棉花內(nèi)生蠟狀芽孢桿菌YUPP-10對棉花黃萎病的 防治作用及機制

周京龍，馮自力，馮鴻杰，李云卿，袁媛，李志芳，魏鋒，師勇強，趙麗紅，孫正祥，朱荷琴，周燚

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棉花內(nèi)生蠟狀芽孢桿菌YUPP-10對棉花黃萎病的 防治作用及機制

周京龍1,2，馮自力2，馮鴻杰2，李云卿2，袁媛2，李志芳2，魏鋒2，師勇強2，趙麗紅2，孫正祥1，朱荷琴2，周燚1

（1長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北荊州 434025；2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/棉花生物學(xué)國家重點實驗室，河南安陽 455000）

【目的】棉花黃萎病(Verticillium wilt)是世界性難以防治的病害，篩選有效的生防微生物資源成為解決棉花黃萎病的重要途徑之一，本研究旨在分離一株高效拮抗細菌，并明確其防治機理，為生物防治棉花黃萎病提供技術(shù)支持?！痉椒ā坑闷细示厶亲鳛樘荚春Y選一株能夠降解-1,4糖苷鍵的棉花內(nèi)生細菌YUPP-10，通過平板對峙培養(yǎng)、平板對扣培養(yǎng)和懸滴法等測定YUPP-10對大麗輪枝菌()菌絲生長和孢子萌發(fā)的抑制效果；用YUPP-10無菌濾液培養(yǎng)大麗輪枝菌微菌核，檢測其對微菌核萌發(fā)的影響；利用基質(zhì)接種法進行盆栽試驗探究其對棉花黃萎病的防治效果；通過胚根、葉片接種病原菌，木質(zhì)化和活性氧爆發(fā)研究YUPP-10誘導(dǎo)抗病能力；采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）方法檢測防御相關(guān)基因的表達?！窘Y(jié)果】成功獲取一株蠟狀芽孢桿菌（）YUPP-10，其整體代謝產(chǎn)物在7 d時對大麗輪枝菌的抑菌帶寬為0.73 cm，揮發(fā)性代謝產(chǎn)物在10 d時對大麗輪枝菌菌落的抑制率為77.03%；YUPP-10無菌培養(yǎng)液對大麗輪枝菌孢子和菌核萌發(fā)的抑制率分別為17.22%—71.25%和10.69%—26.62%，且抑制率與無菌濾液的濃度呈正相關(guān)。在用YUPP-10玉米蛭石培養(yǎng)物拌土處理的盆栽試驗中，其對棉花黃萎病的最高防效達到80.60%。誘導(dǎo)抗性試驗發(fā)現(xiàn)YUPP-10誘導(dǎo)了胚根和葉片抗大麗輪枝菌的侵染，誘導(dǎo)了細胞木質(zhì)化和活性氧的爆發(fā)。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示YUPP-10成功激活了苯丙氨酸解氨酶（）、過氧化物酶（）、多酚氧化酶（）、幾丁質(zhì)酶（）和病程相關(guān)基因（）的表達，對大麗輪枝菌在棉花體內(nèi)的擴散和生長起到了抑制作用?！窘Y(jié)論】YUPP-10通過直接抑制病原菌的生長，同時誘導(dǎo)植物防御反應(yīng)來抵抗病原菌的侵染和擴展，其具有良好的應(yīng)用前景。

內(nèi)生細菌；棉花黃萎??；誘導(dǎo)抗性；防御機理

0 引言

【研究意義】真菌病害對作物產(chǎn)量和食品安全均構(gòu)成了嚴重威脅，黃萎?。╒erticillium wilt）作為一種維管束真菌病害，對重要的經(jīng)濟作物造成了巨大損失，如香蕉、棉花和番茄等。棉花黃萎病是由大麗輪枝菌（）引起的土傳病害，世界各地均有報道，是世界范圍內(nèi)最重要的棉花病害[1]。隨著中國棉花產(chǎn)區(qū)和規(guī)模的固定化，連作導(dǎo)致棉花黃萎病日趨嚴重。然而由于病原菌的寄主、傳播途徑和致病機理多而復(fù)雜，目前尚無理想的防治措施。在現(xiàn)有防治措施中，抗病育種因選育周期長且缺乏天然抗性資源而受到限制，化學(xué)防治對環(huán)境污染嚴重且對土傳病害防治效果不佳，生物防治符合綠色、安全的現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展需求，成為防治棉花黃萎病的重要途徑?！厩叭搜芯窟M展】黃萎病的生物防治包括拮抗真菌、拮抗細菌、拮抗放線菌和誘導(dǎo)系統(tǒng)抗病性等。其中，細菌種類和數(shù)量無論在植物組織中還是根際土壤或其他環(huán)境中都較大，且植物組織中的內(nèi)生細菌，其強拮抗性菌株的比例較高，因此植物內(nèi)生細菌作為生防資源受到廣泛關(guān)注。內(nèi)生細菌在已經(jīng)研究的植物中均有發(fā)現(xiàn)，存在于寄主植物的組織內(nèi)部，卻沒有侵染寄主的負面作用[2-3]，并能與寄主形成一系列不同的關(guān)系，包括共生、互惠、共棲和營養(yǎng)寄生等[4]。另外，內(nèi)生細菌在植物中的定殖類似于病原體的生態(tài)位，使得其適合作為生物防治劑[5]。拮抗內(nèi)生細菌在植物病蟲害的防治上已有很多報道。目前已經(jīng)研究應(yīng)用的拮抗細菌多為芽孢桿菌（spp.），如枯草芽孢桿菌（）[6]、解淀粉芽孢桿菌（）[7]和蠟狀芽孢桿菌（）[8]等。還包括一些類芽孢桿菌（spp.）、熒光假單胞（）和伯克霍爾德氏菌（spp.）等。其中枯草芽孢桿菌已被登記為農(nóng)藥，研究較多。蠟狀芽孢桿菌作為拮抗菌的研究相對較少，國際上多用蠟狀芽孢桿菌作為產(chǎn)蛋白的工程菌、重金屬的吸附菌和環(huán)境的改良菌等。報道中利用蠟狀芽孢桿菌作為拮抗資源的有通過產(chǎn)幾丁酶防治棉花立枯病、茄子黃萎病、鷹嘴豆灰霉病和番茄灰霉病等[9-12]、產(chǎn)生非蛋白抗菌物質(zhì)[13]、促植物生長抗病[14]和誘導(dǎo)系統(tǒng)抗病性等[15-16]?！颈狙芯壳腥朦c】關(guān)于蠟狀芽孢桿菌防治棉花黃萎病的研究較少，國內(nèi)有從苦豆子、焮麻和土壤中分離到的蠟狀芽孢桿菌對棉花黃萎病具有防治效果的報道，但防治機理尚不明確，其中對棉花內(nèi)生蠟狀芽孢桿菌用于棉花黃萎病防治的研究更少。本研究定向篩選具有生防潛力的棉花內(nèi)生細菌用于棉花黃萎病的防治，以提供一種綠色、無公害的生物防治菌株。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過富集培養(yǎng)篩選一株能降解-1,4糖苷鍵的內(nèi)生細菌，研究其代謝產(chǎn)物對大麗輪枝菌菌絲生長、孢子和微菌核萌發(fā)的影響，制成的生防菌劑對棉花黃萎病的防治效果。探究其誘導(dǎo)植物抗病能力，揭示該菌株誘導(dǎo)棉花防御病害的作用機理，以期為生物防治棉花黃萎病提供新的拮抗資源。

1 材料與方法

試驗于2015—2017年在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所完成。

1.1 供試菌株及棉花材料

強致病力大麗輪枝菌Vd080（菌種保藏號：CGMCC No.5904）分離自中國河北省辛集市病棉，保存于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所棉花病害實驗室；試驗選用棉花耐病品種魯棉研21號。

1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基、Czapek培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、富集培養(yǎng)基（0.5% polypepton+100 g konjac curds）利用魔芋精粉（konjac curds）作為唯一碳源，魔芋精粉主要成分為葡苷聚糖，通過-1,4糖苷鍵將D-葡萄糖和D-甘露糖按（1.6—2.0）﹕1結(jié)合形成的線性隨機共聚物[17-19]，真菌細胞壁主要成分幾丁質(zhì)也是通過-1,4糖苷鍵聚合-乙酰葡糖胺形成的線性聚合物[20]，能夠利用葡甘聚糖作為碳源的細菌也具有水解幾丁質(zhì)-1,4糖苷鍵的活性。

1.3 解葡苷聚糖內(nèi)生細菌的分離

選取健康棉株去皮，在超凈工作臺中用75%乙醇消毒1 min，無菌水洗滌3次，3%次氯酸鈉消毒3 min，無菌水洗滌3次，剪碎，在滅菌研缽中加少量無菌水研磨，將研磨液涂布于富集培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，挑取單菌落繼續(xù)在富集培養(yǎng)基上進行純培養(yǎng)。

1.4 解葡苷聚糖內(nèi)生細菌的鑒定

利用Omega公司的Bacterial DNA Kit試劑盒提取內(nèi)生細菌的基因組DNA，利用16S rDNA的通用引物1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）和27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）進行PCR擴增，將擴增序列在GENEWIZ公司進行測序，將測序結(jié)果與EZ taxon數(shù)據(jù)庫中的序列進行同源性比對，利用ClustalX和Mega軟件將測序結(jié)果與同源性相近的菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 內(nèi)生細菌對大麗輪枝菌拮抗作用的檢測

1.5.1 對峙培養(yǎng)法測定內(nèi)生細菌對大麗輪枝菌的影響 將篩選到的YUPP-10在LB固體平板上活化，選取單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，置于37℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h作為菌種，以1%接種量接種YUPP-10，37℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，獲得YUPP-10培養(yǎng)液備用。在PDA平板培養(yǎng)基中心接種已經(jīng)活化的直徑為5 mm的Vd080菌餅，呈三角狀對稱在PDA平板中打孔，每孔距離中心20 mm，在其中兩孔接入100 μL YUPP-10培養(yǎng)液，剩余一孔加入100 μL LB液體培養(yǎng)基作為對照，單獨接種Vd080作為空白對照，每個處理重復(fù)3次，25℃恒溫培養(yǎng)觀察抑菌情況，7 d后測量抑菌帶寬。

1.5.2 對扣培養(yǎng)法[21]測定內(nèi)生細菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對大麗輪枝菌的影響 在PDA平板培養(yǎng)基中心接種已經(jīng)活化的直徑為5 mm的Vd080菌餅，在LB固體平板上接種20 μL已經(jīng)活化的YUPP-10培養(yǎng)液（培養(yǎng)液制備方法同1.5.1），將兩個平板對扣密封，25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d。以病原菌與空白的LB平板對峙培養(yǎng)作為對照，每個處理重復(fù)3次。利用十字交叉法測定病原真菌菌落直徑，計算抑制率。菌落直徑（cm）=測量菌落直徑-0.5；相對抑制率（%）=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100。

1.5.3 懸滴法[22]測定內(nèi)生細菌非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對大麗輪枝菌孢子萌發(fā)的影響 將內(nèi)生細菌培養(yǎng)液（培養(yǎng)液制備方法同1.5.1）在4℃，5 000 r/min離心10 min，用0.22 μm的濾芯過濾上清液除菌。取無菌濾液原液、1/2稀釋液和1/4稀釋液100 μL，與等量的Vd080孢子懸浮液（2×103cfu/mL，Czapek培養(yǎng)液）均勻混合，取20 μL懸滴于凹玻片上，在25℃下保濕培養(yǎng)，3 h后鏡檢孢子萌發(fā)情況，以LB培養(yǎng)液與Vd080孢子懸浮液的等體積混合液為對照，每處理重復(fù)3次。

1.5.4 混合培養(yǎng)法測定內(nèi)生細菌非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對大麗輪枝菌菌核萌發(fā)的影響 微菌核的培養(yǎng)及其懸浮液的制備參照Hu等的方法[23-24]。取100 μL微菌核懸浮液與等量的YUPP-10無菌濾液（細菌無菌濾液制備同方法1.5.3），置于20℃下培養(yǎng)24 h后鏡檢，檢測其萌發(fā)率，每處理重復(fù)3次，每次觀察100個微菌核的萌發(fā)情況。微菌核長出的芽管長度超過微菌核直徑的一半視為萌發(fā)。

1.6 內(nèi)生細菌對棉花黃萎病防治效果的測定

裝有玉米蛭石（質(zhì)量比1﹕1）培養(yǎng)基的克氏瓶滅菌后，接種15 mL活化的細菌菌種（菌種的制備方法同1.5.1），在37℃恒溫培養(yǎng)72 h，取出培養(yǎng)物，自然風(fēng)干制成微生物菌劑。將菌劑按1%、2%和4%的質(zhì)量比與蛭石沙土基質(zhì)均勻混合，制作營養(yǎng)缽。紙缽制作、棉苗培育和病原菌的接種方法參照蛭石沙子無底紙缽定量蘸菌液法[25]。將3%次氯酸鈉消毒的魯棉研21號浸種12 h，以每缽8粒種子的密度種植在營養(yǎng)缽中。每6個營養(yǎng)缽為一個處理，每處理重復(fù)4次，以蛭石沙土基質(zhì)混合無菌培養(yǎng)物的營養(yǎng)缽為對照。在溫度為23—30℃，相對濕度60%以上的日光溫室中培養(yǎng)17 d后，待一片真葉初現(xiàn)時每缽接種10 mL Vd080孢子懸浮液（1×107cfu/mL，Czapek培養(yǎng)液）。接種病原菌25 d后調(diào)查病情，參照趙麗紅等[26]5級分級標準進行病情的調(diào)查統(tǒng)計，計算病情指數(shù)和防治效果，同時剖桿觀察維管束褐變情況。病情指數(shù)=[ Σ (級數(shù)×每級的病株數(shù)) / (調(diào)查的總株數(shù)×4) ]×100；防治效果（%）=[ (對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)) / 對照病情指數(shù)]×100。

1.7 內(nèi)生細菌誘導(dǎo)棉花抗性的檢測

1.7.1 浸種誘導(dǎo)抗性 經(jīng)3%次氯酸鈉消毒的魯棉研21號棉籽在細菌培養(yǎng)液（OD600=0.2）（細菌培養(yǎng)液的制備方法同1.5.1）中浸種18 h，用無菌水洗滌3次，置于培養(yǎng)皿中25℃保濕培養(yǎng)，2 d后在培養(yǎng)皿中接種1 mL Vd080孢子懸浮液（1×104cfu/mL），繼續(xù)培養(yǎng)3—4 d后觀察根部損傷程度。以LB培養(yǎng)基浸種作為對照。將棉苗根部縱切，虎紅染液（含虎紅1%的1 mol·L-1NaOH溶液）染色1 min，光學(xué)顯微鏡下鏡檢。

1.7.2 灌根誘導(dǎo)抗性 魯棉研21號經(jīng)3%次氯酸鈉消毒后，在無菌水中浸種催芽24 h，播種于滅菌的蛭石沙土培養(yǎng)基中，待長到3片真葉時，用細菌培養(yǎng)液（細菌培養(yǎng)液的制備方法同1.5.1）灌根處理，48 h后取真葉進行表面消毒，置于水瓊脂平板中，在葉片表面接種Vd080菌餅，25℃恒溫培養(yǎng)7 d，觀察葉面損傷情況。以LB培養(yǎng)基灌根作為對照，每處理重復(fù)3次。

1.8 內(nèi)生細菌誘導(dǎo)棉花活性氧爆發(fā)的檢測

棉苗的培養(yǎng)方法同1.7.2，長出2片真葉后，用細菌培養(yǎng)液（細菌培養(yǎng)液的制備方法同1.5.1）進行灌根處理，每處理重復(fù)3次，以LB液體培養(yǎng)基灌根處理為對照。48 h后取長勢相近的葉片，將葉片用無菌水洗滌3次置于5 mL的離心管中，取適量3,3 -二氨基聯(lián)苯胺（DAB）染液（1 mg·mL-1，pH 7.5），室溫避光染色8 h；去除染液，加適量95%乙醇沸水浴2 min脫去葉綠素，去除液體，加適量無水乙醇在沸水浴中繼續(xù)脫色，直至綠色完全去除；將葉片浸漬于70%甘油中，趕出葉片細胞間氣泡，將葉片置于載玻片上鏡檢。

1.9 內(nèi)生細菌誘導(dǎo)棉花細胞木質(zhì)化的檢測

棉苗的培育方法同1.7.2，待一片真葉初現(xiàn)時，用細菌培養(yǎng)液（細菌培養(yǎng)液的制備方法同1.5.1）進行灌根處理，以LB液體培養(yǎng)基灌根處理為對照，將處理和對照各分為兩組，2 d后對照和處理的兩個組分別接種Vd080孢子懸浮液和Czapek培養(yǎng)基，2 d后取長勢相近的棉花，橫切下胚軸，將切片置于載玻片上，用10%的間苯三酚染液（溶于無水乙醇中）染色2 min，用濃硫酸孵育片刻，置于光學(xué)顯微鏡下迅速觀察拍照。

1.10 內(nèi)生細菌誘導(dǎo)棉花防御相關(guān)基因表達的測定

棉花幼苗的培育、內(nèi)生細菌的接種、Vd080的接種、取樣、RNA的提取、cDNA第一鏈的合成和熒光定量PCR的方法參照張蕓等[27]CEF-082對棉花黃萎病控制作用的研究過程。將棉花中高度保守的作為內(nèi)參，棉花部分防御基因的特異引物見表1[28-29]。

1.11 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 解葡苷聚糖內(nèi)生細菌的分離鑒定

在富集選擇培養(yǎng)基上成功獲得一株能利用葡苷聚糖作為碳源的棉花內(nèi)生細菌，提取所分離到的內(nèi)生細菌總基因組DNA，利用16S rDNA通用引物進行PCR，將得到的擴增片段交由北京金唯智公司測序。測序結(jié)果與EZ taxon中的序列比對后，其與模式菌株ATCC 14579T（AE016877）的相似度達100%，驗證可信度達100%，確定該內(nèi)生細菌為一株蠟狀芽孢桿菌，記為蠟狀芽孢桿菌（）YUPP-10（圖1）。

表1 防御相關(guān)基因的特異引物

圖1 基于YUPP-10 16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 YUPP-10對大麗輪枝菌的抑制作用

2.2.1 YUPP-10對大麗輪枝菌菌絲生長的抑制作用 平板對峙試驗結(jié)果顯示，空白對照中Vd080生長正常；而在接種細菌的處理中，菌落生長受到抑制，平均抑菌帶寬為0.73 cm（圖2）。表明代謝產(chǎn)物對大麗輪枝菌菌落生長有抑制作用。

A、B：YUPP-10處理treated by YUPP-10；C：LB培養(yǎng)基處理treated by LB medium：D：空白對照only inoculated with Vd080 as blank control

2.2.2 YUPP-10揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對大麗輪枝菌菌絲生長的抑制作用 平板對扣試驗結(jié)果顯示，在空白對照中Vd080生長正常，10 d后菌落直徑為4.40 cm；而在處理中，菌落生長受到抑制，菌落邊緣呈不規(guī)則鋸齒狀，菌絲生長抑制率達到77.33%，表明內(nèi)生細菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對大麗輪枝菌的生長具有顯著的抑制作用（圖3）。

A：YUPP-10處理Inoculated with Vd080 and treated with YUPP-10；B：LB培養(yǎng)基處理Inoculated with Vd080 and treated with LB

2.2.3 YUPP-10對大麗輪枝菌孢子萌發(fā)的抑制作用 懸滴法培養(yǎng)孢子，3 h后通過光學(xué)顯微鏡觀察孢子萌發(fā)情況，結(jié)果表明，對照組的孢子萌發(fā)率為59.21%，無菌濾液原液、1/2稀釋液和1/4稀釋液對孢子萌發(fā)的抑制率分別為71.25%、43.33%和17.22%，無菌濾液對大麗輪枝菌孢子萌發(fā)的抑制率在試驗中的濃度范圍內(nèi)均表現(xiàn)出了顯著差異，且孢子的萌發(fā)率與培養(yǎng)液的濃度呈線性關(guān)系（圖4）。

2.2.4 YUPP-10對大麗輪枝菌微菌核萌發(fā)的抑制作用 混合培養(yǎng)微菌核與細菌培養(yǎng)無菌濾液，暗培養(yǎng)24 h，利用光學(xué)顯微鏡觀察微菌核萌發(fā)情況，并計算萌發(fā)率。結(jié)果表明對照的萌發(fā)率為81.22%，原液、1/2稀釋液和1/4稀釋液的萌發(fā)抑制率分別為26.62%、19.92%和10.69%，其中無菌濾液原液和1/2稀釋液對大麗輪枝菌微菌核萌發(fā)的抑制率與對照存在顯著差異，1/4稀釋液對微菌核萌發(fā)的影響與對照比差異不顯著，且菌核萌發(fā)率與無菌濾液的濃度呈線性關(guān)系（圖5）。

1：LB培養(yǎng)基LB medium；2：1/4稀釋液1/4-fold dilution culture solution；3：1/2稀釋液 1/2-fold dilution culture；4：原培養(yǎng)液 Original culture solution。不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）Different lowercases indicated significant difference at P＜0.05 level。圖5同 The same as Fig. 5

圖5 YUPP-10對菌核萌發(fā)的影響

2.3 YUPP-10對棉花黃萎病的防治效果

在內(nèi)生細菌菌劑拌土盆栽的結(jié)果中，菌劑處理與對照相比顯著降低了棉花病株率和病情指數(shù)，防治效果最高達到80.60%（表2），魯棉研21號為耐病品種，YUPP-10處理后使其達到抗性水平，說明YUPP-10對棉花黃萎病具有較好的防治效果。剖稈觀察，YUPP-10處理后莖稈褐變程度明顯低于對照（圖6）。

圖6 YUPP-10處理棉花對黃萎病的防治效果

2.4 YUPP-10誘導(dǎo)胚根抗大麗輪枝菌的侵染

YUPP-10浸種處理后，在恒溫箱中保濕培養(yǎng)，2 d后接種Vd080，5 d后觀察發(fā)現(xiàn)用YUPP-10浸種后的胚根，只有根尖部分被病原菌侵染壞死，而對照胚根3/4以上被傷害，壞死十分嚴重。同時，將胚根縱切用虎紅染液染色后，YUPP-10處理的細胞中大麗輪枝菌定殖量明顯低于對照（圖7）。

2.5 YUPP-10誘導(dǎo)葉片抗大麗輪枝菌的侵染

YUPP-10灌根處理后，真葉經(jīng)表面消毒置于水瓊脂平板上，在葉片表面接種Vd080菌餅，7 d后觀察到葉片表面有很少的菌絲附著，壞死面積很小，而對照中，葉片表面有大量菌絲定殖，損傷程度較重（圖8）。

表2 YUPP-10菌劑處理對棉花黃萎病病株率、病情指數(shù)的影響及防治效果

同列數(shù)據(jù)后不同字母表示差異顯著（＜0.05） Data with different letters in the same column indicated significant difference at＜0.05 level

圖7 YUPP-10誘導(dǎo)棉花抗大麗輪枝菌

圖8 YUPP-10誘導(dǎo)棉花葉片抗大麗輪枝菌

2.6 YUPP-10誘導(dǎo)葉片活性氧的爆發(fā)

使用DAB染色組織的方法檢測葉片中活性氧的爆發(fā)，YUPP-10灌根處理的葉片觀察到較多的褐色沉淀，而對照中，褐色沉淀較少，表明YUPP-10引起了棉花葉片活性氧的爆發(fā)（圖9）。

2.7 YUPP-10誘導(dǎo)木質(zhì)部的加厚

YUPP-10灌根處理后，將下胚軸橫切用10%間苯三酚染色，濃硫酸孵育后立刻鏡檢觀察YUPP-10處理后對棉花下胚軸細胞木質(zhì)化的影響。通過光學(xué)顯微鏡觀察到在用YUPP-10處理后，木質(zhì)部明顯加厚，接種Vd080孢子液后，幼苗木質(zhì)部進一步加厚。說明YUPP-10和病原菌都可誘導(dǎo)木質(zhì)部加厚，但在YUPP-10處理后，木質(zhì)化更為明顯，這對抵御黃萎病的侵染具有積極作用（圖10）。

圖9 YUPP-10引起棉花葉片活性氧爆發(fā)

圖10 棉花莖部細胞木質(zhì)化

2.8 YUPP-10誘導(dǎo)棉花防御相關(guān)基因的表達

在YUPP-10處理4 d后接種Vd080孢子懸浮液，分別于接菌后12、24、48和72 h取樣，提取棉花葉片RNA，通過qRT-PCR檢測了苯丙氨酸解氨酶（）、過氧化物酶（）、多酚氧化酶（）、絲裂原活化蛋白激酶（）、幾丁質(zhì)酶（）和病程相關(guān)基因（）的表達。結(jié)果表明YUPP-10成功誘導(dǎo)了、、、和的表達，然而未檢測到的熒光信號。其中，在接種Vd080后12 h表達量達到最大值，最高表達量為對照的11.0倍；、、和在接種Vd080后24 h表達量達到最大值，最高表達量分別是對照的8.8、4.3和4.3倍；在接種Vd080后48 h表達量達到最大值，最高表達量是對照的1.2倍（圖11）。

CK為先用LB處理后接種Vd080；YUPP-10為先用YUPP-10培養(yǎng)液處理后接種Vd080。不同大寫字母表示差異極顯著（P＜0.01） CK meant cotton first treated with LB medium, and then inoculated with Vd080. YUPP-10 meant cotton first treated with YUPP-10 culture solution, and then inoculated with Vd080. Different uppercases indicated extremely significant difference at P＜0.01 level

3 討論

本研究通過定向篩選能夠降解葡苷聚糖的棉花內(nèi)生細菌，成功從棉花維管束中分離到一株蠟狀芽孢桿菌。鑒于葡苷聚糖的分子結(jié)構(gòu)與真菌細胞壁幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)類似，故該菌也具有破壞幾丁質(zhì)的能力，從而使所篩選的菌株對真菌病害具有廣譜抑制能力。其屬于棉花內(nèi)生細菌，通過長期的植物與微生物協(xié)同進化，該內(nèi)生細菌不會對棉花植株造成病變。有益的植物-微生物互作，促進植物的健康發(fā)展一直是重要的研究課題，而多數(shù)研究集中在根際細菌[5,30]，YUPP-10分離自棉花維管束，相對于根際細菌定殖于根部起生防作用的特點，YUPP-10能成功定殖于棉花維管束中起作用，對棉花土傳維管束病害-黃萎病的防治具有突出優(yōu)勢。在研究生防菌的同時評估新物種對原有微環(huán)境的危害十分重要[31]，植物內(nèi)生細菌對植物本身而言并非“新”物種，故而不會對寄主植物造成危害。棉花內(nèi)生蠟狀芽孢桿菌在棉花黃萎病的防治應(yīng)用中報道較少，而所篩選的內(nèi)生細菌用于本寄主病害的防治，有利于生防菌在植物體內(nèi)定殖，具有現(xiàn)實的研究意義。

生防菌通過種間或種內(nèi)的相互作用關(guān)系來實現(xiàn)對病害的控制，如競爭、寄生、溶菌作用、通過次生代謝產(chǎn)物抗菌、誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性、促進植物生長、提高植物防御力和調(diào)節(jié)寄主的微生態(tài)環(huán)境等途徑。大多情況下一種生防菌可同時通過多種防御機制實現(xiàn)對病害的有效控制。本研究中YUPP-10的代謝產(chǎn)物對大麗輪枝菌菌絲的生長、孢子的萌發(fā)和微菌核的萌發(fā)均有顯著的抑制作用。但對微菌核萌發(fā)的抑制率最高只有26.62%，這可能與微菌核的形態(tài)結(jié)構(gòu)有關(guān)，微菌核作為一種休眠體，其表皮細胞壁厚且堅硬，具有極強的抗逆能力，故而殺死微菌核較為困難。蠟狀芽孢桿菌可通過產(chǎn)生抗生素來抵抗病原菌，如硫醚抗生素[13]，也可產(chǎn)生各種酶來對病原菌進行有效控制，如溶菌酶[32]。然而對于YUPP-10的關(guān)鍵抑菌物質(zhì)的成分尚未明確，從其能夠利用葡苷聚糖作為碳源的代謝方式推想，該菌可能分泌一種能夠降解-1,4糖苷鍵的酶，這種酶在降解病原真菌細胞壁的過程中起著重要的作用，但這一推論還需試驗證明。

微生物揮發(fā)性化合物與病原菌形成拮抗關(guān)系也有諸多報道，這些揮發(fā)性氣體可作為抗生素直接抑制病原真菌菌絲的生長和孢子的萌發(fā)[33-34]，但是這種情況在自然條件下幾乎不可能發(fā)生，因為只有揮發(fā)性氣體的濃度足夠高才可能出現(xiàn)拮抗作用[35]。有研究表明植物根際微生物散發(fā)的揮發(fā)性化合物能引起植物的防御反應(yīng)以達到抗病目的[36-37]。本研究發(fā)現(xiàn)YUPP-10的揮發(fā)性氣體對大麗輪枝菌菌絲的生長有顯著的抑制作用，YUPP-10能否激發(fā)植物系統(tǒng)抗病性還有待進一步的研究。

在本研究設(shè)計的3個菌劑濃度中，YUPP-10對棉花黃萎病都表現(xiàn)出了理想的防治效果，表明其有用作大田病害防治的潛能。在土傳病害的防治中，作物輪作、抗性品種選育和化學(xué)防治，不足以控制重要作物病害的發(fā)生[38]，因此生物制劑成為替代化學(xué)農(nóng)藥最為環(huán)保的選擇[39]，也是補充現(xiàn)有防治措施不足的重要選擇。目前，已有蠟狀芽孢桿菌ANTI-8098A獲得生物農(nóng)藥登記，其對青枯病具有較好的防治效果，本研究發(fā)現(xiàn)的蠟狀芽孢桿菌對黃萎病菌高度拮抗，將進一步研究其對棉花生育期其他病害的防治效果，并結(jié)合現(xiàn)有栽培技術(shù)，提供更為簡潔高效的使用方式，以期在大田中實現(xiàn)對棉花病害的防治。

生防菌防治植物病害的一個重要方式是激發(fā)植物自身的免疫應(yīng)答機制，可被有益微生物通過局部激發(fā)植物體對病原菌的廣譜抗性[40]，即誘導(dǎo)系統(tǒng)抗病性。其次植物也可被病原菌激發(fā)系統(tǒng)獲得抗病性[41]，二者均可增強植物的基礎(chǔ)抗性?；钚匝踝鳛橐环N信號分子，在引起抗性方面具有重要作用[42]，木質(zhì)素被視為阻止病原菌生長的重要屏障[43]。YUPP-10培養(yǎng)液浸種處理后，顯著降低了大麗輪枝菌對供試棉花胚根的侵染，減少了大麗輪枝菌在胚根中的定殖。在用YUPP-10灌根處理后，其成功誘導(dǎo)下胚軸細胞的木質(zhì)化和葉片活性氧的爆發(fā)。PAL、POD和PPO作為防御酶，可催化或參與植物木質(zhì)素和酚類化合物的合成，這些酚類和木質(zhì)素類物質(zhì)與植物形成抵抗病原菌的屏障有關(guān)，本研究中發(fā)現(xiàn)用YUPP-10處理后，供試棉花中3種防御酶在病原菌侵染初期表達量會顯著升高，并在病原菌侵染24 h達到最大值。PR10蛋白具有核酸酶相似結(jié)構(gòu)和活性，該酶能有效提高植物的抗病能力，本研究中在接種病原菌12 h后開始持續(xù)大量表達，在48 h后達到最大值。CHI是植物防御反應(yīng)中的重要防衛(wèi)因子，通過降解病原真菌菌絲體的細胞壁幾丁質(zhì)達到抑制菌絲生長的目的，YUPP-10處理后的棉花在受到大麗輪枝菌侵染后，的表達量在12 h時急劇上升，隨后有所下降，但在48 h內(nèi)表達量顯著高于對照。被認為是水楊酸（SA）信號通路的標志基因[44]，YUPP-10誘導(dǎo)大量表達，表明其在誘導(dǎo)植物抗病能力的過程中激活了SA信號通路，至于YUPP-10是否對乙烯（ET）和茉莉酸甲酯（JA）信號通路有影響，還有待研究。另外，YUPP-10在誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗病性的完整通路還需進一步的探索。

4 結(jié)論

棉花內(nèi)生蠟狀芽孢桿菌YUPP-10能有效抑制棉花黃萎病菌菌絲的生長、孢子和微菌核的萌發(fā)，其揮發(fā)性代謝產(chǎn)物同樣能抑制病原菌菌絲的生長。此外，YUPP-10成功誘導(dǎo)了棉花胚根和葉片抗病原菌的侵染，同時引起了活性氧的爆發(fā)、細胞木質(zhì)化及防御相關(guān)基因的表達，說明YUPP-10通過直接抑制病原菌生長和誘導(dǎo)植物產(chǎn)生防御反應(yīng)，抵御病原菌在棉花體內(nèi)侵染和擴展，而達到防治黃萎病的目的。

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（責任編輯 岳梅）

Biocontrol effect and mechanism of cotton endophytic bacteriumYUPP-10 against Verticillium wilt in

ZHOU Jinglong1,2, FENG Zili2, FENG Hongjie2, LI Yunqing2, YUAN Yuan2, LI Zhifang2, WEI Feng2, SHI Yongqiang2, ZHAO Lihong2, SUN Zhengxiang1, ZHU Heqin2, ZHOU Yi1

(1College of Agriculture, Yangtze University, Jingzhou 434025, Hubei;2Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences/State Key Laboratory of Cotton Biology, Anyang 455000, Henan)

【Objective】Control of Verticillium wilt is a worldwide problem in agriculture and horticulture, screening of effective biocontrol microbial resources has become one of the important ways to control Verticillium wilt. The use of microbial antagonists to control these pathologies fits modern sustainable agriculture criteria. The objective of this study is to screen an efficient antagonistic bacteria, and characterize the biocontrol mechanism of bacteria against Verticillium wilt, thus providing a technical basis for control of Verticillium wilt of cotton with biocontrol bacteria. 【Method】An endophytic bacterium, which can hydrolyze polysaccharides with-1,4 linkage, was isolated by enrichment medium, which was made of konjac glucomannan as carbon source. The inhibition and prevention of YUPP-10 againstand Verticillium wilt were tested. The inhibition rate of YUPP-10 againstwas assessed using the confront culture method, enclosed chamber test and hanging drop method, cultured microsclerotia with aseptic culture filtrate, and the control effect of cottonon Verticillium wilt was detected by substrate inoculation method in a pot experiment. Induced disease resistance of YUPP-10 in cotton were analysed by embryo and leaves inoculated with, sedimentation of lignin and reactive oxygen species (ROS). In addition, the expression level of defense genes inleaves were detected by real-time quantitative PCR (qRT-PCR). 【Result】Aisolate YUPP-10 was screened. The results showed that YUPP-10 and its volatile organic compounds significantly inhibited the colony growth ofwith the width of the inhibition zone of YUPP-10 was 0.73 cm after 7 days, and the inhibition rate of volatile organic compounds of YUPP-10 was 77.03% after 10 days.YUPP-10 culture filtrate (CF) suppressedspore and microsclerotia germination in a dose-dependent manner. The inhibition rate of CF onspore and microsclerotia germination ranged from 17.22% to 71.25% and 10.69% to 26.62%, respectively. The inhibition rate was 80.60%, when cotton seedlings were pro-inoculated with substrate containing YUPP-10 in a pot experiment. YUPP-10 induced disease resistance, including immature embryo and leaves against, ROS, sedimentation of lignin and some defense genes, such as,,,and.【Conclusion】It was concluded that YUPP-10 is an efficient biocontrol agent that protects cotton plant frominfection. Our data demonstrate thatgrowth is restricted and the additional signals from YUPP-10 must participate in the regulation of the immune response against. Therefore, the YUPP-10 has a great potential in controlling Verticillium wilt.

endophytic bacterium; Verticillium wilt; induced resistance; defense mechanism

2017-01-20；接受日期：2017-03-17

國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201503109）、中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項（1610162016012）

周京龍，E-mail：jing_long_z@163.com。馮自力，E-mail：fzlsky@126.com。周京龍和馮自力為同等貢獻作者。通信作者周燚，E-mail：yiyizhzh@yahoo.com.cn。通信作者朱荷琴，E-mail：heqinanyang@sohu.com