生產(chǎn)、流通、使用環(huán)節(jié)上技術(shù)監(jiān)管難度較大[3]，導(dǎo)致中藥配方顆粒存在出現(xiàn)以偽充真、以次充好現(xiàn)象的風(fēng)險(xiǎn)，影響配方顆粒的臨床功效。

作為質(zhì)量控制的上游環(huán)節(jié)，配方顆粒的基原鑒定直接決定了其質(zhì)量與療效。由于配方顆粒系經(jīng)提取加工形成的顆粒狀制劑，已失去所有形態(tài)學(xué)辨識特征，無法通過性狀和顯微檢測的方式進(jìn)行鑒別；而在理化鑒別方面目前配方顆粒一般只通過薄層色譜和高效液相色譜進(jìn)行鑒別，但使用個(gè)別指標(biāo)成分進(jìn)行定性分析對于近似種、尤其是同屬近緣物種的鑒定具有很大困難；且對一些配方顆粒品種，因尚無專屬性指標(biāo)性成分而難以建立化學(xué)鑒定方法。因此，目前急需建立準(zhǔn)確性高、穩(wěn)定性好的方法用于配方顆粒原料物種的鑒定。

DNA分子鑒定是指通過比較藥材、飲片的DNA差異來鑒別藥材、飲片的方法。分子鑒定具有穩(wěn)定、準(zhǔn)確、特異性好、不受生物發(fā)展階段與儲藏加工影響等特點(diǎn)，受到了國內(nèi)外研究者廣泛關(guān)注，已建立多種中藥材及中藥飲片的分子鑒定方法[4-11]，甚至也有對中成藥乃至其湯劑進(jìn)行分子鑒定的報(bào)道[12-16]。其中蘄蛇、烏梢蛇飲片分子鑒別方法已經(jīng)作為國家標(biāo)準(zhǔn)率先收錄于2010年版《中國藥典》中[17]。2016年8月國家藥典委員會發(fā)布的《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求（征求意見稿）》也明確提出“對于來源復(fù)雜的原料藥材，必要時(shí)采用DNA分子鑒別技術(shù)進(jìn)行物種真?zhèn)舞b別”。

選擇合適的分子標(biāo)記，建立特異性DNA分子鑒定手段，可解決配方顆粒物種基原鑒別的難題，有助于建立統(tǒng)一可控的配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)范其生產(chǎn)、流通、用藥過程的監(jiān)管，為產(chǎn)品追溯及仲裁提供依據(jù)。金銀花配方顆粒（Jinyinhua formula granule）由金銀花藥材水提后加工而成，是臨床最為常用的配方顆粒之一。本研究以金銀花配方顆粒為例，運(yùn)用位點(diǎn)特異性PCR技術(shù)對金銀花的基原植物及配方顆粒進(jìn)行鑒定，分析DNA分子鑒定技術(shù)對配方顆?；b定的適用性，以期為中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定研究提供依據(jù)，為配方顆粒生產(chǎn)、流通、用藥安全提供保障。

1 材料

1.1 植物材料

依托第四次全國中藥資源普查標(biāo)本庫，收集金銀花配方顆粒正品基原植物忍冬Lonicera japonica Thunb.及其同屬混偽品短柄忍冬、紅腺忍冬、華南忍冬、黃褐毛忍冬、灰氈毛忍冬、金銀忍冬、盤葉忍冬、華南忍冬、西南忍冬、細(xì)氈毛忍冬、新疆忍冬原植物材料，使用硅膠干燥，憑證標(biāo)本保存于中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心，見表1。

1.2 配方顆粒

從華潤三九醫(yī)藥股份有限公司、北京中醫(yī)藥大學(xué)附屬東直門醫(yī)院、中國中醫(yī)科學(xué)院附屬西苑醫(yī)院購買金銀花配方顆粒樣品，共計(jì)17批，見表2。

1.3 儀器

Veriti^TM96孔梯度PCR儀（Applied Biosystems公司）；5810R型高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司）；DYY-12型電腦三恒多用電泳儀（北京六一儀器廠）；SYNGENE凝膠成像系統(tǒng)（GENE公司）。

1.4 試劑

SpeedSTAR HS Taq DNA聚合酶、MightyAmp DNA聚合酶和DL2000 DNA Marker均購自Takara公司。

2 方法

2.1 DNA提取

2.1.1 植物DNA提取 使用改良CTAB法[19]提取金銀花及其混偽品基原植物DNA，使用200 μL dd H₂O溶解，-20 ℃保存。

2.1.2 配方顆粒DNA提取 使用改進(jìn)的硅膠吸附柱法進(jìn)行提取，取20 mg配方顆粒置于2.0 mL微量離心管中，加入1 000 μL提取緩沖液，充分漩渦混勻至配方顆粒全部溶解，56 ℃水浴15 min；取出，冷卻至室溫，5 000×g離心5 min；取750 μL上清，加入至G2硅膠吸附柱，12 000×g離心1 min；棄穿透液，加入700 μL漂洗緩沖液，12 000×g離心1 min；取出離心柱轉(zhuǎn)移至一新的2.0 mL微量離心管中，使用50 μL洗脫液洗脫。

2.2 鑒別引物設(shè)計(jì)

基于金銀花基原植物忍冬及其同屬混偽品間SNP鑒別位點(diǎn)（trnL-trnF序列625G/A）[18-20]，設(shè)計(jì)金銀花配方顆粒特異性鑒別引物Jinyinhua-1.F/R和Jinyinhua-2.F/R。使用Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)引物，參數(shù)為：引物長18～25 nt，GC為40%～60%，Tm位于50～60 ℃，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為100～200 bp，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，見表3。

2.3 金銀花真?zhèn)舞b別方法的建立

取金銀花及其混偽品DNA，使用設(shè)計(jì)的鑒別引物進(jìn)行擴(kuò)增，用于確定位點(diǎn)特異性PCR反應(yīng)條件。25 μL PCR反應(yīng)體系包含2× MightyAmp Buffer Ver.2預(yù)混液 12.5 μL，MightyAmp DNA Polymerase （1.25 U·μL^-1） 0.6 μL、10 μmol·L^-1上游及下游引物各0.25 μL，20% 聚乙烯吡咯烷酮-40（PVP-40）溶液1 μL，10 g·L^-1牛血清蛋白（BSA）溶液0.5 μL[21]，DNA 模板1 μL（約10 ng）。PCR反應(yīng)在Veriti^TM型96孔梯度PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行。初始反應(yīng)程序見表3。取PCR反應(yīng)產(chǎn)物，加入5 μL 6× Loading buffer （Takara 公司） 混勻后于溴化乙錠（EB）染色的2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，SYNGENE凝膠成像系統(tǒng)觀察、成像。根據(jù)文獻(xiàn)[19]方法對PCR反應(yīng)條件進(jìn)行考察，確定可鑒別金銀花及其混偽品的位點(diǎn)特異性PCR退火溫度、循環(huán)數(shù)和DNA濃度范圍。

2.4 金銀花配方顆粒真?zhèn)畏椒ǖ慕?/p>

根據(jù)2.3項(xiàng)的結(jié)果，篩選出特異性鑒別引物Jinyinhua-1.F/Jinyinhua-1.R，取金銀花基原植物、混偽品及配方顆粒DNA，考察①退火溫度：57，59，61，63，65 ℃；②PCR循環(huán)數(shù)：35，40，45，50個(gè)循環(huán)；③Taq種類：SpeedSTAR HS Taq DNA聚合酶、MightyAmp DNA Polymerase；④不同Taq酶量：0.25，0.75，1.25 U對PCR鑒別結(jié)果穩(wěn)定性的影響。篩選出最適鑒別條件，對金銀花配方顆粒進(jìn)行位點(diǎn)特異性PCR鑒別。

2.5 序列測定及分析

金銀花配方顆粒特異性PCR擴(kuò)增陽性產(chǎn)物，使用Sanger法進(jìn)行測序，由北京睿博興科科技有限公司完成。對獲得的序列，使用BLASTn程序在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，以判斷鑒別結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.6 檢出限

調(diào)整金銀花、混偽品及配方顆粒的總DNA至50 mg·L^-1，并進(jìn)行逐級稀釋依次獲得濃度分別為50，10，2，0.4 mg·L^-1的DNA。以所稀釋的DNA為模板進(jìn)行位點(diǎn)特異性PCR，以擴(kuò)出條帶的最低濃度確定檢測限。

3 結(jié)果與分析

3.1 金銀花位點(diǎn)特異性PCR鑒別結(jié)果

凝膠電泳結(jié)果表明，所有樣品僅金銀花特異性鑒別引物Jinyinhua-1.F/R在退火溫度>53 ℃擴(kuò)出條帶，當(dāng)退火溫度為59，61，63 ℃時(shí)僅金銀花出現(xiàn)特異性鑒別條帶，混偽品無條帶。大于30個(gè)循環(huán)時(shí)，金銀花樣品均出現(xiàn)明顯條帶，30～45循環(huán)時(shí)，金銀花出現(xiàn)特異性鑒別條帶。DNA濃度在0.5～100 mg·L^-1時(shí)均可獲得擴(kuò)增。因此，本文最終確定的金銀花特異性PCR的反應(yīng)參數(shù)為95 ℃預(yù)變性5 min 后，（95 ℃ 20 s，63 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s）共40個(gè)循環(huán)，并使用該條件對金銀花及其同屬混偽品進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果金銀花均出現(xiàn)條帶，混偽品無條帶，見圖1。

3.2 金銀花配方顆粒的位點(diǎn)特異性PCR鑒別

根據(jù)3.1項(xiàng)獲得的金銀花位點(diǎn)特異性PCR鑒別體系，對金銀花配方顆粒PCR鑒別反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行篩選和優(yōu)化，見表3。使用優(yōu)化后的PCR反應(yīng)條件對不同來源金銀花配方顆?；蚧参镞M(jìn)行擴(kuò)增，均可獲得約100 bp的特異性條帶，配方顆粒擴(kuò)增條帶亮度較基原植物條帶弱；配方顆粒特異性PCR產(chǎn)物測序峰圖與基原植物峰圖一致，且與金銀花trnL-trnF序列完全相同，見圖2。

BLAST結(jié)果表明，配方顆粒特異性擴(kuò)增產(chǎn)物序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中相似性最高的是金銀花trnL-trnF（KU298636.1），一致性為98%，僅有1個(gè)T/A變異，經(jīng)核對引物序列表明，該SNP位點(diǎn)位于引物倒數(shù)第二位，是為了增加特異性而人為引入的錯(cuò)配。

3.3 檢出限

使用優(yōu)化后的PCR反應(yīng)條件，對不同濃度的金銀花配方顆粒DNA模板進(jìn)行位點(diǎn)特異性PCR擴(kuò)增。DNA模板濃度在50～10 mg·L^-1時(shí)，金銀花配方顆粒均能擴(kuò)增出約110 bp的特異性鑒別條帶；降低至2 mg·L^-1后，部分廠商配方顆粒無法擴(kuò)增，見圖3。

4 討論與展望

中藥配方顆粒是一種經(jīng)水煮沸提取1 h以上并加入輔料制成的顆粒狀飲片，已完全失去了原藥材的性狀與顯微鑒別特征，難以用傳統(tǒng)鑒定方法對其真實(shí)性進(jìn)行有效鑒定，無法滿足《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)定技術(shù)要求（征求意見稿）》提出的“對栽培、養(yǎng)殖或野生采集的藥用動(dòng)植物，應(yīng)準(zhǔn)確鑒定其種，不同種的中藥材不可相互混用”的要求。本研究運(yùn)用位點(diǎn)特異性PCR技術(shù)，對金銀花配方顆粒及其基原植物進(jìn)行鑒別。經(jīng)過優(yōu)化DNA 提取方法后，藥材與配方顆粒均成功提取到DNA，采用凝膠電泳或測序比對均能成功鑒定到物種。動(dòng)植物DNA經(jīng)長時(shí)間煮沸提取后會發(fā)生嚴(yán)重降解，DNA降解程度類似古DNA樣品，難以存留超過200 bp的DNA片段[22-23]。本研究使用了3對不同擴(kuò)增長度的鑒別引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，僅Jinyinhua-1.F/R引物在金銀花配方顆粒中獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，長度約100 bp，其結(jié)果與崔占虎等在水提液中獲得的片段長度類似[13]。

本研究結(jié)果證明，即使在長時(shí)間煮沸提取的中藥配方顆粒中，也有短片段DNA存留，可以使用特異性PCR的方式對其物種基原進(jìn)行鑒定。由于不同中藥品種具有不同性質(zhì)，其配方顆粒加熱提取時(shí)間、加水用量、輔料用量、干燥方法均有不同，應(yīng)根據(jù)配方顆粒的性質(zhì)和制備工藝，考察并選擇合適的DNA提取方法，尋找高穩(wěn)定性DNA片段，遵循中藥分子鑒定使用原則[24]，使用短片段擴(kuò)增與鑒定的方式建立配方顆粒DNA分子鑒別方法，并測試方法對原料藥的適用性，從而建立覆蓋原料、中間體、成品的配方顆粒真實(shí)性鑒別及溯源體系。由于配方顆粒DNA片段短，輔料干擾性大，基于SNP或短序列擴(kuò)增的特異性鑒別技術(shù)，如位點(diǎn)特異性PCR、快速PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)及高分辨率熔解曲線鑒別技術(shù)等在中藥配方顆粒產(chǎn)業(yè)的原料收購、加工及市場流通、產(chǎn)品追溯與仲裁等方面將起到更好的控制和監(jiān)管的作用，發(fā)揮更大的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 李睿，翟華強(qiáng)，田偉蘭，等. 中藥煮散的歷史源流及其與現(xiàn)代配方顆粒的對比性分析[J]. 中國中藥雜志， 2016， 41（5）： 965.

[2] 劉暉暉，李盛青，詹若挺，等.中藥配方顆粒發(fā)展現(xiàn)狀與臨床推廣應(yīng)用面臨的主要問題分析[J]. 世界科學(xué)技術(shù)——中醫(yī)藥現(xiàn)代化， 2011， 13（1）：9.

[3] 廣東省食品藥品監(jiān)督管理局. 廣東省中藥配方顆粒標(biāo)準(zhǔn)[M]. 北京： 中國醫(yī)藥科技出版社， 2013：1.

[4] 蔣超， 袁媛， 劉貴明， 等. 基于EST-SSR的金銀花分子鑒別方法研究[J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào)， 2012， 47（6）： 803.

[5] Jiang C， Jin Y， Zhao X， et al. Rapid and robust authentication of deer antler velvet product by fast PCR-RFLP analysis[J]. Mitochondrial DNA Part A， 2017： 1.

[6] 張嘉麗，黃宇航，宋明，等.基于ITS序列鑒別真菌類藥材馬勃及其混偽品[J]. 世界中醫(yī)藥，2016，11（5）：777.

[7] 胡峻， 詹志來， 袁媛， 等. 基于熔解曲線分析技術(shù)的木通類藥材的分子鑒別[J]. 中國中藥雜志， 2015， 40（12）： 2304.

[8] Newmaster S G， Grguric M， Shanmughanandhan D， et al. DNA barcoding detects contamination and substitution in North American herbal products[J]. BMC Med， 2013， 11（1）： 222.

[9] 蔣超， 崔占虎， 袁媛， 等. 菟絲子， 萊菔子與其易混淆品的快速PCR法鑒別研究[J]. 中國中藥雜志， 2016， 41（2）： 211.

[10] 馬紅梅，于靜，戴明，等. 適用于冬蟲夏草和新疆蟲草鑒別的DNA條形碼技術(shù)研究[J]. 世界科學(xué)技術(shù)——中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2016，18 （5）：826.

[11] Jiang C， Yuan Y， Chen M， et al. Molecular authentication of multi-species honeysuckle tablets[J]. Genet Mol Res， 2013， 12（4）： 4827.

[12] 崔占虎，龍平，王穎莉，等.DNA 分子標(biāo)記技術(shù)在中成藥鑒定中的應(yīng)用與展望[J]. 中草藥， 2015，38（1）：188.

[13] 崔占虎，蔣超，黃璐琦，等. 斷腸草與金銀花類藥材水提液特異性PCR鑒定方法研究[J]. 中國中藥雜志， 2013，38（16）：2563.

[14] Lo Y T， Li M， Shaw P C. Identification of constituent herbs in ginseng decoctions by DNA markers[J]. Chin Med， 2015， 10（1）： 1.

[15] 崔占虎， 蔣超， 李曼輝， 等. 連翹敗毒丸中原料藥材的分子鑒別[J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào)， 2013， 48（4）： 590.

[16] Jiang C， Yuan Y， Yang G， et al. Fluorescence visual detection of herbal product substitutions at terminal herbal markets by CCP-based FRET technique[J]. Sci Rep， 2016， 6：33540.

[17] 中國藥典. 一部[S]. 2015：372.

[18] 蔣超， 侯靜怡， 黃璐琦， 等. 快速 PCR 方法在金銀花真?zhèn)舞b別中的應(yīng)用[J]. 中國中藥雜志， 2014， 39（19）： 3668.

[19] 蔣超， 張雅華， 陳敏， 等. 基于雙向位點(diǎn)特異性 PCR 的金銀花真?zhèn)舞b別方法研究[J]. 中國中藥雜志， 2012， 37（24）： 3752.

[20] Yuan Y， Jiang C， Liu L， et al. Convenient， sensitive and high-throughput method for screening botanic origin[J]. Sci Rep， 2014， 4： 5395.

[21] 蔣超， 崔占虎， 袁媛， 等. PCR 增強(qiáng)劑對藥材 DNA分子鑒定的影響[J]. 中國中藥雜志， 2013， 38（16）： 2571.

[22] Pbo S， Gifford J A， Wilson A C. Mitochondrial DNA sequences from a 7000-year old brain[J]. Nucleic Acids Res， 1988， 16（20）： 9775.

[23] Cooper A， Lalueza-Fox C， Anderson S， et al. Complete mitochondrial genome sequences of two extinct moas clarify ratite evolution[J]. Nature， 2001， 409（6821）： 704.

[24] 黃璐琦， 袁媛， 袁慶軍， 等. 中藥分子鑒定發(fā)展中的若干問題探討[J]. 中國中藥雜志， 2014， 39（19）： 3663.

[責(zé)任編輯 孔晶晶]