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      PD-1/PD-L1在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)的生物學(xué)作用及臨床意義

      2017-07-31 23:54:10彭苗莫?jiǎng)P嵐王希成丁穎
      臨床醫(yī)學(xué)工程 2017年7期
      關(guān)鍵詞:組織化學(xué)免疫治療陽(yáng)性細(xì)胞

      彭苗,莫?jiǎng)P嵐,王希成,丁穎

      (廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 腫瘤科,廣東 廣州 510080)

      PD-1/PD-L1在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)的生物學(xué)作用及臨床意義

      彭苗,莫?jiǎng)P嵐,王希成,丁穎*

      (廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 腫瘤科,廣東 廣州 510080)

      目的研究PD-1/PD-L1及EGFR在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)和相關(guān)性。方法收集我院96例非小細(xì)胞肺癌患者的病理標(biāo)本和臨床資料,使用免疫組化檢測(cè)PD-1/PD-L1的表達(dá)情況,PCR檢測(cè)EGFR的表達(dá)情況。使用Logistic回歸分析評(píng)價(jià)PD-1/PD-L1和EGFR的相關(guān)性。結(jié)果吸煙患者的PD-1陽(yáng)性率為76.7% (23例),顯著高于不吸煙患者的21.2% (14例) (P<0.05)。女性患者的PD-L1陽(yáng)性率為82.0% (41例),顯著高于男性的45.7% (21例) (P<0.05)。腺癌患者的PD-L1陽(yáng)性率為78.3% (47例),顯著高于鱗癌的41.7% (15例) (P<0.05)。EGFR突變型患者的PD-L1陽(yáng)性率為91.9% (34例),顯著高于野生型的47.5% (28例) (P<0.05)。結(jié)論P(yáng)D-1在吸煙患者中高表達(dá);PD-L1與EGFR呈正相關(guān),且在女性、腺癌患者中高表達(dá),PD-L1與EGFR基因表達(dá)的關(guān)系可能為個(gè)體化免疫治療聯(lián)合靶向治療提供新的依據(jù)。

      非小細(xì)胞肺癌;PD-1;PD-L1;EGFR

      肺癌是我國(guó)常見的高發(fā)腫瘤之一,常規(guī)治療手段為手術(shù)、放療、化療。近年出現(xiàn)的靶向免疫治療和靶向藥物治療也是肺癌的治療方式,均高效低毒,但能否聯(lián)合使用并提高療效尚未明確。本研究分析靶向免疫治療和靶向藥物治療常見的靶點(diǎn):程序性死亡受體-1(programmed cell death-1,PD-1)及其配體PD-L1,與表皮生長(zhǎng)因子 (epidermal growth factor receptor,EGFR)的相關(guān)性,為兩者的聯(lián)合使用探索方向,現(xiàn)報(bào)道如下。

      1 材料與方法

      1.1 研究對(duì)象收集我院2011年1月至2013年12月收治的96例經(jīng)病理證實(shí)為非小細(xì)胞肺癌 (non-small cell lung cancer,NSCLC)患者的病理標(biāo)本和臨床資料,標(biāo)本取材均避開了腫瘤壞死區(qū)域,用福爾馬林溶液浸泡,固定后石蠟包埋、切片。

      1.2 主要試劑和設(shè)備免疫組織化學(xué)的一抗:PD-L1單抗(SP142)購(gòu)于美國(guó)的R&D Systems公司,PD-1單抗 (SP269)購(gòu)自美國(guó)的Spring Bioscience公司;免疫組織化學(xué)的二抗:辣根過氧化物酶標(biāo)記鼠/兔通用型二抗 (DAKO,Glostrup公司,丹麥)。主要設(shè)備:熒光定量PCR儀 (ABI公司,美國(guó)),全自動(dòng)免疫組化染色儀 (Roche公司,美國(guó)),倒置顯微鏡 (Olym pus公司,日本),酶標(biāo)檢測(cè)儀 (Themo公司,美國(guó)),Strata gene Mx3000P熒光定量PCR儀等。

      1.3 主要實(shí)驗(yàn)方法

      1.3.1 PD-L1/PD-1的免疫組織化學(xué)染色 脫蠟和水化:將標(biāo)本切片、烤片、脫蠟 (二甲苯),并進(jìn)行乙醇水化處理(分別用無水乙醇、95%乙醇、75%乙醇浸泡)。抗原修復(fù):用自來水沖洗切片 8 min、蒸餾水浸洗 5 min、水浴加熱 25 min后進(jìn)行EDTA緩沖液抗原修復(fù),冷卻。過氧化物酶阻斷:修復(fù)結(jié)束后再用自來水沖洗10 min、蒸餾水浸洗5 min,3%H2O2溶液封閉內(nèi)源性過氧化物酶,室溫孵育15 min,蒸餾水洗滌后,5% BSA封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn),室溫孵育15 min。加入一抗、二抗:PBS沖洗3次,3 min/次,甩去PBS,加入一抗,切片放于4℃冰箱過夜。第二日切片再次用PBS沖洗3次,3 min/次,甩去PBS,加入二抗,室溫孵育 30 min。顯色、復(fù)染、封片:PBS沖洗3次,3 min/次,甩去PBS液并洗去多余二抗,用DAB顯色顯色5 min,自來水沖洗。經(jīng)蘇木素復(fù)染,鹽酸酒精分化后予自來水沖洗10 min,梯度乙醇脫水干燥,適當(dāng)吹風(fēng)機(jī)吹干,中性樹脂封固。然后讀片。

      1.3.2 PD-1/PD-L1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果評(píng)估 采用immuno histochemical scores(IHS)評(píng)估PD-1/PD-L1免疫組織化學(xué)染色,由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師進(jìn)行雙盲閱片。每張切片選取5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)鏡 (×200)下的高倍視野,根據(jù)陽(yáng)性著色細(xì)胞的百分比、陽(yáng)性細(xì)胞著色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分。①陽(yáng)性著色細(xì)胞百分比:無陽(yáng)性細(xì)胞為0分,1%~10%陽(yáng)性細(xì)胞為1分,11%~50%陽(yáng)性細(xì)胞為2分,51%~80%陽(yáng)性細(xì)胞為3分,81%~100%陽(yáng)性細(xì)胞為4分。②陽(yáng)性細(xì)胞著色強(qiáng)度:無色0分,弱陽(yáng)性1分,中度陽(yáng)性2分,強(qiáng)陽(yáng)性3分。兩項(xiàng)的乘積即為免疫組化陽(yáng)性等級(jí)評(píng)分:0分為-,1~4分為+,5~8分為++,9~12分為+++。腫瘤細(xì)胞中、強(qiáng)度染色達(dá)到5%以上標(biāo)記為PD-1/PD-L1過度表達(dá)陽(yáng)性 (其中5%~20%過表達(dá)為1+,21%~50%過表達(dá)為2+,50%~100%過表達(dá)為3+)。

      1.3.3 熒光定量PCR檢測(cè)EGFR基因 ①提取病理切片的石蠟包埋組織樣本DNA。②取PCR管加入Taqman DNA聚合酶 (3 μL/管),放置于冰上,混勻后并短暫離心。向PCR管中分別加入27 μL待檢肺癌的DNA樣品、陰性對(duì)照品及陽(yáng)性對(duì)照品,混勻并短暫離心。③將步驟②中與Taqman DNA聚合酶混勻的各個(gè)待檢樣品、陰性對(duì)照品及陽(yáng)性對(duì)照品,按3 μL/孔,分別加入檢測(cè)試劑的不同反應(yīng)孔中 (每檢測(cè)1個(gè)樣品配備1~8號(hào)反應(yīng)液),混勻并短暫離心。④熒光PCR儀檢測(cè)通道設(shè)定:熒光定量PCR儀同時(shí)選擇FAM、HEX通道,反應(yīng)程序設(shè)置如下:95℃,10 s,循環(huán) 1次;95℃,15 s;60℃,60 s,循環(huán) 40次。結(jié)束后采集熒光并判讀結(jié)果。

      1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù),采用Logistic回歸分析評(píng)價(jià)PD-1、PD-L1和EGFR及其他臨床特征的相關(guān)性。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn),計(jì)量資料采用t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

      2 結(jié)果

      2.1 患者的一般資料患者男女比例約0.9∶1,平均年齡(51.4 ±6.5)歲,60例腺癌,患者基線特征見表1。PD-1陽(yáng)性 37例,PD-L1陽(yáng)性62例,PD-1、PD-L1陽(yáng)性病理圖見圖1。

      2.2 PD-1/PD-L1表達(dá)情況及與EGFR的關(guān)系使用Logistic回歸分析評(píng)價(jià)PD-1,PD-L1和EGFR及其他臨床特征的相關(guān)性,結(jié)果顯示,PD-1在吸煙患者中高表達(dá),與EGFR無相關(guān)性;PD-L1和EGFR正相關(guān),且在女性、腺癌患者中高表達(dá)。見表2、圖2。

      表1 患者的一般資料

      圖1 NSCLC病理圖

      表2 PD-1/PD-L1表達(dá)情況與其他因素的關(guān)系 (n)

      3 討論

      PD-1及其配體PD-L1均屬于CD28/B7超家族[1]。處于腫瘤的微環(huán)境中,PD-1能夠在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及被抑制的淋巴細(xì)胞的表面表達(dá),同時(shí)也是參與活化T淋巴細(xì)胞后期調(diào)控的負(fù)協(xié)同刺激受體之一[2];當(dāng)它在活化的T細(xì)胞中表達(dá)時(shí),在調(diào)節(jié)免疫抑制的過程中具有重要作用[3],可幫助腫瘤細(xì)胞逃避PD-1陽(yáng)性T細(xì)胞的攻擊。PD-L1是PD-1的配體之一,多表達(dá)在多種免疫細(xì)胞、上皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。Forde等[4]的研究顯示,PD-L1能夠結(jié)合T細(xì)胞表面的PD-1,并抑制腫瘤抗原特異性T細(xì)胞活化,誘導(dǎo)并維持T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫耐受。

      圖2 PD-L1表達(dá)與EGFR表達(dá)的關(guān)系

      EGFR是表皮生長(zhǎng)因子受體家族成員之一,是原癌基因cerbB1的表達(dá)產(chǎn)物,也是一種跨膜受體酪氨酸激酶,其中第18~21外顯子可編碼酪氨酸激酶區(qū),在NSCLC中可發(fā)生過表達(dá)和 (或)突變。EGFR的第19、21外顯子的L858R突變是最常見的突變類型[5-7],可擾亂正常的EGFR信號(hào)通路,與細(xì)胞增殖、血管生成、轉(zhuǎn)移擴(kuò)散和抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)[8],也是針對(duì)EGFR突變的酪氨酸激酶抑制劑 (TKI)[9]最主要作用靶點(diǎn)。

      本研究結(jié)果顯示,在NSCLC中,PD-1在吸煙患者中高表達(dá),PD-L1在女性、腺癌中高表達(dá),PD-L1表達(dá)和EGFR突變呈正相關(guān) (P<0.05),PD-1和EGFR突變無相關(guān)性。突變型EGFR基因的信號(hào)可能為上調(diào)NSCLC中PD-L1表達(dá)的途徑之一,但具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。Rech等[10]使用鼠的肺腫瘤細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)突變型EGFR基因的信號(hào)可直接上調(diào)腫瘤中PD-L1的表達(dá),并且在基因治療中阻斷突變的EGFR信號(hào)通路可改善預(yù)后,增加腫瘤靶向治療聯(lián)合免疫治療的機(jī)會(huì)。Azuma等[11]指出在164例NSCLC術(shù)后標(biāo)本中,PD-L1在女性、不吸煙、腺癌、EGFR突變患者中高表達(dá),且PD-L1高表達(dá)患者的生存期較短;EGFR-TKI可下調(diào)EGFR突變型肺癌細(xì)胞表面PD-L1的表達(dá),而野生型EGFR肺癌細(xì)胞中,EGFRTKI無此作用,提示PD-L1表達(dá)上調(diào)可能是通過EGFR信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的,而EGFR信號(hào)通路則是由EGFR基因的突變介導(dǎo)。但D'Incecco等[12]的研究表明,54名EGFR突變患者中,PDL1陽(yáng)性患者的預(yù)后更好。因此在NSCLC中,PD-L1表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系仍需進(jìn)一步研究。

      在NSCLC中,針對(duì)EGFR基因突變的藥物EGFR-TKI的治療有效率為50%~80%,中位無疾病進(jìn)展時(shí)間為10~14個(gè)月[13-14]。而針對(duì)PD-L1的藥物在NSCLC中也取得了一定療效,Gulley等[15]于 2013~2014年選取 184例既往化療失敗的NSCLC患者進(jìn)行抗PD-L1抗體(avelumab)Ⅰ期臨床試驗(yàn),客觀緩解率為22%,PD-L1陽(yáng)性可能是抗PD-L1的抗體治療的靶點(diǎn)。因此,靶向治療聯(lián)合免疫治療可能更有利于EGFR和PD-L1均高表達(dá)的患者存活。NSCLC中,PD-L1和EGFR基因的相關(guān)性可能為NSCLC免疫治療聯(lián)合靶向治療提供新的依據(jù)。

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      (責(zé)任編輯:常海慶)

      Biological Effect and Clinical Significance of PD-1/PD-L1 Expression in Non-Small Cell Lung Cancer

      PENG Miao,MO Kailan,WANG Xicheng,DING Ying*
      (Department of Oncology,the First Affiliated Hospital/School of Clinical Medicine of Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou 510080,China;*

      DING Ying,E-mail:dy61321157@163.com)

      ObjectiveTo study the PD-1/PD-L1 expression in non-small cell lung cancer and the correlation with EGFR expression.MethodsPathologic specimens of 96 cases of patients with non-small cell lung cancer were selected and their clinical datas were collected. PD-1/PD-L1 expression were detected by immunohistochemical and PCR for EGFR expression.Logistic regression analysis was used to evaluated the correlation between PD-1/PD-L1 and EGFR.ResultsThe positive rate of PD-1 of smoking patients was 76.7%(23 cases), significantly higher than 21.2%(14 cases)of non-smoking patients(P<0.05).The positive rate of PD-L1 of female patients was 82.0%(41 cases),significantly higher than 45.7%(21 cases)of male patients(P<0.05).The positive rate of PD-L1 of adenocarcinoma was 78.3%(47 cases),significantly higher than 41.7%(15 cases)of squamous cell carcinomas(P<0.05).The positive rate of PD-L1 of EGFR mutation type was 91.9%(34 cases),significantly higher than 47.5%(28 cases)of wild type(P<0.05).ConclusionsSmoking patients have higher PD-1 expression.PD-L1 is positively correlated with EGFR.Female patients and adenocarcinoma patients have high PD-L1 expression.The correlation between PD-L1 and EGFR may provide new evidence for individual immunotherapy combined with targeted therapy.

      Non-small cell lung cancer;PD-1;PD-L1;EGFR

      R734.2

      A

      10.3969/j.issn.1674-4659.2017.07.0915

      2017-03-30

      2017-06-02

      廣州市越秀區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目 (2014-WS-033)

      彭苗 (1982-),女,湖南湘潭人,碩士學(xué)位,主治醫(yī)師,研究方向:腫瘤的放射治療。

      *通訊作者:丁穎,E-mail:dy61321157@163.com。

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