山東省辣椒主要病毒種類的分子檢測與鑒定

王少立，譚瑋萍，楊園園，代惠潔，孫曉輝，喬寧 , ，竺曉平

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山東省辣椒主要病毒種類的分子檢測與鑒定

王少立1，譚瑋萍1，楊園園1，代惠潔2，孫曉輝1，喬寧1, 2，竺曉平1

（1山東農(nóng)業(yè)大學植物保護學院/山東省蔬菜病蟲生物學重點實驗室，山東泰安 271018；2濰坊科技學院，山東壽光262700）

【目的】鑒定山東省辣椒上的主要病毒種類，明確該地區(qū)辣椒上的主要病毒病原?！痉椒ā?014—2015年，在山東省臨沂、日照、青島、煙臺、濰坊、淄博、濟寧、菏澤、聊城、德州共10個市（區(qū)）采集253份疑似感病的辣椒植株葉片，提取葉片總RNA和總DNA，利用雙生病毒的通用引物（PA/PB）、馬鈴薯卷葉病毒屬通用引物（POL-F/POL-R）及已報道侵染辣椒的主要病毒的檢測引物對樣品進行PCR、RT-PCR分子檢測與鑒定，將擴增得到的目的條帶經(jīng)凝膠回收試劑盒回收純化后連接到pMD18-T載體上，再送至公司進行克隆測序。分別將所得的PMMoV、PeVYV和BWYV序列在NCBI上利用BLAST進行檢索，利用DNAStar軟件中的Megalign將所得序列與GenBank中已登錄的世界各地有代表性的序列進行同源性比對，利用軟件Mega 5.05的Clustal W法進行多序列比對分析以及鄰接法（neighbor-joining，NJ）構建系統(tǒng)進化樹，系統(tǒng)進化樹中各分支置信度（Bootstrap）進行1 000次重復分析?！窘Y果】 PMMoV、CMV總檢出率分別為61.66%、60.08%；TMGMV、BBWV-2、BWYV、TMV發(fā)生也比較普遍，檢出率為41.90%、34.78%、33.20%和24.90%；PCV-2、ToMV、TYLCV、PVY、MABYV、PeVYV、PCV-1、ChiVMV、AMV發(fā)生侵染現(xiàn)象較少，檢出率分別為11.86%、9.88%、9.09%、6.72%、5.53%、3.56%、3.16%、0.79%和0.40%；未檢測到CaCV、PSV、ChiRSV、TSWV和ToMMV。通過對病毒復合侵染現(xiàn)象進行分析發(fā)現(xiàn)，病毒復合侵染率高達89.92%，其中3種病毒復合侵染現(xiàn)象最多，所占比例達28.63%，4種病毒復合侵染率為25.00%，2種病毒復合侵染率為21.77%，5種病毒復合侵染率為13.31%，一個辣椒樣品最多可同時感染6種病毒，侵染率為1.21%；對山東省10個地區(qū)的辣椒病毒檢測，結果表明在辣椒上檢出病毒種類最多的為臨沂、濟寧，檢測到12種病毒，其次是煙臺、聊城，檢測到11種病毒，濰坊、菏澤檢測到9種病毒，青島、德州檢測到8種病毒，日照檢測到7種病毒，淄博檢測到6種病毒，日照地區(qū)辣椒病毒復合侵染率最高，為100%，菏澤地區(qū)復合侵染率最低，為69.23%。分別根據(jù)PMMoV的部分基因序列、PeVYV部分、、基因序列以及BWYV部分、基因序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果表明本研究PMMoV山東分離物SD60與中國貴州分離物的親緣關系最近，PeVYV山東分離物SDRZ31-1與意大利IT83分離物的親緣關系最近，BWYV山東分離物SD與韓國分離物LS的親緣關系最近?！窘Y論】在山東省采集的253份辣椒樣品可被15種病毒侵染，PMMoV、CMV為主要病毒種類；在山東新檢測到的病毒有MABYV、PeVYV、BWYV、PCV-1和PCV-2；明確了山東省主要辣椒產(chǎn)區(qū)病毒病發(fā)生情況以及病毒種類的主次關系。

辣椒病毒?。焕苯份p斑駁病毒；甜菜西方黃化病毒；甜瓜蚜傳黃化病毒；復合侵染

0 引言

【研究意義】辣椒（）作為一種重要的蔬菜作物，不僅營養(yǎng)價值高，還是重要的調(diào)味料。近年來，中國辣椒種植面積不斷擴大，年播種面積在150—200萬hm2，占全國蔬菜總播種面積的8%—10%，居蔬菜首位[1]。隨著辣椒種植規(guī)模的逐步擴大，辣椒病毒病也愈發(fā)嚴重，已成為危害辣椒生產(chǎn)中的首要病害，給農(nóng)民造成巨大的經(jīng)濟損失，制約著辣椒產(chǎn)業(yè)的持續(xù)發(fā)展。山東省是全國6大辣椒主產(chǎn)區(qū)之一，種植規(guī)模逐年擴大，但是辣椒病毒病的發(fā)生也比較普遍，是制約辣椒產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素。因此，明確山東省辣椒主要病毒種類，對于辣椒病毒病的防控預警具有重要意義。【前人研究進展】國外報道侵染辣椒的病毒達67種[2]，而國內(nèi)現(xiàn)已鑒定出侵染辣椒的病毒種類有22種。辣椒能被黃瓜花葉病毒（，CMV）、煙草花葉病毒（，TMV）、辣椒輕斑駁病毒（，PMMoV）、辣椒斑駁病毒（，PepMoV）、辣椒脈斑駁病毒（，PVMV）、蠶豆萎蔫病毒（，BBWV）、馬鈴薯Y病毒（，PVY）、馬鈴薯X病毒（，PVX）、煙草蝕紋病毒（，TEV）、辣椒環(huán)斑病毒（，ChiRSV）、苜?；ㄈ~病毒（，AMV）、煙草脆裂病毒（，TRV）、番茄斑萎病毒（，TSWV）、花生黃斑病毒（，GYSV）、辣椒褪綠病毒（，CaCV）、番茄花葉病毒（，ToMV）、蕪菁花葉病毒（，TuMV）[3-12]、煙草輕型綠花葉病毒（，TMGMV）[13]、辣椒脈斑駁病毒（，ChiVMV）[14-15]等RNA病毒侵染；另外還被番茄黃化曲葉病毒（，TYLCV）、煙草曲莖病毒（，TbCSV）及中國辣椒黃化曲葉病毒（，PYLCCNV）[16-18]等DNA病毒侵染。近幾年發(fā)現(xiàn)侵染辣椒的病毒還有甜菜西方黃化病毒（，BWYV）[19]、番茄褪綠病毒（，ToCV）[20]。山東省作為重要的辣椒產(chǎn)區(qū)，辣椒病毒病發(fā)生也比較嚴重，楊超等[21]對侵染山東辣椒的黃瓜花葉病毒進行了研究，結果表明CMV是山東省辣椒病毒病的主要毒源之一；劉春香等[22]對壽光地區(qū)侵染辣椒的TYLCV進行了研究，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)的辣椒TYLCV感染率較高。【本研究切入點】山東是蔬菜大省，設施和露地辣椒種植面積較大，辣椒連作導致病毒病暴發(fā)，對辣椒的產(chǎn)量和品質(zhì)具有重大影響，對辣椒生產(chǎn)的危害日益擴大，目前還缺少對侵染山東地區(qū)辣椒的主要病毒種類全面系統(tǒng)的研究，也沒有山東省辣椒上病毒復合侵染情況的相關報道?！緮M解決的關鍵問題】明確山東辣椒病毒病病原的具體種類和病毒種類的主次關系，以及是否出現(xiàn)新病毒病害，為針對性地預警和防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗于2014—2016年在山東農(nóng)業(yè)大學植物保護學院完成。

1.1 材料

2014—2015年，在山東省的臨沂、日照、青島、煙臺、濰坊、淄博、濟寧、菏澤、聊城、德州等地共采集花葉、畸形、壞死等疑似感染病毒病的辣椒樣品253份，于-20℃冰箱中備用。

植物RNA提取試劑Trizol、DNA聚合酶、dNTPs及植物總RNA、DNA提取試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司；分子量標準Normal Run 250 bp-Ⅱ DNA ladder由上海捷瑞生物技術有限公司提供；凝膠回收試劑盒由AXYGEN生物技術有限公司提供；反轉錄試劑RNase M-MLV（RNase H-）、Recombinant Rnase Inhibitor由寶生物工程（TaKaRa）有限公司提供；其他生化試劑及普通化學試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。

1.2 總RNA和DNA提取、RT-PCR和PCR

分別根據(jù)試劑盒說明從辣椒樣品中提取總RNA、DNA。以辣椒感病葉片總RNA為模板，以各病毒特異性引物的下游引物為反轉錄引物，使用M-MLV合成病毒cDNA。反轉錄反應體系（5 μL）：RNA模板1.5 μL，下游引物0.5 μL，Rnase-Free H2O 1.0 μL，70℃變性10 min，立即放置冰上2 min，再加入以下試劑：5×M-MLV Buffer 1.0 μL，dNTP mixture（10 mmol·L-1）0.25 μL，RTase M-MLV（RNase H-）（200 U·μL-1）0.25 μL，RNase Inhibitor（40 U·μL-1）0.125 μL，RNase-Free H2O 0.375 μL，總體積為5 μL。42℃保溫60 min，再70℃保溫15 min。

PCR反應體系：取上述合成的cDNA或DNA液2 μl，加入2.5 μL 10×EasyTaq Buffer，1 μL dNTPs（2.5 mmol·L-1），上下游引物各1 μL，0.5 μLDNA聚合酶，17 μL ddH2O。擴增條件：94℃3 min后，94℃ 30 s、X℃ 30 s（溫度見表1）、72℃ 50 s，共30次循環(huán)，最后，72℃10 min。取PCR擴增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳，檢測并拍照。

1.3 PCR產(chǎn)物的回收及測序

將PCR電泳目的條帶參照凝膠回收試劑盒說明書進行純化、克隆，測序由鉑尚生物技術（上海）有限公司完成，測序結果提交NCBI核酸數(shù)據(jù)庫進行BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）序列比對。

1.4 PMMoV、PeVYV和BWYV序列分析

從采集的感病樣品中分別選取具有代表性PMMoV、辣椒脈黃化病毒（，PeVYV）和BWYV陽性克隆送鉑尚生物技術（上海）有限公司測序。分別將所得PMMoV、PeVYV和BWYV序列在NCBI上利用BLAST進行檢索，利用DNAStar軟件中的Megalign 將所得序列與GenBank中已登錄的世界各地有代表性的序列進行同源性比對，利用軟件Mega 5.05的Clustal W法進行多序列比對分析以及鄰接法（neighbor-joining，NJ）構建系統(tǒng)進化樹，系統(tǒng)進化樹中各分支置信度（Bootstrap）進行1 000次重復分析。

2 結果

2.1 侵染山東省辣椒的主要病毒種類及檢測結果

對采集的253份辣椒樣品提取總RNA，利用特異性引物進行RT-PCR擴增，取10 μL擴增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測分析（圖1）。

對采集的辣椒樣品進行PCR、RT-PCR檢測，結果表明（表2）檢出的病毒種類有15種：PMMoV、CMV、TMGMV、BBWV、BWYV、TMV、ToMV、TYLCV、PVY、甜瓜蚜傳黃化病毒（，MABYV）、PeVYV、辣椒潛隱病毒1（，PCV-1）、辣椒潛隱病毒2（2，PCV-2）、AMV和ChiVMV，而未檢測到CaCV、花生矮化病毒（，PSV）、ChiRSV、TSWV和番茄斑駁花葉病毒（，ToMMV）。有5個樣品未檢測到病毒，病毒檢出率高達98.02%。

表1 山東省辣椒病毒檢測所用引物

山東省10個地區(qū)的辣椒病毒檢測結果表明在辣椒上檢出病毒種類最多的地區(qū)是臨沂、濟寧，檢測到12種病毒，其次是煙臺、聊城，檢測到11種病毒，濰坊、菏澤檢測到9種病毒，青島、德州檢測到8種病毒，日照檢測到7種病毒，淄博檢測到6種病毒。

在檢出的病毒中（圖2），PMMoV與CMV的檢出率較高，分別為61.66%、60.08%，可能是危害山東省辣椒的主要病毒；TMGMV、BBWV、BWYV和TMV的侵染現(xiàn)象普遍，總檢出率為41.90%、34.78%、33.20%和24.90%；PCV-2、ToMV、TYLCV、PVY、MABYV、CABYV、PeVYV、PCV-1、ChiVMV和AMV的侵染現(xiàn)象較少，檢出率分別為9.88%、9.09%、6.72%、5.53%、3.56%、0.79%和0.40%，其中MABYV、PeVYV、BWYV、PCV-1和PCV-2，是山東省最新檢測到侵染辣椒的病毒。

表2 山東省辣椒上主要病毒的檢測結果

2.2 辣椒上病毒的復合侵染情況

在248份陽性樣品中，僅發(fā)現(xiàn)25份樣品為單一病毒的侵染，其余樣品為2種及以上病毒的復合侵染，復合侵染率為89.92%，其中以3種病毒復合侵染所占比例最高，為28.63%，4種病毒復合侵染率為25.00%，2種病毒的復合侵染率為21.77%，5種病毒復合侵染率為13.31%，6種病毒復合侵染率為1.21%。結果表明，山東地區(qū)辣椒上病毒復合侵染現(xiàn)象嚴重。

病毒復合侵染類型由圖3可知，2種病毒復合侵染類型主要是CMV+PMMoV，3種病毒復合侵染類型復雜，主要是CMV+BWYV+PMMoV，4種病毒復合侵染類型主要是CMV+PMMoV+BWYV+BBWV，5種病毒復合侵染現(xiàn)象較少，其中CMV+PMMoV+TMGMV+ BBWV+TMV是主要侵染類型，在所有樣品中只發(fā)現(xiàn)了3個樣品為6種病毒復合侵染，侵染類型是CMV+ TMV+ToMV+TMGMV+BWYV+PMMoV、CMV+ TMV+PVY+ToMV+PeVYV+PCV-2、CMV+TMV+ TMGMV+BWYV+ PCV-1+PCV-2。

對山東省主要辣椒產(chǎn)區(qū)的復合侵染現(xiàn)象進行分析，發(fā)現(xiàn)日照地區(qū)辣椒病毒復合侵染率最高，為100%，菏澤地區(qū)復合侵染率最低，為69.23%。聊城、德州、濟寧、煙臺、淄博地區(qū)以3種病毒復合侵染為主，濰坊、菏澤地區(qū)以4種病毒復合侵染為主，臨沂地區(qū)以5種病毒復合侵染為主，青島地區(qū)多以4種、5種病毒復合侵染為主，日照地區(qū)多為3種、4種、5種病毒復合侵染。

2.3 PMMoV、PeVYV、BWYV系統(tǒng)進化樹分析

2.3.1 PMMoV基因序列的系統(tǒng)進化樹分析 將PMMoV的基因序列與NCBI上的相應序列進行了比對，并對其進行核苷酸相似性分析，結果表明所得到的分離物與其他序列相似性為94.7%—99.5%，其中與中國貴州分離物（KC571248）相似性最高，為99.5%。所構建的系統(tǒng)進化樹也顯示，本研究所得的PMMoV山東分離物SD60（KR261606）與中國貴州分離物（KC571248）的親緣關系最近，聚集在一個進化枝上，并且與核苷酸相似性分析結果相同（圖4）。

2.3.2 PeVYV基因序列的系統(tǒng)進化樹分析 本研究所獲得的PeVYV部分序列（對應基因組2 888—3 843位，共956 bp，NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中PeVYV這一段序列登錄較多）上傳到NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中，序列包括部分編碼區(qū)，并獲得了相應的登錄號（KR226803）。運用DNAStar的Megalign軟件，將本研究所得的PeVYV的序列與世界各地的相關序列進行核苷酸相似性分析，結果表明其與選取序列的核苷酸相似性為94.4%—97.8%，與意大利分離物IT83相似性最高，為97.8%。利用Mega 5.05的NJ法構建系統(tǒng)進化樹，如圖5所示。本研究所得的PeVYV分離物SDRZ31-1（KR226803）與意大利分離物IT83（KU886193）的親緣關系最近，聚類在同一分支上，這與核苷酸相似性分析結果一致。

2.3.3 BWYV基因序列的系統(tǒng)進化樹分析 由于在NCBI核苷酸數(shù)據(jù)庫中，BWYV的全基因組序列較少，因此本研究選取其中長411 bp的序列（對應基因組3 562—3 972位，NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中這一段序列登錄較多），包含部分的，將該段序列與世界各地的相應序列進行比對。對BWYV序列進行核苷酸相似性分析，結果表明與選取的國內(nèi)外序列核苷酸相似性為86.6%—98.5%，與韓國分離物LS（KM076647）相似性最高，為98.5%。為了更好地分析BWYV的進化歷程和親緣關系，選取世界各地有代表性的BWYV序列構建系統(tǒng)進化樹。從系統(tǒng)進化樹中，可以看出BWYV山東分離物SD與韓國分離物LS（KM076647）的親緣關系最近，與核苷酸相似性分析結果一致，從而明確了該分離物隸屬于BWYV（圖6）。

3 討論

辣椒是一種重要的蔬菜，近年來，中國辣椒的種植面積逐年上升，但受辣椒病毒病的危害日益嚴重，對辣椒生產(chǎn)造成了重大的經(jīng)濟損失。北京[3]、天津[3,34]、遼寧[3]、江蘇[3]、吉林[3]、新疆[3]、重慶[4,20]、陜西[5,13]、四川[8]等地均對辣椒上的病毒種類進行過系統(tǒng)的研究。雖然前人對山東省侵染辣椒的CMV、TYLCV進行過研究，但缺乏對山東省辣椒上的病毒進行全面系統(tǒng)的調(diào)查研究。

本研究對山東省辣椒病毒病進行系統(tǒng)的調(diào)查與檢測，結果表明目前侵染山東省辣椒的病毒種類有15種，病毒檢出率較高，且復合侵染現(xiàn)象比較嚴重。通過對病毒復合侵染現(xiàn)象進行分析發(fā)現(xiàn)，其中3種病毒復合侵染現(xiàn)象最多，4種和2種復合侵染的次之，一個辣椒樣品最多被6種病毒同時侵染。PMMoV能與CMV、TMV、PVY、ToMV、BBWV、TMGMV、BWYV、PeVYV、MABYV、ChiVMV、TYLCV、PCV-1和PCV-2等病毒發(fā)生復合侵染，CMV與TMV、PVY、ToMV、BBWV、PMMoV、TMGMV、BWYV、PeVYV、MABYV、ChiVMV、TYLCV、PCV-1和PCV-2等病毒發(fā)生復合侵染，同樣地，能與10種以上病毒發(fā)生復合侵染病毒的還有TMV、TMGMV、BWYV、BBWV、PCV-2，并且這幾種病毒的檢出率都比較高，這可能與病毒的傳播方式以及辣椒的品種有關。辣椒病毒病的癥狀多種多樣，可能是由多種病毒復合侵染導致的，多種茄科蔬菜的大面積種植、種子土壤帶毒以及廣泛的傳毒媒介等均能導致復合侵染的發(fā)生，特別是傳毒介體，如CMV、TMV、BBWV、BWYV等病毒均能通過蚜蟲進行傳播，有的傳毒介體能攜帶傳播多種病毒，從而出現(xiàn)一種植物可被多種病毒侵染現(xiàn)象。病毒復合侵染能夠導致植物抗性喪失，危害更為嚴重。此外，本研究發(fā)現(xiàn)采集的一些樣本疑似感染辣椒病毒，但是在該樣本中未檢測到病毒，可能是由于植物的一些生理性病害或是藥害所致。

本研究中，PMMoV在辣椒上檢出率最高，而PeVYV和BWYV是侵染山東辣椒的新記錄，由于MABYV、PCV-1、PCV-2在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中登錄的序列較少，沒有構建系統(tǒng)發(fā)育樹，因而分別對PMMoV的基因序列、PeVYV的部分基因序列以及BWYV的部分基因序列構建了系統(tǒng)發(fā)育樹。從進化關系上來說，PMMoV和BWYV在進化上與寄主種類沒有關聯(lián)，可能與地域有一定關系，而PeVYV從進化樹上不能得出其與寄主和地域來源有無關聯(lián)。

MABYV[35]、BWYV、PeVYV[25]、PCV-1和PCV-2是山東省內(nèi)新發(fā)現(xiàn)的侵染辣椒的病毒。MABYV、PeVYV、BWYV同屬于黃癥病毒科（）馬鈴薯卷葉病毒屬（）成員，通過蚜蟲持久性傳播。發(fā)病植株上主要癥狀表現(xiàn)為葉脈黃化，嚴重時整個葉片黃化并向上卷曲，畸形，且發(fā)病植株矮化，果實變小。本研究發(fā)現(xiàn)，這3種病毒之間復合侵染現(xiàn)象普遍，這與該屬病毒能依靠蚜蟲進行傳播有關。2011年在土耳其和突尼斯等地的辣椒上發(fā)現(xiàn)了BWYV[36]，中國于2015年也報道了BWYV能侵染辣椒[18]。本研究在山東省辣椒上也發(fā)現(xiàn)了該病毒，且這一病毒的檢出率達到了33.2%，其發(fā)展已十分普遍，應該引起足夠的重視，防止出現(xiàn)這一病毒的大暴發(fā)，對這一病毒還需要進一步研究。PCV-1和PCV-2屬于雙分體病毒科，該科成員在寄主中含量很低，不引起寄主明顯的癥狀，這兩種病毒的基因組信息和功能研究較少，還需要進一步研究。

本研究所測到的15種病毒，大多是可以通過蚜蟲進行傳播，部分病毒通過粉虱進行傳播，且研究發(fā)現(xiàn)溫室種植的辣椒病毒檢出率明顯低于露天種植的辣椒病毒檢出率。目前山東省溫室大棚的蚜蟲防治初見成效，但大田種植防治蚜蟲環(huán)節(jié)薄弱，使蚜蟲量增加并加速了植物病毒的傳播，導致病毒危害日益加重。山東省是蔬菜大省，擁有國內(nèi)先進的工廠化育苗，并銷售國內(nèi)各地，因此要做好辣椒病毒病的相關調(diào)查，及時做好相關防治措施，以防止辣椒病毒病的大量暴發(fā)和傳播，造成經(jīng)濟損失。

4 結論

對采自山東省10個市（區(qū)）的253份辣椒樣品進行20種病毒的檢測，發(fā)現(xiàn)目前侵染山東辣椒的病毒種類有15種，其中PMMoV、CMV為主要病毒毒原，病毒檢出率均達到了60%以上，并且病毒的復合侵染現(xiàn)象比較嚴重。新發(fā)現(xiàn)了5種侵染山東省辣椒的病毒，分別為PeVYV、BWYV、MABYV、PCV-1和PCV-2。

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（責任編輯 岳梅）

Molecular Detection and Identification of Main Viruses on Pepper in Shandong Province

WANG ShaoLi1, TAN WeiPing1, YANG YuanYuan1, DAI HuiJie2, SUN XiaoHui1, QIAO Ning1,2, ZHU XiaoPing1

(1College of Plant Protection, Shandong Agricultural University/Shandong provincial key laboratory for Biology of Vegetable Diseases and Insect Pests, Taian 271018, Shandong;2WeiFang University of Science and Technology, Shouguang 262700, Shandong)

【Objective】 The objective of this study is to identify the main viruses causing pepper virus diseases in Shandong Province, China.【Method】In 2014-2015, a total of 253 susceptible pepper plant samples were collected from 10 urban areas (Linyi, Rizhao, Qingdao, Yantai, Weifang, Zibo, Jining, Heze, Liaocheng, Dezhou) in Shandong Province. Total RNA and DNA were extracted from the leaves of pepper samples, and were subjected to detect viruses with Geminivirus universal primers (PA/PB), Polerovirus universal primers (POL-F/POL-R) and specific primers of main viruses infecting pepper have been reported by PCR and reverse transcription-PCR (RT-PCR). Each amplified fragment was purified by DNA gel extraction kit, cloned into pMD18-T vector and sequenced. The obtained sequences of PMMoV, PeVYV and BWYV were subjected to BLAST search, and compared with the representative sequences of GenBank which had been registered around the world using the Megalign in DNAStar software. Clustal W method of Mega 5.05 was used for multiple sequence alignment analysis and the phylogenetic tree were constructed by neighbor-joining (NJ) of Mega 5.05, with the bootstrap of each branch of phylogenetic tree analyzed 1 000 times. 【Result】The PMMoV and CMV had the highest detection rate, were 61.66% and 60.08%, respectively. TMGMV, BBWV-2, BWYV and TMV were popular with the detection rate of 41.90%, 34.78%, 33.20% and 24.90%, respectively. The detection rates of PCV-2, ToMV, TYLCV, PVY, MABYV, PeVYV, PCV-1, ChiVMV andAMV were 11.86%, 9.88%, 9.09%, 6.72%, 5.53%, 3.56%, 3.16%, 0.79% and 0.40%, respectively. No CaCV, PSV, ChiRSV, TSWVand ToMMV were detected. The complex infection phenomenon showed that co-infections were up to 89.92%, three kinds of viruses mixed infection occurs the highest rate, up to 28.63%, followed by four kinds of viruses mixed infection, up to 25.00%, two kinds of viruses mixed infection, up to 21.77%, five kinds of viruses mixed infection up to 13.31%, and 6 viruses detected in one sample is the extreme case, with the mixed infection rate up to 1.21%. Phylogenetic trees were constructed with partialof PMMoV, partial,andgenesof PeVYV and partialandgenes of BWYV, respectively. PMMoV Shandong isolate SD60 and the China Guizhou isolate had the closest relationship, PeVYV-SDRZ31-1 and Italy isolate IT83 shared the closest relationship, BWYV Shandong isolate SD clustered with Korean isolate LS. 【Conclusion】 Fifteen viruses were detected, among which PMMoV and CMV were the main pathogens. The newly detected viruses are MABYV, PeVYV, BWYV, MABYV, PCV-1 and PCV-2 in pepper in Shandong Province. The occurrence of viral diseases and the primary and secondary relationship of the main types of pepper viruses in Shandong province were clarified.

pepper virus diseases;(PMMoV);(BWYV);(MABYV); complex infection

2017-01-18；接受日期：2017-03-23

國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201303028）、山東省科技發(fā)展計劃（2014GNC111008）

王少立，E-mail：wangshaolisdau@163.com。通信作者竺曉平，Tel：0538-8247781-8510；E-mail：zhuxp@sdau.edu.cn