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    食醋浸泡對大豆中異黃酮轉(zhuǎn)化的影響

    2017-07-31 18:28:53陳玉婷陳繼承田晶晶
    食品與發(fā)酵工業(yè) 2017年6期
    關鍵詞:乙?;?/a>?;?/a>內(nèi)源性

    陳玉婷,陳繼承,田晶晶

    (福建農(nóng)林大學 食品科學學院,福建 福州,350002)

    食醋浸泡對大豆中異黃酮轉(zhuǎn)化的影響

    陳玉婷,陳繼承*,田晶晶

    (福建農(nóng)林大學 食品科學學院,福建 福州,350002)

    采用紅曲老醋浸泡大豆,對大豆自身的內(nèi)源性β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,E.C. 3.2.1.21,BG)促進大豆中異黃酮的轉(zhuǎn)化進行研究。用合成底物p-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷測定大豆BG酶活,高效液相色譜法測定大豆異黃酮的含量。結果表明,隨著浸泡時間的延長,大豆BG酶活呈先上升后下降的趨勢,浸泡4 h時酶活達到最高為0.74 U/g。在內(nèi)源BG酶解和酸解的共同作用下,結合型異黃酮的糖苷逐漸被水解,其中丙二?;咸烟擒招秃挺?葡萄糖苷型含量顯著下降,分別降低47.39%和36.27%;苷元含量顯著上升,增加12倍。食醋浸泡有利于提高大豆的生物效價。

    醋泡大豆;BG活性;大豆異黃酮;苷元

    大豆異黃酮是由苷元、β-葡萄糖苷、β-葡萄糖苷結合丙二?;鸵阴;M成的酚類化合物[1]。大豆中天然存在的異黃酮主要成分有3類,即染料木素類、大豆苷元類和黃豆黃素類,各自又主要以4種形式存在:丙二?;咸烟擒招汀⒁阴;咸烟擒招汀ⅵ?葡萄糖苷型和苷配基型(苷元)[2]。其中結合型的糖苷占總異黃酮含量的80%~95%[3]。大豆異黃酮作為一種植物雌激素[4-5],具有預防和治療多種疾病的作用[6-17]。

    研究發(fā)現(xiàn),糖苷形式的大豆異黃酮不能直接被小腸壁吸收,必須經(jīng)水解去除糖基轉(zhuǎn)化為游離型的苷元才可被小腸吸收[18]。而且大豆異黃酮以苷元及其代謝產(chǎn)物體現(xiàn)其生物活性。大豆異黃酮糖苷水解方法主要有酸水解[19]、堿水解、Smith降解[20]和酶水解[21-22]。酸水解雖然成本低、技術簡單、水解率高,但存在副反應發(fā)生、環(huán)境污染、產(chǎn)物不穩(wěn)定等弊端。酶水解具有反應體系簡單、條件溫和、轉(zhuǎn)化率高、耗時短等優(yōu)點,但商業(yè)β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,E.C. 3.2.1.21,BG)價格昂貴、不能回收利用,在應用過程中受到很大限制。而產(chǎn)BG菌株篩選、分離、純化繁瑣,成本較高且微生物酶存在易受雜質(zhì)污染和易導致酶失活等缺陷。

    DE LIMA等[23]用不同溫度的去離子水浸泡大豆,在BG最適pH條件下,研究了不同浸泡時間下的大豆的β-葡萄糖苷、總苷元及丙二酰基葡萄糖苷型異黃酮含量變化和BG酶活,發(fā)現(xiàn)大豆內(nèi)源性BG活性與苷元及糖苷型異黃酮的含量變化密切相關。CHEN等[24]通過紅曲老醋浸泡大豆胚芽,在不同料液比條件下,研究了大豆胚芽中12類異黃酮的含量變化及其互變現(xiàn)象,表明大豆胚芽內(nèi)源性BG酶活與結合型異黃酮水解有關,BG酶解和醋的酸解作用存在協(xié)同效應。因此,利用醋酸水解和大豆內(nèi)源性BG酶解的優(yōu)勢設計本實驗,用于研究食醋浸泡對大豆異黃酮轉(zhuǎn)化的影響。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    福建紅曲老醋,福建永春順德堂食品有限公司;北大荒綠野有機黃豆,北大荒營銷股份有限公司。

    對硝基苯酚,p-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷,大豆苷元、乙?;蠖管?、丙二?;蠖管?、大豆苷、染料木苷元、乙酰基染料木苷、丙二?;玖夏拒?、染料木苷、黃豆黃素、乙?;S豆黃苷、丙二?;S豆黃苷、黃豆黃苷,Sigma公司;三氟乙酸(色譜純),乙腈(色譜純),甲醇(色譜純),北京邁瑞達科技有限公司;其余試劑均為分析純。

    1.2 儀器與設備

    Universal 320R離心機,德國Hettich公司;GZY 200C科研級快速開蓋萬能粉碎機,上海高致精密儀器有限公司;Alpha 1-2真空冷凍干燥機,德國Christ公司;DK-8D電熱恒溫水槽,上海一恒科技有限公司;UV-5200 PC紫外可見分光光度計,上海元析儀器有限公司;島津高效液相色譜儀LC-20A,Shimadzu corporation;KQ-500 VDE雙頻數(shù)控超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司。

    1.3 實驗方法

    1.3.1 醋豆的制作方法

    稱取無霉變、顆粒飽滿、大小均一的北大荒綠野有機黃豆200.0 g,福建永春紅曲老醋800.0 g,在25 ℃(恒溫水浴鍋調(diào)控溫度)下,用紅曲老醋浸泡大豆0、4、8、12、16、20、24 h;分別稱取浸泡0、4、8、12、16、20、24 h的大豆20.0 g,凍干,粉碎,過80目篩;稱取250.0 mg醋豆粉用于測定大豆內(nèi)源性BG酶活,剩余用于測定大豆異黃酮含量;實驗數(shù)據(jù)采用Origin 8.5、SPSS 17.0軟件進行分析。

    1.3.2 大豆內(nèi)源BG活性測定

    1.3.2.1 BG酶活標準曲線的制作

    配制一系列濃度梯度20、30、40、50、60、70 μmol/L的對硝基苯酚標準溶液,420 nm處測定吸光值,將每1 min內(nèi)催化生成1 μmol/L的對硝基苯酚所需酶量作為1個BG活性單位。

    1.3.2.2 醋豆BG活性的測定

    用p-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷做底物、對硝基苯酚做顯色劑測定BG酶活。提取醋豆粉中的BG參考文獻[25],即向0.05 mol/L(pH 4.5)的檸檬酸鹽緩沖液中加入0.1 mol/L的NaCl,取上述溶液1.5 mL于20 ℃室溫下萃取100 mg醋豆粉樣品1 h;離心,上清液用于測定酶活。測定大豆內(nèi)源性BG活性參考相關文獻[1, 26]。簡要操作如下:將1 mmol/Lp-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷加入到0.1 mol/L磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液(pH 5.0)中,30 ℃冰浴10 min;取上述溶液2.0 mL,并將0.5 mL待測上清液與對照上清液(上清液在100 ℃煮沸60 min)同時加入上述溶液中分別作為試驗組和對照組,每組試驗重復3次;30 ℃冰浴30 min后加入2.5 mL的Na2CO3溶液(0.5 mol/L)終止反應,產(chǎn)物p-硝基酚使反應呈黃色,測定420 nm處的吸光值;計算BG酶活,酶活單位為U/g干豆粉。

    1.3.3 不同浸泡時間醋豆異黃酮含量的測定

    采用高效液相色譜法[24]測定醋豆中異黃酮含量。操作簡述如下,稱取一定量不同浸泡時間的醋豆粉,加入10 mL 體積分數(shù)80%甲醇溶液,在溫度20 ℃、功率200 W、頻率30 Hz條件下,超聲處理35 min;8 000 r/min離心15 min;上清液用0.45 μm的過濾器過濾后進行高效液相色譜分析,平行測定3組樣品。色譜條件如下,色譜柱:配有一個保護柱的ODS C18柱;流動相:0.1%三氟乙酸水溶液、0.1%三氟乙酸乙腈溶液,線性梯度洗脫;流速:1.0 mL/min;進樣量:5 μL;柱溫:35 ℃;檢測波長:254 nm;用液相色譜純甲醇配制12類大豆異黃酮標樣,濃度15~50 μg/mL。

    2 結果與分析

    2.1 BG酶活標準曲線

    以對硝基苯酚濃度為橫坐標,吸光值為縱坐標得到的標準曲線回歸方程為:y=0.015 2x+0.023 7,R2=0.999 7。用此標準曲線來測定醋豆的內(nèi)源性BG酶活。

    2.2 浸泡過程中大豆BG酶活的變化規(guī)律

    由圖1可見,在浸泡0~24 h內(nèi),大豆內(nèi)源BG活性呈先上升后下降的趨勢,這一變化趨勢與LIMA的報道[27]相同。浸泡4 h,酶活達到最高,為0.74 U/g。浸泡初期,老醋體系中的醋酸、水借助細胞內(nèi)外的滲透壓差通過大豆細胞膜進入細胞內(nèi),當細胞內(nèi)pH接近或達到BG的最適pH 6.0[28-29]時,BG活性最高。

    圖1 不同浸泡時間對醋泡大豆β-葡萄糖苷酶 (BG) 活性的影響Fig.1 Effects of different soaking times on β-glucosidase (BG) activities of soaked soybeans

    2.3 醋豆中與BG相關的活性物質(zhì)變化

    表1、圖2-A是大豆異黃酮組分含量隨浸泡時間的變化趨勢。浸泡0~24 h,丙二?;咸烟擒招秃挺?葡萄糖苷型的含量隨浸泡時間的增加呈下降趨勢;乙?;咸烟擒招秃侩S浸泡時間的增加呈微升趨勢。0~8 h,丙二?;咸烟擒招秃孔兓黠@,從258.3 mg/100 g下降到182.1 mg/100 g,減少29.5%;β-葡萄糖苷型含量從129.6 mg/100 g下降到107.8 mg/100 g,減少16.8%;8~24 h,上述2種物質(zhì)含量的下降速率緩慢,分別減少17.9%和19.5%。0~8 h,苷元含量上升較快,從4.8 mg/100 g上升到57.7 mg/100 g,增加11.0倍;8~24 h,苷元含量從57.7 mg/100 g上升到113.8 mg/100 g,增加1.0倍。圖2-B~圖2-D是不同浸泡時間下大豆苷類、染料木素類、黃豆黃素類組分含量的變化。0~24 h,大豆苷、乙?;蠖管?、丙二?;蠖管?,染料木苷、丙二?;玖夏拒?,黃豆黃苷、丙二酰基黃豆黃甙的含量均有不同程度的下降;乙?;玖夏拒?、乙?;S豆黃苷的含量出現(xiàn)微升現(xiàn)象;大豆苷元、染料木苷元含量都明顯增加,黃豆黃素含量微降。

    表1 不同類型大豆異黃酮組分含量隨浸泡時間的變化

    注:同一行數(shù)據(jù),標小寫英文字母表示存在顯著性差異(P<0.05)。

    圖2 浸泡時間對不同結合型大豆異黃酮組分含量的影響Fig.2 Effects of soaking times on contents of different combined types of soy-isoflavone in soaked soybeans

    大豆異黃酮組分間的轉(zhuǎn)化包含兩方面:一是大豆異黃酮糖苷衍生物向糖苷的轉(zhuǎn)化;二是結合型糖苷向游離苷元的轉(zhuǎn)化。大豆內(nèi)源性BG酶參與后者的轉(zhuǎn)化。表1、圖2的丙二?;咸烟擒招?、β-葡萄糖苷型含量下降,苷元含量上升,表明BG酶解結合型的大豆異黃酮的糖苷。LIU等[30]研究發(fā)現(xiàn),酸解可有效地促進β-葡萄糖苷型轉(zhuǎn)化為苷元。CHEN等[24]的研究表明,BG酶解和醋的酸解作用存在協(xié)同效應。GES-FAVONI等[31]發(fā)現(xiàn),通過水浸大豆,大豆內(nèi)源性BG催化糖苷型的異黃酮轉(zhuǎn)化為苷元。TSANGALIS等[2]的研究表明,發(fā)酵可促進丙二?;咸烟擒招汀ⅵ?葡萄糖苷型轉(zhuǎn)化為苷元。本實驗結果與上述研究結果一致,表明食醋浸泡可促進大豆內(nèi)源性BG催化結合型大豆異黃酮的轉(zhuǎn)化。本實驗無法對乙?;咸烟擒招秃康奈⑸F(xiàn)象做出合理解釋,可能是由于酶解出的一小部分苷元與大豆多糖的水解產(chǎn)物結合所致。

    3 結論

    食醋浸泡能夠提高大豆內(nèi)源性BG酶活。食醋浸泡可促進大豆內(nèi)源性BG催化糖苷型大豆異黃酮的轉(zhuǎn)化。苷元形式的大豆異黃酮具有諸多生物活性,隨著人們對提高大豆內(nèi)源BG活性的深入研究,可大大降低微生物產(chǎn)酶的成本;同時,為大豆的深加工提供新視角。

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    Study on isoflavone conversion in vinegar soaked soybean

    CHEN Yu-ting, CHEN Ji-cheng*, TIAN Jing-jing

    (College of Food Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China)

    AgedMonascusvinegar was used to soak soybeans, the conversion of isoflavone by soybean's own endogenous β-glycosidase (β-glucosidase, E.C. 3.2.1.21, BG) was investigated. Synthetic substratep-nitrophenyl-β-D-glucopiranoside method was used in determination of β-glucosidase activity. The quantitative analysis of isoflavones was conducted by HPLC. Results showed that the activity of BG in soybean rose at first then went down with the extension of soaking time. The highest activity of BG was 0.74 U/g after soaking for 4 h. The combined types of soy-isoflavone were hydrolyzed under the interaction between acidolysis and enzymolysis. Under the combination of malonylglycoside-isoflavone and glycoside-isoflavone, glycosides in combined typeof soy-isoflavon was gradually hydrolyzed, malonyl glucoside type and β-clucoside type sioflavon reduced to 47.39% and 36.27% respectively, aglycones was increased significantly, up to 12-fold. Vinegar soaking can improve the bioavailability of soybean. This study provides data for soybean processing and extraction of active ingredients in soybean.

    soaked soybean by vinegar; the activity of β-glycosidase (BG) ; soy-isoflavone; aglycone

    碩士研究生(陳繼承副教授為通訊作者,E-mail:newtaicjc@163.com)。

    福建省自然科學基金項目(2016J01105);福建省海洋高新產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項(技術支持)(閩海漁高新【2014】03號);福建農(nóng)林大學高水平大學建設項目(612014042)

    2016-08-13,改回日期:2016-11-21

    10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201706035

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