茄萼花色苷合成相關基因DFR和MYB克隆及表達分析

王海竹，曲紅云，周婷婷，徐啟江

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茄萼花色苷合成相關基因和克隆及表達分析

王海竹1，曲紅云2，周婷婷1，徐啟江1

（1東北林業(yè)大學生命科學學院/林木遺傳育種國家重點實驗室，哈爾濱150040；2黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院園藝分院，哈爾濱 150040）

【目的】花色苷是一類通過類黃酮途徑合成的水溶性次生代謝產(chǎn)物，既能使植物的不同器官呈現(xiàn)紅、紫、藍等顏色，還有利于人體健康。紫茄富含花色苷，但是有關茄萼花色苷生物合成的分子機制還不是很清楚。本研究旨在通過克隆茄萼花色苷合成相關基因和，測定其在不同發(fā)育時期不同顏色茄萼中的表達量，探究和在茄萼花色苷合成中的作用?！痉椒ā窟x用綠萼和紫萼長茄（L.）果萼為試材，測定不同pH條件下茄萼花色苷含量；通過RACE方法分離克隆和cDNA全長序列，分析和的保守結構域及序列特征；分別對DFR和MYB及其同源蛋白序列進行系統(tǒng)進化分析，構建系統(tǒng)進化樹來進一步分析鑒定基因；使用ExPASy網(wǎng)站提供的在線分析軟件SOPMA預測蛋白質(zhì)二級結構；利用實時熒光定量PCR方法檢測目的基因在不同發(fā)育階段果萼中的表達情況?！窘Y果】從綠萼和紫萼長茄果萼中克隆了和片段，分別命名為、和、，GenBank登錄號分別為：KX224250、KX224251和KX224253、KX224254。和全長分別為1 285 bp和1 249 bp，開放閱讀框為858 bp和864 bp，分別編碼285個和287個氨基酸；和全長分別為969 bp和959 bp，開放閱讀框均為462 bp，編碼153個氨基酸。蛋白質(zhì)二級結構分析表明α-螺旋和無規(guī)則卷曲均為兩個DFR蛋白和兩個MYB蛋白的主要二級結構元件。序列比對表明DFR蛋白具有NADPH結構域（NADPH binding domain）和底物特異性結合結構域（Substrate specific binding domain），屬于NADB-Rossmann超基因家族；MYB蛋白屬于R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子，具有R2、R3兩個MYB結構域和bHLH結合域。和與和具有相對較高的同源性；和與同源性較高?；ㄉ蘸繙y定顯示，紫萼果茄萼花色苷含量較高且隨著果實的發(fā)育成熟而逐漸增加；而綠萼茄萼幾乎檢測不到花色苷。熒光實時定量PCR分析表明，和在紫萼長茄果萼中表達量均遠高于綠萼長茄；從初蕾期到盛花期，紫萼長茄果萼中和表達量逐漸升高，而綠萼長茄則幾乎沒有變化，與兩個品種茄萼顏色變化相一致?！窘Y論】和屬于NADB-Rossmann超基因家族，和為典型R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子，和在紫萼長茄果萼中表達明顯高于綠萼長茄。推測和在茄萼呈色中發(fā)揮作用，并且參與花色苷生物合成。

萼片；花色苷；；；基因表達；茄

0 引言

【研究意義】茄（）為茄科（）茄屬（）一年生草本植物，是在世界范圍內(nèi)廣泛種植的一種重要茄果類蔬菜作物[1]。紫茄富含花色苷，其濃度分別約為葡萄和洋蔥的2.34和7.08倍[2]?；ㄉ帐且环N天然水溶性類黃酮物質(zhì)，存在于植物的葉、花和果實中，不僅使各種蔬菜、花卉和果實呈現(xiàn)紅色、紫色和藍色，而且具有一定營養(yǎng)和藥理作用，如清除自由基、預防心血管疾病、神經(jīng)疾病、癌癥、糖尿病、炎癥等[3-4]。目前，對茄萼花色苷合成的分子調(diào)控機理知之甚少。因此，深入開展茄萼花色苷合成關鍵基因的研究有助于揭示茄萼與果皮花色苷合成分子調(diào)控機理的異同，為茄品質(zhì)育種提供理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M展】植物花瓣、組織和果實等顏色主要由植物次生代謝產(chǎn)物花色苷決定，屬于類黃酮物質(zhì)。花色苷需要一系列酶經(jīng)過3個階段合成，目前已對如矮牽牛[5]（）、玉米[6]（）及金魚草[7]（）等花色苷生物合成途徑有了較深入的研究。二氫黃酮醇4-還原酶（dihydroflavonol-4-reductase，DFR）是花色苷多酶合成途徑中最終形成色素的關鍵酶，在花色苷生物合成途徑的下游發(fā)揮重要作用，屬于NADPH（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate）依賴的短鏈還原酶家族[8]，能夠催化二氫黃酮醇類物質(zhì)，如二氫堪非醇（dihydrokaempferol，DHK）、二氫榭皮素（dihydroquercetin，DHQ）和二氫楊梅素（dihydromyricetin，DHM），在C4位發(fā)生立體特異的還原反應，分別生成無色花葵素、無色花青素和無色翠雀素[9]。不同物種的DFR具有較高同源性，存在保守的NADPH結合域和底物特異性結合域，對底物的特異性結合通常是由第134位氨基酸殘基決定[8]。在高等植物中，多數(shù)花色苷生物合成往往受諸多轉(zhuǎn)錄因子在不同時空上的組合調(diào)控。如R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子、bHLH轉(zhuǎn)錄因子和WD40蛋白等，三者形成轉(zhuǎn)錄復合體MYB-bHLH-WD40（MBW）而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用[10-11]。作為一種關鍵的轉(zhuǎn)錄因子，R2R3-MYB的上調(diào)能夠激活參與花色苷合成的某個或多個結構基因的表達，從而使植物組織積累花色苷。該基因已從箭葉淫羊藿（）[12]、梨（）[13]和甜櫻桃（L.）[14]等物種中克隆，并對其功能進行了解析。蘋果中調(diào)控花色苷合成途徑中所有結構基因的協(xié)同表達[15]；‘紅陽’獼猴桃中促進花色苷積累[16]；過表達番茄編碼MYB的，上調(diào)、、和轉(zhuǎn)錄水平[17]。【本研究切入點】茄從果萼和果皮顏色上劃分，一般有紫色萼紫色果皮、綠色萼紫色果皮和綠色萼白色果皮3種，關于茄果皮花色苷合成分子機制已有較深入研究[18-19]。但是，有關紫萼花色苷合成的分子機制還不清楚?！緮M解決的關鍵問題】以綠萼和紫萼長茄果萼為試驗材料，通過RACE方法克隆和，并對其編碼的產(chǎn)物進行生物信息學分析，同時運用實時熒光定量PCR技術，分析和在果萼生長過程中的表達模式，為深入闡釋茄子果萼中花色苷生物合成的分子機理提供理論基礎。

1 材料與方法

試驗于2014—2016年在東北林業(yè)大學生命科學學院進行。

1.1 試驗材料

以采摘自黑龍江省農(nóng)業(yè)科學研究院園藝分院的綠萼和紫萼長茄果萼為試驗材料，于2014年6月將上述兩種茄子分別分成初蕾期、盛蕾期、初花期和盛花期4個時期進行取材（圖1），液氮冰凍，保存于-80℃冰箱。

1.2 茄萼花色苷含量測定

參考WrolstanD等[20]的方法，采用不同pH條件下分光光度計方法測定茄萼花色苷含量。利用公式TA=A×MW×5×100×V/?；A=[A510nm（pH 1.0）-A700nm（pH 1.0）]-[A510nm（pH 4.5）-A700nm（pH 4.5）]計算花色苷的含量，其中花色苷總含量由TA表示，V代表混合液的體積（mL），摩爾吸收率26900由?表示，標準分子質(zhì)量449.2由MW表示，花色苷的總含量單位為mg/100 g。

1.3 RNA提取及基因全長克隆

采用TRIzol Plant（全式金公司，北京）試劑盒提取總RNA，利用P19E（表1）和反轉(zhuǎn)錄試劑盒（全式金公司，北京）反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以此為模板，進行特異性擴增。

表1 綠萼和紫萼長茄果萼DFR和MYB基因克隆引物

利用cDNA末端快速擴增（rapid amplification of cDNA ends，RACE）法克隆3′-cDNA序列，登陸NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）參照已發(fā)表的馬鈴薯和番茄等基因序列設計PCR上游引物3′RACE（表1），同時找到茄科植物與花色苷合成相關基因序列信息，根據(jù)番茄、矮牽牛、馬鈴薯、煙草和辣椒序列，在基因DNA結合域保守區(qū)設計PCR上游引物3′RACE（表1），上述引物設計均使用Primer Premier5.0，下游引物為P18E（表1）。PCR反應體系為20 μL：10×TransTaq HiFi BufferⅡ2 μL，dNTP Mixture 2 μL（2.5 mmol·L-1），模板cDNA 1 μL，上、下游引物各0.4 μL（20 μmol L-1），TransTaq HiFi DNA聚合酶0.2 μL（5 U μL-1），其余用蒸餾水補充。反應程序：95℃預變性5 min；30個循環(huán)（94℃變性30 s，56℃（）、55℃（）退火30 s，72℃延伸1 min）；最后72℃延伸7 min。目的條帶經(jīng)膠回收純化后，連接到pEASY-T5載體（全式金，北京）上，送至北京六合華大基因科技股份有限公司測序。

根據(jù)所得的3′-cDNA序列，設計5′RACE特異性引物ou-5'RACE GSP1、ou-5'RACE GSP2、dong-5′RACE GSP1、dong-5′RACE GSP2和-5′RACE GSP1、-5′RACE GSP2、dong-5′RACE GSP2、dong- 5′RACE GSP2（表1），用于巢式PCR。利用5′RACE GSP1和錨定引物Anchor（表1）以加dA尾的cDNA為模板進行5′-RACE擴增。為保證克隆片段的特異性，再用引物5′RACE GSP2和接頭引物Adaptor（表1）進行第二次5′-RACE擴增，克隆5′-cDNA序列，PCR反應體系、產(chǎn)物的回收純化、克隆、測序同3′-RACE。

1.4 綠萼和紫萼長茄果萼、生物信息學分析

用ORF Finder在線工具（http://www.ncbi.nlm.nih. gov/gorf/gorf. html）查找基因開放閱讀框（ORF）并推導其氨基酸序列；利用BLAST（http://blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi）對克隆的目的序列進行同源分析；利用DNAMAN軟件進行氨基酸的多序列比對，采用MEGA6.0軟件中的鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構建系統(tǒng)發(fā)育樹；使用ExPASy網(wǎng)站提供的在線分析軟件SOPMA預測蛋白質(zhì)二級結構。

1.5 綠萼和紫萼長茄果萼、實時熒光定量分析

分別提取綠萼長茄和紫萼長茄果萼4個時期的總RNA，用PrimeScript?RT reagent Kit Perfect Real Time（寶生物，大連）試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA備用。用7500 fast型實時熒光定量PCR儀和Power SYBR?Green PCR Master Mix試劑盒以上述cDNA為模板進行實時熒光定量PCR分析，所用引物如表1。20 μL反應體系：8.4 μL稀釋的cDNA模板（10 μg cDNA加200 μL水稀釋），上、下游引物各0.8 μL（10 μmol L-1），Power SYBR?Green PCR Master Mix（2×）10 μL。反應程序如下：95℃預變性2 min；40個循環(huán)（95℃ 10 s，60℃ 45 s）。以表達水平為內(nèi)參，引物為-F：CACTTAGCACCTTCCAGCAGATGT和-R：CTACAACAGCAGACCTGAGTTCACT。每個樣品設3個生物學重復，采用2–ΔΔCT法分析目的基因表達水平。

表2 綠萼和紫萼長茄萼片DFR和MYB基因表達分析引物

2 結果

2.1 果萼中花色苷含量分析

綠萼和紫萼長茄果萼的4個生長時期見圖1，花色苷含量的測定結果見圖2。結果表明，綠萼長茄果萼花色苷含量基本保持不變；而紫萼長茄隨生長時期的推移而呈現(xiàn)花色苷含量增加的趨勢，該變化趨勢與茄萼顏色逐漸加深成正相關趨勢，且在盛花期，花色苷積累更為明顯，并且在該時期紫萼長茄果萼花色苷含量約是綠萼長茄的5倍。

圖1 不同發(fā)育階段的綠萼和紫萼長茄果萼

圖2 綠萼和紫萼長茄果萼花色苷含量變化

2.2和的全長cDNA克隆及序列分析

克隆得到綠萼和紫萼長茄果萼（GenBank登錄號為KX224250）和（GenBank登錄號為KX224251）的cDNA全長序列。全長1 285 bp，開放閱讀框長858 bp，編碼285個氨基酸；全長1 249 bp，開放閱讀框長864 bp，編碼287個氨基酸。SOPMA預測的DFR蛋白二級結構預測結果（圖3-A、B）表明，和編碼的285和287個氨基酸殘基中，α螺旋分別占31.23%和32.06%、β轉(zhuǎn)角分別占11.93%和11.15%、無規(guī)則卷曲分別占35.79%和36.59%、延伸鏈分別占21.05%和20.21%。ouSmDFR和dongSmDFR氨基酸序列比對（圖4）發(fā)現(xiàn)，與dongSmDFR氨基酸序列相比，ouSmDFR在C末端缺少兩個氨基酸，并且在第229位氨基酸位點存在差異，但由于這些差異位點不在功能域內(nèi)，因而推測不會影響二氫黃酮醇4-還原酶的功能。

a：α螺旋；b：延伸鏈；c：β轉(zhuǎn)角；d：無規(guī)則卷曲

多重氨基酸序列比對結果（圖4）表明，和基因編碼的氨基酸序列一致性高達98%，此外還發(fā)現(xiàn)ouSmDFR和dongSmDFR蛋白是NADPH依賴型的還原酶，屬于NADB-Rossmann超基因家族（NADB-Rossmann superfamily），該基因家族具有兩個高度保守結構域，分別為NADPH結合結構域和底物特異性結合結構域，能將黃烷酮醇還原為無色花色素。

利用Mega6.0通過鄰位相連法（Neighbor-joining，NJ）構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5）。結果表明，綠萼和紫萼長茄果萼DFR蛋白與其他的茄科作物，如矮牽牛（×）、馬鈴薯（）和煙草（）親緣關系較近，且與StDFR序列相似性達73%左右，其次是與旋花科和龍膽科植物。綠萼長茄和紫萼與StDFR和GtDFR等DFR蛋白聚為一枝。

2.3和的全長cDNA克隆及序列分析

綠萼長茄（GenBank登錄號為KX224253）和紫萼長茄（GenBank 登錄號為KX224254）基因cDNA全長分別為969 bp和959 bp，開放閱讀框長均為462 bp，編碼153個氨基酸。SOPMA預測的蛋白二級結構預測（圖6-A、B）表明，和編碼的153個氨基酸殘基中，α螺旋均占39.22%、β轉(zhuǎn)角均占9.80%、無規(guī)則卷曲均占41.83%、延伸鏈均占9.15%，形成螺旋-螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結構。

方框處分別表示NADPH結合位點和底物特異性結合位點

多重氨基酸序列比對結果（圖7）表明，和基因所編碼的氨基酸序列具有兩個不完全重復的DNA結合結構域，分別為R2結構域和R3結構域，屬于典型的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子。由于MYB轉(zhuǎn)錄因子往往與bHLH蛋白形成復合物發(fā)揮作用，因此在R3結構域內(nèi)還存在一個bHLH結合結構域。

依據(jù)與DFR蛋白相同的方法構建MYB轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)發(fā)育樹（圖8），結果表明，綠萼長茄和紫萼長茄與箭葉淫羊藿（）進化關系最近，與葡萄（）、草莓（x）、玉米（）和馬鈴薯（）等親緣關系也相對較近，與擬南芥進化關系相對較遠。此外，ouSmMYB和dongSmMYB與AtMYB1和MdMYB10a等11個MYB蛋白聚為一枝，而AtPAP1和AtPAP2這兩個蛋白聚為另一枝。

基因登錄號分別是：AtDFR，NP_199094.1；StDFR，AAQ54578.1；NtDFR，ABN80437.1；PhDFR，AAF60298.1；SsDFR，ABP57077；IbDFR，BAA34637.1；GtDFR，BAA12736；LeDFR，BAF49318；PoDFR，ABF21084.1；SaDFR，ABQ97018；HaDFR，ABU93477；VmDFR，AF483835；DcDFR，AAD56578；HvDFR，AAB20555.1；CaDFR，NP_001311706.1；AhDFR，AID59206.1；RcDFR，BAH24302；PcDFR，AKV89243.1；OsDFR，AAD24584.3；SlDFR，NP_001234408.1；系統(tǒng)發(fā)育樹樹枝上面或下面的數(shù)字代表自舉值

a：α螺旋；b：延伸鏈；c：β轉(zhuǎn)角；d：不規(guī)則卷曲

直線方框處分別表示R2和R3保守結構域，虛線方框處表示bHLH結合結構域

基因登錄號分別是：VvMYBA1，BAD18977.1；VvMYBA2，BAD18978.1；VvMYBA3，BAD18979.1；VvMYBPA1，CAJ90831.1；MdMYB10a，ABB84753.1；AtMYB1，AAG42001.1；AtPAP1，EFH52994.1；AtPAP2.，EFH66345.1；StMYB113，ALA13583.1；SlMYB1，AAQ55181.1；ZmMYBPL，AAA33482.1；FaMYB1，AAK84064.1；EsMYB1，AFH03053.1。系統(tǒng)發(fā)育樹樹枝上面或下面的數(shù)字代表自舉值

2.4和基因的表達分析

實時熒光定量結果（圖9）表明，在綠萼長茄果萼中表達量最低，并且隨著生長，該基因的相對表達量幾乎無變化；而在紫萼長茄果萼中，從初蕾期到盛花期，相對表達量不斷增加，尤其是由初花期到盛花期生長時，增幅最為明顯，并且在盛花期高峰度表達，遠遠高于其在綠萼長茄果萼中的表達，相對表達量約是綠萼長茄的10倍。

圖9 ouSmDFR、dongSmDFR相對表達量

實時熒光定量結果（圖10）表明，在綠萼長茄果萼前三個時期表達量幾乎無變化，在第4個時期即盛花期出現(xiàn)小幅增加，但整體表達水平仍然較低；紫萼長茄，隨著生長，果萼中相對表達量均呈上升趨勢，并且從初花期到盛花期生長時，表達陡然增加，盛花期高峰度表達。此外，不論在哪個生長時期，在果萼中表達量均為紫萼長茄高于綠萼長茄，盛花期最為明顯，盛花期在紫萼長茄果萼中相對表達量大約是綠萼長茄的8倍。

圖10 ouSmMYB、dongSmMYB相對表達量

3 討論

本研究克隆綠萼長茄果萼和和紫萼長茄果萼和，對和編碼氨基酸序列與其他植物DFR進行多重序列比對發(fā)現(xiàn)均具有NADPH的結合位點和底物特異性結合位點，且高度保守，屬于NADB超基因家族[17]。前人研究發(fā)現(xiàn)不同物種中DFR與底物結合區(qū)氨基酸序列的改變決定其底物的種類[22-23]。研究者在棉花（）[24]、玫瑰（）[25]和葡萄風信子（）[26]等物種中克隆到同樣具有上述兩種結構域。進化分析表明，ouSmDFR和dongSmDFR與StDFR（）和SlDFR（）具有相對較高的同源性。

MYB蛋白序列分析和進化分析表明ouSmMYB和dongSmMYB轉(zhuǎn)錄因子與其他植物中花色苷途徑相關的MYB蛋白的氨基酸序列具有較高的同源性，在其N端具有2個DNA結合域，分別為R2結合域和R3結合域，屬于典型R2R3型MYB轉(zhuǎn)錄因子，還存在一個bHLH結合結構域[27-28]，為形成MBW復合物提供bHLH轉(zhuǎn)錄因子結合位點[29-30]。其結構特征與月季（）[31]和大豆（）[32]等其他植物的具有相同性。生物信息學分析結果表明，和與（）具有相對較高的同源性，推測在花色苷生物合成過程中具有相同的功能，還需通過生物工程試驗深入鑒定和的生物學功能。

和表達的實時熒光定量PCR結果表明，4個時期中和在兩種茄子的果萼中都有表達，且紫萼長茄高于綠萼長茄。相對表達量與呈正相關的關系，由于MYB轉(zhuǎn)錄因子往往是通過調(diào)控結構基因表達而影響花色苷合成，所以筆者推測MYB可能與存在相互作用，上調(diào)紫萼長茄果萼中表達，使其果萼呈現(xiàn)紫色。但是盛花期出現(xiàn)小幅增加，推測可能該基因可能還參與其他物質(zhì)的合成途徑。此外，參與花色苷生物合成途徑的基因分前期基因和后期基因，前期基因包括PAL（苯丙氨酸裂解酶）、CHI（查爾酮異構酶）、CHS（查耳酮合酶）和F3H（黃烷酮3-羥化酶）等相關基因，后期基因除了DFR還包括ANS /LDOX（花色苷合成酶/無色花色苷雙加氧酶）和UFGT（類黃酮3-O-糖基轉(zhuǎn)移酶）等相關基因，兩種茄子果萼顏色差異是否僅僅源于MYB轉(zhuǎn)錄因子對表達的調(diào)控仍需要進一步研究?！R克斯’紅洋梨的出現(xiàn)時因為PyMYB10正調(diào)控的表達[33]；蘋果MdMYB3參與調(diào)控蘋果花色苷合成[34]；葡萄漿果中VvMYBPA1調(diào)控表達，VvMYBA2促進表達，進而影響葡萄花色苷積累[35-36]；蕪菁（L.）中發(fā)現(xiàn)能夠促進花色苷積累[37]。所以后續(xù)將克隆參與綠萼長茄和紫萼長茄果萼花色苷合成途徑中所有結構基因，并對其表達進行分析，選取與表達趨勢一致的結構基因進行酵母單雜交試驗，確定MYB轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)控哪個或是哪幾個結構基因來影響果萼中花色苷積累，為闡釋綠萼長茄和紫萼長茄果萼顏色差異的分子機理奠定基礎。

研究發(fā)現(xiàn)，茄果皮花色苷的合成除受轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控外，一定程度上還受光信號的影響，‘藍山’茄果皮為紫色，而套袋處理后其果皮呈白色，但是，果萼顏色仍為紫色[19]，推測存在不同的調(diào)控機制分別調(diào)控茄果萼和果皮花色苷的生物合成，通過比較二者機制異同，完全理解花色苷合成和調(diào)節(jié)的因子以及相關酶類相互作用，為提高茄中花色苷含量、選育優(yōu)質(zhì)茄品種提供理論基礎。

4 結論

成功克隆綠萼和紫萼長茄果萼R和的cDNA序列，其中和編碼的氨基酸序列屬于NADB超基因家族，而ouSmMYB和dongSmMYB則具有R2R3型MYB轉(zhuǎn)錄因子的典型特征，其N端具有R2、R3兩個MYB結構域，C端高度特異。進化分析表明，ouSmDFR和dongSmDFR與馬鈴薯的DFR同源性較高；ouSmMYB和dongSmMYB與箭葉淫羊藿的MYB同源性較高。R和的表達分析推測其可能在綠萼和紫萼長茄果萼顏色差異形成中發(fā)揮作用。

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（責任編輯 趙伶俐）

Cloning and Expression Analysis of Anthocyanin Biosynthesis-associatedandGenes in Calyx of Eggplant (L.)

Wang HaiZhu1, Qu HongYun2, Zhou TingTing1, Xu QiJiang1

(1College of Life Science, Northeast Forestry University/State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Northeast Forestry University, Harbin 150040;2Horticultural Branch, Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150040)

【Objective】Anthocyanins are the water-soluble secondary metabolites synthesized via the flavonoid pathway responsible for red, violet, and blue indifferent kinds of plant organs. These pigments are of benefit to human health. Eggplant is rich in anthocyanins. The molecular mechanism of anthocyanin biosynthesis in eggplant calyx is still unclear. The primary objectives of this experiment are to cloneandgenes in the eggplant, detect their expression at different developmental stages and in calyx with different colors, explore the role ofandin anthocyanin synthesis in calyx of eggplant. This work expanded our knowledge about the molecular mechanism of anthocyanin biosynthesis in eggplant peel and calyx. 【Method】Green calyx and purple calyx of eggplants were used as materials. The content of anthocyanins in the calyx was measured by spectrophotometry at different pH. cDNA sequence of theandwere isolated and cloned by using RACE techniques.Analyze theconserved domains and characteristics of DFR protein were analyzed. Phylogenetic analysis of homologous protein sequences of other plants and DFR was conducted, the phylogenetic tree was constructed to further analyze and identify genes. To predict its secondary structure, SPOMA was used on-line which provided by the ExPAsy website. The bioinformatics analysis of MYB was the same as DFR. Expression ofandgenes in calyx with different colors were investigated through quantitative real-time PCR.【Result】In this study, two full-length cDNA sequences ofwere successfully cloned and denoted asand(GenBank accession Nos KX224250 and KX224251).is 1 285 bp in cDNA length with an open reading frame of 858 bp corresponding to 285 amino acid residues.is 1 249 bp in cDNA length with an open reading frame of 864 bp, which encoding 287 amino acids. Two full-length cDNA sequences ofgene were cloned and denoted asand(GenBank accession Nos KX224253 and KX224254). The corresponding cDNAs are 969 bp and 959 bp in length and the deduced proteins contained 153 amino acids, respectively. Results of secondary structure analysis exhibited that α-Helix and random coil were primary secondary structural components of the two DFR genes and two MYB genes. Sequence analysis showed that ouSmDFR and dongSmDFR have a NADPH-binding domain and substrate specific binding domain. ouSmMYB and dongSmMYB belonged to the R2R3-MYB transcription factors, which have R2 and R3 conserved domains and a bHLH binding domain. Phylogenetic tree analysis indicated thatandhave a close relation withand,andhave the closest genetic relationship with. Results of total anthocyanins measurement showed that high contents of anthocyanins were detected in purple calyx and increased gradually, while no anthocyanins were detected in green calyx. The qRT-PCR analysis indicated that the expression ofandgenes in the purple calyx were much higher than that in the green calyx. Moreover, from early budding to full flowering,the expression ofandincreased gradually. However,andalmost had no change, which were consistented with the color variation of calyx.【Conclusion】andbelong to the NADB-Rossmann superfamily,andare typical R2R3-MYB transcription factors. The expression ofandin the purple calyx is significantly higher than that in the green calyx. Therefore, it is speculated that the DFR and MYB genes play a role in the color of eggplants’ calyx. Furthermore, DFR and MYB are involved in the process of anthocyanin biosynthesis.

calyx; anthocyanins;;; gene expression;L.

2017-01-09；接受日期：2017-03-21

國家基礎科學人才培養(yǎng)基金（J1210053）、中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金（DL12CA10，2572014EA03）、林木遺傳育種國家重點實驗室創(chuàng)新項目（2013A06，2013B010）、黑龍江省博士后科研啟動金（LBH-Q14011）

王海竹，E-mail：18686870296@163.com。通信作者徐啟江，E-mail：qijiangxu@126.com