β-catenin不同表達(dá)模式與結(jié)直腸癌臨床病理因素的關(guān)系

金 雯，陳順華，尹 玉，張 聰，曹立宇

β-catenin不同表達(dá)模式與結(jié)直腸癌臨床病理因素的關(guān)系

金 雯1,2，陳順華1,3，尹 玉1,3，張 聰1,3，曹立宇1,3

目的 探討β-catenin不同表達(dá)模式與結(jié)直腸癌組織臨床病理因素之間的關(guān)系及意義。方法 應(yīng)用免疫組化法檢測181例結(jié)直腸癌組織和30例正常結(jié)直腸黏膜中β-catenin的表達(dá)狀況。結(jié)果 181例結(jié)直腸癌組織中，β-catenin(細(xì)胞核)異位表達(dá)率為56.9%(103/181)，高于正常結(jié)直腸黏膜組(P<0.05)。β-catenin細(xì)胞核表達(dá)與組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床Dukes分期有關(guān)(P<0.05)，與患者年齡、性別、浸潤深度等均無關(guān)(P>0.05)。β-catenin細(xì)胞膜不完整表達(dá)與組織分化、腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況及Dukes分期等均有關(guān)(P<0.05)；β-catenin高表達(dá)與結(jié)直腸癌分化程度、Dukes分期有關(guān)(P<0.05)。82例隨訪病例中，β-catenin細(xì)胞核陽性患者的5年生存率均明顯低于β-catenin陰性組(P<0.05)。結(jié)論 β-catenin在結(jié)直腸癌發(fā)生中起重要作用，其不同表達(dá)模式與結(jié)直腸癌進(jìn)展有關(guān)，并有助于預(yù)后判斷，β-catenin有望成為結(jié)直腸癌基因診斷及基因治療的新靶點(diǎn)。

結(jié)直腸腫瘤；β-catenin；表達(dá)模式；免疫組織化學(xué)

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一。其發(fā)生與一系列癌基因、抑癌基因的改變有關(guān)[1]。近年來，有關(guān)細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路異常與結(jié)直腸癌的關(guān)系越來越受到關(guān)注，如Wnt/β-catenin信號通路；該信號通路可調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和分化；β-catenin是Wnt/β-catenin信號通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其基因突變與結(jié)直腸癌等多種腫瘤有關(guān)。β-catenin可表達(dá)于細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核[2]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組化法檢測結(jié)直腸癌組織及正常結(jié)直腸黏膜中β-catenin的表達(dá)狀況及表達(dá)模式，探討它們在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中的作用及與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 收集安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科2007年11月～2013年12月手術(shù)切除的結(jié)直腸癌標(biāo)本共181例。其中男性112例，女性69例；年齡31～89歲，中位年齡57.5歲。高分化腺癌44例，中分化腺癌105例，低分化腺癌32例；原始病理切片中有明確淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者82例(除外影像學(xué)、PET-CT診斷及孤立性癌細(xì)胞)，無明確淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者99例；Dukes分期：A期26例；B期53例，C+D期102例。另取30例距癌灶邊緣5 cm以上切緣的結(jié)直腸黏膜組織作為正常對照。所有病例臨床資料齊全，隨訪信息通過電話或其它途徑獲得，截止目前，其中82例已隨訪5年以上。

1.2 試劑及方法 標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，分別行HE及免疫組化染色。β-catenin多克隆抗體均購自Abcam公司，PBS緩沖液、枸櫞酸鹽抗原修復(fù)液及SP試劑盒均購自福州邁新公司。免疫組化染色步驟按SP染色試劑盒說明書操作，每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)陽性及陰性對照。

1.3 結(jié)果判斷 β-catenin可定位于細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核內(nèi)，陽性細(xì)胞呈淡黃～棕黃色顆粒，細(xì)胞核陽性即為異常表達(dá)，若β-catenin≤50%細(xì)胞核陽性即判定為低表達(dá)，β-catenin>50%細(xì)胞核陽性即判定為β-catenin高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。率的差異顯著性采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率計(jì)算法，兩者相關(guān)性檢驗(yàn)用Spearman相關(guān)分析。生存期分析采用Kaplan-Meier法，α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 β-catenin在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及意義 β-catenin定位于細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核，正常結(jié)直腸黏膜中見細(xì)胞膜完整的弱陽性表達(dá)，未見細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核或核/質(zhì)等異常表達(dá)；結(jié)直腸癌組織中可見細(xì)胞膜不同程度的表達(dá)(細(xì)胞膜部分表達(dá)或完全丟失)及細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核或核/質(zhì)等異位表達(dá)(圖1～6)，核異位表達(dá)率為56.9%(103/181)，明顯高于對應(yīng)的正常結(jié)直腸黏膜組織(P<0.05，表1)。

表1 β-catenin在結(jié)直腸癌組織和正常結(jié)直腸黏膜中的表達(dá)

2.2 β-catenin及其不同表達(dá)模式與結(jié)直腸癌臨床病理因素的關(guān)系 β-catenin在正常結(jié)直腸黏膜中僅見細(xì)胞膜完整的弱陽性表達(dá)，未見細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核或核/質(zhì)等異常表達(dá)；結(jié)直腸癌組織中β-catenin表現(xiàn)為不同程度的細(xì)胞膜表達(dá)丟失及細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核或核/質(zhì)等異位表達(dá)，在結(jié)直腸高分化腺癌中可見較多細(xì)胞膜表達(dá)，隨著組織分化越來越差(高分化腺癌→中分化腺癌→低分化腺癌)，細(xì)胞膜表達(dá)減少或細(xì)胞膜表達(dá)不完整，細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)/核表達(dá)增加(圖1～6)。β-catenin在結(jié)直腸癌組織中的陽性表達(dá)模式可分為：細(xì)胞核陽性、細(xì)胞膜陽性、細(xì)胞核及核/質(zhì)陽性、細(xì)胞膜陽性及細(xì)胞膜/質(zhì)/核同時(shí)陽性(圖1～6)；其中β-catenin細(xì)胞核表達(dá)與組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床Dukes分期有關(guān)(P<0.05)，與患者年齡、性別、浸潤深度等其它臨床病理因素?zé)o關(guān)(P>0.05，表2)；β-catenin細(xì)胞膜不完整表達(dá)與組織分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床Dukes分期等均有關(guān)(P<0.05)，與其它臨床病理因素?zé)o關(guān)(P>0.05)。本組181例中，包括4例結(jié)直腸絨毛狀腺瘤癌變病例，腺瘤區(qū)域僅見細(xì)胞膜陽性，未見細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核或核/質(zhì)等異常表達(dá)，癌變區(qū)域可見細(xì)胞核陽性，隨著結(jié)直腸癌組織分化越差，細(xì)胞膜表達(dá)減少，易發(fā)生浸潤、轉(zhuǎn)移，臨床分期較晚。根據(jù)β-catenin細(xì)胞核表達(dá)量可分為：低表達(dá)，≤50%的細(xì)胞核陽性；高表達(dá)；>50%的細(xì)胞核陽性；β-catenin高表達(dá)與結(jié)直腸癌組織分化程度、Dukes分期有關(guān)(P<0.05)，低分化組β-catenin高表達(dá)率明顯高于高分化組(P<0.05)，臨床Dukes C+D期患者β-catenin高表達(dá)率明顯高于A期(P<0.05)；β-catenin低表達(dá)率與患者年齡、性別、組織浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Dukes分期等臨床病理因素均無關(guān)(P>0.05，表3～5)。

①②③④⑤⑥

圖1 β-catenin在結(jié)直腸高分化腺癌中細(xì)胞核陽性，正常結(jié)直腸黏膜組織中未見異常表達(dá)(箭頭)，SP法 圖2 β-catenin在結(jié)直腸中～低分化腺癌中陽性，低分化區(qū)域表達(dá)明顯強(qiáng)于中分化腺癌(上側(cè)方框：低分化腺癌，下方：中分化腺癌)，SP法 圖3 β-catenin在結(jié)直腸低分化腺癌中細(xì)胞核陽性(右下圖示脈管侵犯)，SP法 圖4 β-catenin在結(jié)直腸中分化腺癌區(qū)域中細(xì)胞膜部分陽性(表達(dá)減少)，在低分化腺癌區(qū)域中細(xì)胞核及核/質(zhì)陽性，SP法 圖5 β-catenin在結(jié)直腸高分化腺癌中細(xì)胞膜陽性，在中分化腺癌中細(xì)胞核陽性(箭頭)，SP法 圖6 β-catenin在結(jié)直腸絨毛狀腺瘤中細(xì)胞膜部分陽性(表達(dá)減少)，在癌變區(qū)域細(xì)胞核陽性(箭頭)，SP法

表2 β-catenin蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系

與高分化組相比，*χ2=4.555，P=0.033，**χ2=5.760，P=0.016；與A期相比，#χ2=15.034，P=0.000，與B期相比，χ2=5.666，P=0.017

2.3 結(jié)直腸癌組織中β-catenin表達(dá)與患者生存期的關(guān)系 本組181例結(jié)直腸癌患者臨床資料齊全，其中82例患者已隨訪5年；按Dukes分期：A期19例；B期33例；C+D期30例；5年總生存率為50.0%(41/82)，其中A期為68.4(13/19)；B期為54.5%(18/33)，C+D期為33.3%(10/30)，差異有顯著性(P<0.05，表6)。43例β-catenin細(xì)胞核陽性組患者5年生存率明顯低于β-catenin細(xì)胞核陰性組(P<0.05，圖7)。

圖7 β-catenin細(xì)胞核表達(dá)與患者生存期的關(guān)系

表3 結(jié)直腸癌組織中β-catenin不同表達(dá)定位與臨床病理特征的關(guān)系

與高分化組相比，*χ2=7.540，P=0.006；#χ2=9.352，P=0.002；與A期相比，$χ2=5.676，P=0.017；與B期相比，χ2=8.502，P=0.004

表4 結(jié)直腸癌組織中β-catenin不同表達(dá)定位與臨床病理因素之間的關(guān)系

表5 結(jié)直腸癌組織中β-catenin細(xì)胞核過表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

與高分化組相比，*χ2=6.667，P=0.010，**χ2=4.710，P=0.030；與A期相比，#χ2=7.511，P=0.006；△≤50%細(xì)胞核表達(dá)為低表達(dá)，>50%細(xì)胞核表達(dá)為過表達(dá)

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)Wingless和Int-1基因編碼同一種蛋白，故統(tǒng)一命名為Wnt。Wnt信號通路在胚胎細(xì)胞黏附、細(xì)胞增殖和凋亡方面發(fā)揮重要作用[3]。Wnt信號通路可通過Wnt配體或下游組件突變的傳遞作用而激活。Wnt有多條信號通路，研究較多的是經(jīng)典Wnt信號通路，即Wnt/β-catenin信號通路。其主要成分包括Wnt家族分泌型糖蛋白(Wnt)、卷曲蛋白(frizzled, Frz)、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6(LRP5/6)、糖原合成酶激酶-3(GSK-3β)、軸蛋白(Axin)、松散蛋白(disheveled, Dsh)、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、結(jié)腸腺瘤樣息肉病(APC)蛋白、酪蛋白激酶1(casein kinase, CK1)、T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子(TCF/LEF)等[4]。在Wnt/β-catenin信號通路未被激活的正常細(xì)胞中，β-catenin主要與細(xì)胞膜的E-cadherin結(jié)合，少量游離的β-catenin 存在于細(xì)胞內(nèi)，其中部分可被細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Axin、APC、CK1和GSK3β 形成的破壞復(fù)合體通過泛素化后被降解，不能進(jìn)入核內(nèi)啟動下游靶基因轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，當(dāng) Wnt/β-Catenin信號通路激活時(shí)，Wnt蛋白(分泌型糖蛋白)與Frz及LRP5/6結(jié)合，活化Dsh蛋白，活化的Dsh可抑制GSK-3β活性，使β-catenin不能被磷酸化和降解，β-catenin不斷累積在細(xì)胞質(zhì)中，然后轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，與TCF/LEF結(jié)合，啟動下游靶基因轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，如c-myc、Cyclin D1等[5]，導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。

表6 結(jié)直腸癌Dukes分期與患者生存期之間的關(guān)系

與A期相比，$χ2=5.750，P=0.016

研究認(rèn)為Wnt/β-catenin信號通路異常與人類多種腫瘤相關(guān)，如肝癌、胃癌等[6-7]。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示正常結(jié)直腸黏膜中見細(xì)胞膜完整的弱陽性表達(dá)，未見細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核或核/質(zhì)等異常表達(dá)；結(jié)直腸癌組織中可見細(xì)胞膜不同程度的表達(dá)(細(xì)胞膜部分表達(dá)或完全丟失)及細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核或核/質(zhì)等異位表達(dá)，提示β-catenin細(xì)胞膜表達(dá)丟失及細(xì)胞核/質(zhì)等異位表達(dá)在結(jié)直腸癌的發(fā)生中起重要作用。在結(jié)直腸高分化腺癌中可見較多細(xì)胞膜表達(dá)，隨著組織分化越來越差(高分化腺癌→中分化腺癌→低分化腺癌)，細(xì)胞膜表達(dá)減少或細(xì)胞膜表達(dá)不完整，細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)/核表達(dá)增加，β-catenin細(xì)胞核表達(dá)與組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床Dukes分期有關(guān)，β-catenin細(xì)胞膜不完整表達(dá)與組織分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床Dukes分期等均有關(guān)(P<0.05)；推測可能是由于隨著組織分化越差，癌細(xì)胞β-catenin及E-Cadherin在細(xì)胞膜表達(dá)減少，腫瘤細(xì)胞間黏附能力下降，易發(fā)生組織浸潤及脈管轉(zhuǎn)移有關(guān)[8-9]。另外，本組4例為絨毛狀腺瘤惡變，在腺瘤區(qū)域僅見β-catenin細(xì)胞膜表達(dá)，未見細(xì)胞核陽性，在相鄰的癌變區(qū)域，可見細(xì)胞核表達(dá)，提示β-catenin可能在結(jié)直腸腺瘤癌變中起重要作用，檢測腺瘤β-catenin表達(dá)有助于腺瘤惡變的診斷。有研究認(rèn)為β-catenin細(xì)胞核高表達(dá)，臨床分期較晚的患者預(yù)后較差[10-13]。β-catenin細(xì)胞核高表達(dá)與結(jié)直腸癌組織的分化程度、Dukes分期有關(guān)(P<0.05)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[14]，提示β-catenin細(xì)胞表達(dá)量可作為結(jié)直腸癌患者預(yù)后判斷的指標(biāo)[15]，可能是由于β-catenin細(xì)胞核表達(dá)，促進(jìn)與細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移的有關(guān)基因轉(zhuǎn)錄及表達(dá)有關(guān)，如c-myc、Cycling D1、MMP-7及CD44等。另外，本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示β-catenin細(xì)胞核表達(dá)及胞膜不完整表達(dá)與組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床Dukes分期有關(guān)；β-catenin細(xì)胞核高表達(dá)與結(jié)直腸癌組織的分化程度、Dukes分期有關(guān)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，可能與本組病例選擇較為嚴(yán)格有關(guān)。在隨訪的82例結(jié)直腸癌患者中β-catenin細(xì)胞核陽性組患者5年生存率明顯低于陰性組，提示β-catenin細(xì)胞核表達(dá)可作為結(jié)直腸癌進(jìn)展及判斷預(yù)后的指標(biāo)。

總之，β-catenin在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，其不同表達(dá)模式與結(jié)直腸癌的發(fā)生及進(jìn)展有關(guān)，并有助于預(yù)后判斷，為以β-catenin為靶點(diǎn)的基因治療提供理論依據(jù)。

[1] Arnold C N, Goel A, Blum H E,etal. Molecular pathogenesis of colorectal cancer: implications for molecular diagnosis[J]. Cancer, 2005,104(10):2035-2047.

[2] Giles R H, Lolkema M P, Snijckers C M,etal. Interplay between VHL/HIF1 alpha and Wnt/beta-catenin pathways during colorectal tumorigenesis[J]. Oncogene, 2006,25(21):3065-3070.

[3] Koziński K, Dobrzyń A. Wnt signaling pathway: its role in regulation of cell metabolism[J]. Postepy Hig Med Dosw, 2013,26(67):1098-1108.

[4] Saito-Diaz K, Chen T W, Wang X,etal. The way Wnt works: components and mechanism[J]. Growth Factors, 2013,31(1):1-31.

[5] de Sousa E M, Vermeulen L, Richel D,etal. Targeting Wnt signaling in colon cancer stem cells[J]. Clin Cancer Res, 2011,17(4):647-653.

[6] Wands J R, Kim M. WNT/β-catenin signaling and hepatocellular carcinoma[J]. Hepatology, 2014,60(2):452-454.

[7] Hidaka Y, Mitomi H, Saito T,etal. Alteration in the Wnt/β-catenin signaling pathway in gastric neoplasias of fundic gland(chief cell predominant) type[J]. Hum Pathol, 2013,44(11):2438-2448.

[8] Ma Y R, Ren Z,Conner M G,etal. Reduced E-cadherin and aberrant β-catenin expression are associated with advanced disease in signet-ring cell carcinomas[J]. Appl Immunohistochem Mol Morphol, 2016 Jan 22. [Epub ahead of print].DOI:10.1097/PAI.0000000000000317.

[9] Onder T T, Gupta P B, Mani S A,etal. Loss of E-cadherin promotes metastasis via multiple downstream transcriptional pathways[J]. Cancer Res, 2008,68(10):3645-3654.

[10] Wang Z, Zhang H, Hou J,etal. Clinical implications of β-catenin protein expression in breast cancer[J].Int J Clin Pathol, 2015,8(11):14989-14994.

[11] Wang Z, Sheng Y Y, Gao X M,etal. β-catenin mutation is correlated with a favorable prognosis in patients with hepatocellular carcinoma[J]. Mol Clin Oncol, 2015,3(4):936-940.

[12] Deng F, Zhou K, Cui W,etal. Clinicopathological significance of Wnt/β-catenin signaling pathway in esophageal squamous cell carcinoma[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2015,8(3):3045-3053.

[13] Balzi M, Ringressi M N, Faraoni P,etal. B-cell lymphoma 2 and β-catenin expression in colorectal cancer and their prognostic role following surgery[J]. Mol Med Rep, 2015,12(1):553-560.

[14] Gao Z H, Lu C, Wang M X,etal. Differential β-catenin expression levels are associated with morphological features and prognosis of colorectal cancer[J]. Oncol Lett, 2014,8(5):2069-2076.

[15] 吳 健, 范欽和. 結(jié)直腸癌中TAZ和β-catenin的表達(dá)及意義[J]. 臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志, 2014,30(12):1346-1349.

Different expression patterns of β-catenin and its correlation with clinicopathological facters in colorectal cancer

JIN Wen1,2, CHEN Shun-hua1,3, YIN Yu1,3, ZHANG Cong1,3, CAO Li-yu1,3
(1DepartmentofPathology,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China;2TonglingVocationalandTechnicalCollege,Tongling244061,China;3TheFirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230022,China)

Purpose To observe different expression patterns of β-catenin and its clinical significance in colorectal cancer (CRC). Methods A total of 181 cases of CRC tissues and 30 cases of norma1 colorectal tissue were investigated by immunohistochemistry for the expression of β-catenin. Results The expression rate of β-catenin was 56.9%(103/181)in CRC, and higher than that in norma1 colorectal tissue(P<0.05). The overexpression of nuclear β-catenin was significantly correlated with histological differentiation, lymph node metastasis and Dukes’ stage in CRC (P<0.05), and no relationship with other pathological parameters, such as age, gender and the depth of infiltration. The incomplete membranous expression of β-catenin was significantly correlated with histological differentiation, the depth of infiltration, lymph node metastasis and Dukes’ stage in CRC (P<0.05). The high expression of nuclear β-catenin related to histological differentiation and Dukes’ stage in CRC (P<0.05). In the follow-up data of 82 cases of CRC, the expression of nuclear β-catenin was associated with poor prognosis, and the 5-year survival rate was significantly lower than that of self-control groups (P<0.05). Conclusion β-catenin plays important roles in colorectal carcinogenesis. Abnormal expression of β-catenin was related to the aggressive progression of CRC and may be helpful for evaluating the prognosis of patients with CRC. β-catenin is expected to become a new target for diagnosis and treatment of CRC in future.

colorectal neoplasms; β-catenin; expression patterns; immunohistochemistry

國家自然科學(xué)基金(81201536)、安徽省自然科學(xué)基金(KJ2013A150)

1安徽醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室，合肥 2300322銅陵職業(yè)技術(shù)學(xué)院基礎(chǔ)教研室，銅陵 2440613安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，合肥 230022

金 雯，女，碩士研究生，講師。E-mail: 117507844@qq.com 曹立宇，男，副教授，碩士生導(dǎo)師，通訊作者。E-mail: caoliyuhf@163.com

時(shí)間：2017-6-20 11:17 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170620.1117.002.html

R 735.34

A

1001-7399(2017)06-0596-06

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.06.002

接受日期：2017-03-29