蟲草素對脂多糖誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞過度活化的抑制作用研究

孟雪蓮,劉 佳,劉瑩瑩,鄭良超,高程程,王 丹,呂 晶,陳長蘭

(遼寧大學(xué)藥學(xué)院,遼寧沈陽 110036)

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蟲草素對脂多糖誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞過度活化的抑制作用研究

孟雪蓮,劉 佳,劉瑩瑩,鄭良超,高程程,王 丹,呂 晶,陳長蘭*

(遼寧大學(xué)藥學(xué)院,遼寧沈陽 110036)

蟲草素,脂多糖,巨噬細(xì)胞,過度活化

巨噬細(xì)胞(Macrophages)為吞噬細(xì)胞,參與機體的先天性免疫和細(xì)胞免疫。巨噬細(xì)胞過度激活,會顯著上調(diào)多種毒性炎性因子的分泌,如 NO、TNF-α、IL-1β、IL-6、活性氧(ROS)等,引起炎癥反應(yīng),使組織和細(xì)胞遭受損傷。致病原引起的感染、炎癥性胃腸道疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病、風(fēng)濕性疾病、過敏性疾病等的發(fā)病機制均與巨噬細(xì)胞的過度活化有關(guān)[1]。研究表明,抑制巨噬細(xì)胞過度活化可能成為防治炎癥相關(guān)疾病的一個重要策略。

圖1 蟲草素的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 The chemical structure of cordycepin

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蟲草素 純度98%，成都曼斯特生物科技有限公司;脂多糖(lipopolysaccharides,LPS,E.coli026:B6) 美國Sigma公司;DMEM高糖培養(yǎng)基 美國HyClone公司;胰蛋白酶、四甲基偶氮唑鹽(MTT) 美國Gibco公司;胎牛血清 日本TaKaRa公司;Mouse/Rat TNF-αValukine ELISA試劑盒、Mouse IL-1βValukine ELISA試劑盒、Mouse IL-6 Valukine ELISA試劑盒 美國R&D公司;Fluo-3/AM 美國Invitrogen公司;小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細(xì)胞資源中心。

CO2培養(yǎng)箱、超低溫-80 ℃冰箱、紫外分光光度計 德國Thermo Scientific公司;倒置顯微鏡 日本OMYLPUS公司;酶標(biāo)儀 瑞士帝肯公司;流式細(xì)胞儀 美國BD公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和藥物配制

1.2.1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠RAW264.7細(xì)胞系以DMEM高糖培養(yǎng)基(含5%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素)在37 ℃、95%空氣、5% CO2條件下培養(yǎng)。以0.25%胰蛋白酶消化進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.1.2 藥物配制 稱取蟲草素完全溶于DMSO溶液制成10 mmol/L儲備液,-20 ℃避光保存。使用時,用無血清無抗生素的DMEM高糖培養(yǎng)基稀釋到最終濃度。DMSO的終濃度≤1‰。

1.2.2 細(xì)胞存活率的檢測——MTT法 取對數(shù)生長期的RAW264.7巨噬細(xì)胞,以6×105cells/mL接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi),每孔100 μL。細(xì)胞貼壁24 h,換成無血清無抗生素新鮮培養(yǎng)基,加入藥物處理,設(shè)置蟲草素濃度為0.1、0.3、1、3、10 μmol/L單獨或與LPS(1 μg/mL)聯(lián)合作用,設(shè)置空白對照,每個組別設(shè)四個平行孔。藥物作用于RAW264.7巨噬細(xì)胞24 h后,每孔加入10 μL MTT溶液,37 ℃孵育3 h,去除培養(yǎng)液,每孔加入100 μL DMSO,室溫振蕩10 min,待結(jié)晶紫完全溶解后,用酶標(biāo)儀測定490 nm處吸光度值,計算細(xì)胞存活率。

1.2.3 細(xì)胞NO釋放水平的測定——Griess法 取對數(shù)生長期的RAW264.7巨噬細(xì)胞,以6×105cells/mL接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi),每孔100 μL。細(xì)胞貼壁24 h,換成無血清無抗生素新鮮培養(yǎng)基,加入藥物處理,設(shè)置蟲草素濃度為0.1、0.3、1、3、10 μmol/L單獨或與LPS(1 μg/mL)聯(lián)合作用,設(shè)置空白對照,每個組別設(shè)四個平行孔。藥物作用于RAW264.7巨噬細(xì)胞24 h后,取50 μL培養(yǎng)液上清,加入50 μL的Griess試劑(以蒸餾水配制的0.1%的萘乙二胺,以5%的磷酸配制1%的磺胺,臨用前二者1∶1等體積混合)室溫條件下反應(yīng)15 min,在540 nm處測定其吸光度。

1.2.4 細(xì)胞TNF-α、IL-1β和IL-6 釋放水平的測定——ELISA法 取對數(shù)生長期的RAW264.7巨噬細(xì)胞,以6×105cells/mL接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi),每孔100 μL。細(xì)胞貼壁24 h,換成無血清無抗生素新鮮培養(yǎng)基,加入藥物處理,設(shè)置蟲草素濃度為0.1、0.3、1、3、10 μmol/L單獨或與LPS(1 μg/mL)聯(lián)合作用,設(shè)置空白對照,每組設(shè)三個平行孔。加藥1 h后檢測TNF-α釋放,加藥4 h后檢測IL-1β和IL-6釋放。每孔收集50 μL細(xì)胞培養(yǎng)上清液用于ELISA檢測分析,按照試劑盒操作說明進(jìn)行測定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6含量。

1.2.5 細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i水平的測定——流式細(xì)胞術(shù)法 取對數(shù)生長期的RAW264.7巨噬細(xì)胞,以6×105cells/mL接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi),每孔2 mL。細(xì)胞貼壁24 h,換成無血清無抗生素新鮮培養(yǎng)基,加入藥物處理,設(shè)置蟲草素濃度為10 μmol/L單獨或與LPS(1 μg/mL)聯(lián)合作用,設(shè)置空白對照,每組設(shè)三個平行孔。加藥24 h后,收集細(xì)胞,4 ℃,1000 r/min,離心5 min,再以磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗待測細(xì)胞兩次;加入5 μmol/L Fluo-3/AM熒光探針,37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育30 min;4 ℃,1000 r/min,離心5 min,以PBS清洗細(xì)胞兩次;加入300 μL PBS吹散細(xì)胞,采用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的熒光強度值。

1.2.6 自由基清除能力檢測

1.2.6.1 羥自由基(·OH)清除能力測定——水楊酸法 水楊酸法檢測蟲草素對羥自由基的清除能力,參照文獻(xiàn)方法略做改動[5],利用fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基,取1.5 mL 離心管,編號,依次加入無菌水96 μL、6 mmol/L FeSO4100 μL、2.4 mmol/L H2O2溶液100μL,而后加入不同濃度的蟲草素PBS溶液(以磷酸鹽緩沖液PBS配制的蟲草素溶液)4 μL,混合均勻,蟲草素終濃度為0.1、0.3、1、3、10 μmol/L,同時設(shè)置空白對照組(PBS作用組),室溫條件下靜置10 min,再加入6 mmol/L的水楊酸100 μL,37 ℃水浴反應(yīng)30 min,取100 μL混合反應(yīng)液于96孔板中,每組設(shè)三個平行孔,采用酶標(biāo)儀測定510 nm波長處的吸光度值。實驗重復(fù)三次。

1.2.6.2 過氧亞硝酸根離子(ONOO-)清除能力的測定——L-酪氨酸法 目前過氧亞硝酸根離子(ONOO-)的制備主要采用淬滅流動反應(yīng)合成法,本實驗參考文獻(xiàn)采用改進(jìn)的過氧亞硝酸根離子溶液合成工藝[6]。實驗合成反應(yīng)在4 ℃條件下進(jìn)行。0.125 mol/L的NaOH水溶液10 mL(A液),30%的H2O2溶液0.3 mL與濃H2SO4溶液0.08 mL混合,以蒸餾水稀釋至5 mL(B液)。0.6 mol/L的NaNO2水溶液5 mL(C液)。B液與C液混合均勻,立即倒入A液中。而后加入MnO20.08 g,過濾后置于-20 ℃密封、避光過夜。1.0 mol/L NaOH溶液作為參比,用紫外分光光度計檢測302 nm 波長處的吸光度值,根據(jù)朗伯-比爾定律計算過氧亞硝酸根離子(ONOO-)的濃度(ε=1670)為778 μmol/L。

75 μmol/L的L-酪氨酸水溶液和96 μmol/L的ONOO-溶液與不同濃度的蟲草素PBS溶液(0.1～10 μmol/L)混勻,實驗同時設(shè)置空白對照(PBS作用組),于37 ℃水浴中反應(yīng)30 min,取反應(yīng)液點樣于96孔板,每孔100 μL,每組設(shè)三個平行孔,采用酶標(biāo)儀檢測428 nm 處的吸光度值。實驗重復(fù)三次。

2 結(jié)果與分析

2.1 蟲草素對巨噬細(xì)胞存活率的影響

為了排除藥物對巨噬細(xì)胞的毒性作用,實驗首先采用MTT法考察蟲草素對細(xì)胞存活率的影響。結(jié)果表明,0.1～10 μmol/L的蟲草素單獨或與LPS(1 μg/mL)共同作用于RAW264.7巨噬細(xì)胞,細(xì)胞的存活率均無顯著變化。表明在0.1～10 μmol/L濃度范圍內(nèi),蟲草素對巨噬細(xì)胞無明顯毒性作用(數(shù)據(jù)未給出)。

2.2 蟲草素對多度活化的巨噬細(xì)胞NO釋放的影響

Griess法研究結(jié)果表明,與空白對照組相比,RAW264.7巨噬細(xì)胞經(jīng)LPS(1 μg/mL)單獨處理24 h后,細(xì)胞培養(yǎng)液中NO含量顯著升高。與模型組(LPS單獨作用組)相比,不同濃度的蟲草素與LPS共同作用于RAW264.7巨噬細(xì)胞,細(xì)胞釋放NO水平顯著降低。蟲草素(0.1～10 μmol/L)單獨作用于RAW264.7巨噬細(xì)胞24 h后,對細(xì)胞NO釋放均無顯著影響(圖2)。

圖2 蟲草素單獨或與LPS聯(lián)合作用對RAW264.7 巨噬細(xì)胞NO產(chǎn)生的影響Fig. 2 Effect of cordycepin on NO production by unstimulated or LPS-activated RAW264.注:##.與空白對照組相比,差異顯著(p<0.01);###. 與空白對照組相比,差異極顯著(p<0.001);*. 與LPS組相比,差異顯著(p<0.05);**. 與LPS組相比,差異極顯著(p<0.01);***. 與LPS組相比,差異高度顯著(p<0.001);圖3、圖4同。

2.3 蟲草素對過度活化的巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-1β和IL-6釋放的影響

由圖3可見,ELISA研究結(jié)果表明,與空白對照組相比,LPS作用1 h后,RAW264.7巨噬細(xì)胞的炎癥因子TNF-α釋放量顯著增加;LPS作用4 h后,細(xì)胞釋放IL-1β和IL-6水平顯著增加。蟲草素對LPS活化的巨噬細(xì)胞釋放3種炎癥因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)均具有顯著抑制作用,且具有一定的濃度依賴性。

2.4 蟲草素對LPS過度活化的巨噬細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i水平的影響

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明,LPS(1 μg/mL)作用于RAW264.7巨噬細(xì)胞24 h,胞漿游離鈣離子熒光強度顯著升高。與LPS單獨作用組相比,蟲草素(10 μmol/L)與LPS共同作用可顯著抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)胞漿游離鈣離子熒光強度的異常增高(見圖4)。

圖4 蟲草素與LPS聯(lián)合作用對RAW264.7巨噬細(xì)胞內(nèi)胞漿鈣離子濃度[Ca2+]i的影響Fig. 4 Effect of cordycepin on[Ca2+]i level in LPS-activated RAW264.

圖3 蟲草素與LPS聯(lián)合作用對RAW264.7巨噬細(xì)胞 TNF-α、IL-1β和IL-6釋放的影響Fig. 3 Effect of cordycepin on TNF-α,IL-1β, and IL-6 release by LPS-activated RAW264.

圖5 蟲草素對·OH自由基、ONOO-自由基清 和·自由基的清除作用Fig. 5 ·OH,ONOO-,and · free radical scavenging注:*.與模型對照組相比,差異顯著(p<0.05);**. 與模型對照組相比,差異極顯著(p<0.01);***. 與模型對照組相比,差異高度顯著(p<0.001)。

3 討論

細(xì)菌及其產(chǎn)物脂多糖(lipopolysaceharides,LPS)可將細(xì)胞激活,誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生大量的NO、活性氧(ROS)及多種炎癥因子,如腫瘤壞死因子(TNF)、白細(xì)胞介素-1(IL-1)、IL-6、IL-12等[8]。在本實驗中,采用LPS激活小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞的方法,使其產(chǎn)生炎癥反應(yīng),釋放大量的NO和炎癥因子,從而建立起細(xì)胞炎癥模型。MTT實驗的結(jié)果表明(數(shù)據(jù)未給出),當(dāng)濃度為0.1～10 μmol/L時,蟲草素單獨或與LPS 聯(lián)合應(yīng)用對RAW264.7細(xì)胞的存活率無顯著影響。以此排除蟲草素對上述細(xì)胞NO釋放的作用是通過降低細(xì)胞數(shù)量所致。Griess實驗的結(jié)果表明,蟲草素(0.1～10 μmol/L)與LPS 聯(lián)合作用于巨噬細(xì)胞,LPS誘導(dǎo)的NO釋放水平的增高被顯著抑制;而蟲草素(0.1～10 μmol/L)單獨作用于巨噬細(xì)胞RAW264.7后,NO釋放水平無顯著變化。接著,采用ELISA實驗分別考察了蟲草素對LPS激活的RAW264.7細(xì)胞釋放TNF-α、IL-1β以及IL-6水平的變化。實驗證明,蟲草素(0.1～10 μmol/L)可不同程度的顯著抑制LPS激活的巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6,且具有明顯的濃度依賴性。上述結(jié)果證明,蟲草素具有顯著的抗巨噬細(xì)胞過度激活及抑制相關(guān)炎癥因子生成的作用。

在人體和動物體內(nèi),由于巨噬細(xì)胞過度活化產(chǎn)生過量的炎癥因子可以導(dǎo)致感染、心血管疾病、風(fēng)濕性疾病等一系列疾病[1]。蟲草素抑制過度激活的巨噬細(xì)胞釋放NO及多種炎癥因子的作用,提示其有望用于上述炎癥相關(guān)疾病的防治。

多項研究結(jié)果表明,激活的巨噬細(xì)胞中胞漿游離鈣離子濃度([Ca2+]i)持續(xù)增高,其升高一方面來自胞內(nèi)Ca2+庫的釋放,另一方面來自胞外Ca2+的內(nèi)流。脂多糖(LPS)能夠通過作用于TLR受體而誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞胞內(nèi)Ca2+大量增加[9],從而加強TLR配體誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子如IL-6、TNF-α、NO的產(chǎn)生,表明Ca2+信號通路與TLR信號通路之間的交互作用是巨噬細(xì)胞充分活化所必需的[10]。Zhou[11]等的研究表明,在LPS激活的大鼠腹腔巨噬細(xì)胞中,[Ca2+]i的增高可使誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)表達(dá)增高,NO和TNF-α大量產(chǎn)生。已有研究表明,蟲草素可抑制HT22神經(jīng)細(xì)胞及人血小板細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的異常增高[12-13]。

本研究結(jié)果表明,蟲草素可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i濃度的增高,這可能是蟲草素抑制巨噬細(xì)胞過度活化并抑制其大量釋放NO、TNF-α、IL-1β和IL-6的作用機制之一。

自由基是指含有一個不成對電子的原子團,具有較強氧化能力的微粒。主要是指活性氧自由基,包括羥自由基,過氧化氫分子,過氧亞硝酸根離子、超氧陰離子,烷氧基,單線態(tài)氧等等?；钚匝?ROS)是炎癥信號通路中的重要環(huán)節(jié),位于多條炎癥信號通路的上游。已有研究表明,在活化的巨噬細(xì)胞中可產(chǎn)生大量的活性氧自由基,可使NF-κB活化入核,增強iNOS、IL-1β、TNF-α和IL-6基因轉(zhuǎn)錄表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞活化,使NO、IL-1β、TNF-α和IL-6的釋放增加[14-15]。本研究考察了蟲草素對羥自由基、過氧亞硝酸根自由基和超氧陰離子自由基的清除作用。結(jié)果顯示,蟲草素對三種自由基均具有顯著清除作用,表明自由基清除作用可能是其抗巨噬細(xì)胞活化的作用機制之一。

4 結(jié)論

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Inhibitory effect of cordycepin on macrophagehyperactivation induced by lipopolysaccharide

MENG Xue-lian,LIU Jia,LIU Ying-ying,ZHENG Liang-chao,GAO Cheng-cheng,WANG Dan,LV Jing,CHEN Chang-lan*

(School of Pharmaceutical Science,Liaoning University,Shenyang 110036,China)

cordycepin;lipopolysaccharide;macrophage;hyperactivation

2017-02-14

孟雪蓮(1978-)，女，博士，副教授，研究方向：抗炎與免疫藥理學(xué)，E-mail：rubymxl@163.com。

*通訊作者:陳長蘭 (1963-)，男，博士，教授，研究方向：遺傳學(xué)與生物制藥，E-mail：chenchanglanbio@aliyun.com。

國家自然科學(xué)基金項目(81503085，31371085)。

TS201.4

A

1002-0306(2017)13-0297-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.13.055