雞3種主要DNA病毒多重感染復(fù)合PCR檢測(cè)方法的建立

李學(xué)伍，劉媛，王麗，鄧瑞廣，趙東，楊繼飛，柴書(shū)軍

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州450002; 2.河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南洛陽(yáng)471023)

雞3種主要DNA病毒多重感染復(fù)合PCR檢測(cè)方法的建立

李學(xué)伍1，劉媛2，王麗1，鄧瑞廣1，趙東1，楊繼飛1，柴書(shū)軍1

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州450002; 2.河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南洛陽(yáng)471023)

依據(jù)GenBank中注冊(cè)的雞馬立克氏病病毒(MDV)、雞傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)、雞痘病毒(FPV)基因組核苷酸序列中的保守序列設(shè)計(jì)引物，3種病毒各設(shè)計(jì)3對(duì)引物，共計(jì)9對(duì)引物，經(jīng)生物學(xué)軟件篩選后，得到3對(duì)相互匹配較佳的引物。3對(duì)匹配引物經(jīng)單一PCR驗(yàn)證后，優(yōu)化復(fù)合PCR反應(yīng)條件，確定最佳的退火溫度、引物濃度和Taq DNA聚合酶濃度;經(jīng)特異性、敏感性試驗(yàn)及簡(jiǎn)化PCR試驗(yàn)，建立簡(jiǎn)易復(fù)合PCR檢測(cè)方法。復(fù)合PCR擴(kuò)增出的3條帶大小與預(yù)期一致，即228 bp(MDV)、400 bp(ILTV)、499 bp(FPV);建立的復(fù)合PCR方法能同時(shí)檢測(cè)出100 fg MDV、ILTV、FPV的DNA。同時(shí)依據(jù)PCR技術(shù)原理，將經(jīng)典的三溫?zé)嵫h(huán)改進(jìn)為二溫?zé)嵫h(huán)試驗(yàn)，即將退火和延伸合并為一步(62℃)，縮短了反應(yīng)時(shí)間。建立的3種病毒的復(fù)合PCR檢測(cè)方法具有較高的特異性和敏感性，可以用于臨床病料的快速診斷。

馬立克氏病病毒;傳染性喉氣管炎病毒;雞痘病毒;DNA病毒;復(fù)合PCR

雞馬立克氏病、傳染性喉氣管炎、雞痘分別是由馬立克氏病病毒(Marek’s disease virus，MDV)、傳染性喉氣管炎病毒(infectious laryngotracheitis virus，ILTV)、雞痘病毒(fowlpox virus，F(xiàn)PV)引起的雞病毒性傳染病，病原體均為線性雙股DNA病毒，其中MDV、ILTV為皰疹病毒科成員，F(xiàn)PV為痘病毒科成員［1-2］。MDV和ILTV一旦感染雞群則終身帶毒，2種病毒均存在于很多雞場(chǎng)，在非免疫雞場(chǎng)往往引起大群發(fā)病，即便在嚴(yán)格免疫的雞場(chǎng)也時(shí)常發(fā)病，很難根除;雞痘是雞常見(jiàn)的傳染病，在不同年齡段的雞群中經(jīng)常發(fā)生，往往造成雛雞的大批死亡。上述雞的3種傳染病均呈世界性分布，在我國(guó)許多養(yǎng)雞場(chǎng)呈現(xiàn)不同程度的流行，是嚴(yán)重危害我國(guó)養(yǎng)雞業(yè)健康發(fā)展的3大主要疫?。?-4］。

隨著雞病毒類疫苗的反復(fù)多次和長(zhǎng)期注射，病毒基因組被大量注入雞的體內(nèi)，病毒的重組與變異逐漸顯現(xiàn)，臨床上出現(xiàn)了溫和毒株、強(qiáng)毒株和超強(qiáng)毒株［5-8］，中和抗體的保護(hù)臨界值不斷升高，預(yù)防壓力越來(lái)越大。臨床癥狀和病理變化不具特征，多種病毒混合感染較為普遍，對(duì)于發(fā)病雞的臨床鑒別診斷十分困難。因此，雞病的診斷更加依賴實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)為實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)雞病最常用的方法之一，已被廣泛應(yīng)用于多種雞病的檢測(cè)。近些年來(lái)，人們又研發(fā)了復(fù)合PCR檢測(cè)方法，并成功用于雞多種病毒的鑒別診斷［9-10］，復(fù)合PCR不僅具有常規(guī)PCR的優(yōu)點(diǎn)，而且可同時(shí)檢測(cè)多種病毒，在臨床混合感染的鑒別診斷中發(fā)揮了重要作用，而目前對(duì)于MDV、ILTV和FPV的PCR檢測(cè)均為常規(guī)PCR檢測(cè)［11-13］。建立一種同時(shí)檢測(cè)MDV、ILTV和FPV的簡(jiǎn)易復(fù)合PCR檢測(cè)方法已成為當(dāng)務(wù)之急。為此，本研究建立特異、敏感、快速、一次性同時(shí)檢測(cè)MDV、ILTV、FPV的簡(jiǎn)易復(fù)合PCR方法，以期為雞多病毒混合感染的早期快速鑒別診斷奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 毒株及病料ILTV(K317株)、FPV(鵪鶉化弱毒株)、雞傳染性支氣管炎病毒(IBV，LDT3－A株)、雞新城疫病毒(NDV，LaSota株)均為活疫苗株，購(gòu)于哈獸研維科生物有限公司;MDV(廣西毒株)、禽流感病毒(AIV，H9N2株)均由河南省動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。臨床發(fā)病雞的組織病料由金大眾華夏畜禽疫病診療中心提供。

1.1.2 主要試劑Premix Taq(Ex Taq Version 2.0 plus dye)、基因組DNA提取試劑盒、DNA Marker均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成下載GenBank中MDV不同毒株的Meq基因、ILTV不同毒株的gB基因、FPV不同毒株的4b基因的核苷酸序列，通過(guò)序列比對(duì)，篩選出Meq、gB、4b基因的保守序列［14］，利用Primer Premier 6.0生物學(xué)軟件在保守序列區(qū)設(shè)計(jì)引物，每種基因的保守序列設(shè)計(jì)特異性引物3對(duì)，3種基因的保守序列共設(shè)計(jì)特異性引物9對(duì)，應(yīng)用生物學(xué)軟件篩選出匹配最佳的引物［15-16］，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.2 病毒DNA的制備以ILTV、FPV凍干疫苗懸液、MDV細(xì)胞培養(yǎng)物為樣本，應(yīng)用基因組DNA提取試劑盒分別提取制備MDV、ILTV、FPV的DNA，DNA提取制備的具體步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，利用核酸分析儀測(cè)定提取病毒DNA的OD260/OD280及其質(zhì)量濃度，將提取的DNA稀釋至工作質(zhì)量濃度，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 單一PCR擴(kuò)增分別以ILTV、MDV、FPV的DNA為模板，利用對(duì)應(yīng)的引物進(jìn)行常規(guī)單一PCR擴(kuò)增，采用50 μL反應(yīng)體系:Premix Taq 25 μL，上、下游引物(20 μmol/L)各1 μL，模板DNA(100 ng/μL) 1 μL，ddH2O 22 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?95℃30 s，匹配退火溫度30 s，72℃40 s，30個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min，反應(yīng)結(jié)束后4℃保存。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，并在凝膠成像儀中檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果。

1.2.4 復(fù)合PCR

1.2.4.1 反應(yīng)條件優(yōu)化以單一PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件為基礎(chǔ)，以MDV、ILTV、FPV DNA的混合物為模板，優(yōu)化復(fù)合PCR的反應(yīng)條件，篩選出復(fù)合PCR反應(yīng)的最佳條件。復(fù)合PCR反應(yīng)體系中可優(yōu)化的條件主要包括引物濃度、退火溫度、Taq DNA聚合酶用量。對(duì)上述反應(yīng)條件進(jìn)行反復(fù)多次擴(kuò)增試驗(yàn)，并通過(guò)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)，最終確定反應(yīng)條件。

1.2.4.2 復(fù)合PCR敏感性試驗(yàn)取少量MDV、ILTV、FPV DNA進(jìn)行混合，并測(cè)定混合后的DNA質(zhì)量濃度，用滅菌雙蒸水系列稀釋已知質(zhì)量濃度的混合DNA樣品，以不同稀釋度的混合DNA為模板進(jìn)行復(fù)合PCR擴(kuò)增試驗(yàn)，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，測(cè)定復(fù)合PCR的檢出極限，評(píng)估復(fù)合PCR的敏感性。

1.2.4.3 復(fù)合PCR特異性試驗(yàn)以IBV、AIV、NDV為參比病毒測(cè)定復(fù)合PCR的特異性，分別以IBV、AIV、NDV核酸及其混合物為模板進(jìn)行復(fù)合PCR擴(kuò)增，同時(shí)以MDV、ILTV、FPV、AIV、IBV、NDV多種病毒核酸混合物為模板進(jìn)行復(fù)合PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，評(píng)估復(fù)合PCR的特異性。

1.2.4.4 復(fù)合PCR簡(jiǎn)化試驗(yàn)利用Taq DNA聚合酶活性特點(diǎn)，將熱變性、退火和延伸三循環(huán)PCR進(jìn)行簡(jiǎn)化，由3個(gè)反應(yīng)階段的循環(huán)改為2個(gè)反應(yīng)階段的循環(huán)，即退火和延伸在1個(gè)溫度下同時(shí)完成［17］。應(yīng)用簡(jiǎn)化后的復(fù)合PCR對(duì)MDV、ILTV、FPV DNA進(jìn)行多次擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，評(píng)估簡(jiǎn)化復(fù)合PCR的可行性。

1.2.4.5 復(fù)合PCR的驗(yàn)證試驗(yàn)分別應(yīng)用復(fù)合PCR、單一PCR、瓊脂擴(kuò)散(AGP)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)對(duì)臨床表現(xiàn)疑似馬立克病、傳染性喉氣管炎、雞痘病的雞組織病料進(jìn)行檢測(cè)，共檢測(cè)由河南省部分雞場(chǎng)送檢病雞的組織病料137份，并對(duì)不同方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選結(jié)果

根據(jù)3種病毒不同毒株基因的相對(duì)保守序列設(shè)計(jì)出9對(duì)引物，利用生物學(xué)軟件對(duì)9對(duì)引物進(jìn)行模擬篩選，經(jīng)篩選得到復(fù)合PCR匹配引物3對(duì)。引物序列見(jiàn)表1。

表1 MDV、ILTV、FPV PCR擴(kuò)增引物

2.2 單一PCR擴(kuò)增結(jié)果

由圖1可見(jiàn)，單一PCR擴(kuò)增時(shí)，3種病毒均擴(kuò)增出與試驗(yàn)設(shè)計(jì)相符的特異性片段，擴(kuò)增片段的大小分別為:228 bp(MDV)、400 bp(ILTV)和499 bp (FPV)?？梢?jiàn)，篩選獲得的復(fù)合PCR引物在對(duì)3種病毒單獨(dú)擴(kuò)增時(shí)，均獲得了較好的擴(kuò)增結(jié)果，為復(fù)合PCR擴(kuò)增奠定了基礎(chǔ)。

圖1 MDV、ILTV、FPV單一PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3 復(fù)合PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 退火溫度以單一PCR退火溫度為基礎(chǔ)，以MDV、ILTV、FPV DNA的混合物為模板，依據(jù)Tm值設(shè)定不同的退火溫度(50、52、54、56、58、60、62、64℃)進(jìn)行復(fù)合PCR試驗(yàn)，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)復(fù)合PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果表明，復(fù)合PCR的適宜退火溫度為56℃(圖2)。

圖2 MDV、ILTV、FPV復(fù)合PCR退火溫度的優(yōu)化結(jié)果

2.3.2 引物濃度以單一PCR引物濃度為基礎(chǔ)，以MDV、ILTV、FPV DNA的混合物為模板，3種病毒擴(kuò)增引物的濃度分別設(shè)定為1.00、1.25、2.00、2.50、3.00 μmol/L，進(jìn)行復(fù)合PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，最佳引物濃度為2 μmol/L(圖3)。

2.3.3 Taq DNA聚合酶用量采用復(fù)合PCR適宜退火溫度和引物濃度，以MDV、ILTV、FPV DNA的混合物為模板，應(yīng)用不同的酶量(0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 U)進(jìn)行復(fù)合PCR試驗(yàn)。結(jié)果顯示，Taq DNA聚合酶適宜用量為1.00 U(圖4)。

圖3 MDV、ILTV、FPV復(fù)合PCR引物濃度的優(yōu)化結(jié)果

圖4 MDV、ILTV、FPV復(fù)合PCR Taq DNA聚合酶用量的優(yōu)化結(jié)果

2.4 復(fù)合PCR的敏感性檢測(cè)結(jié)果

以復(fù)合PCR的優(yōu)化條件為基礎(chǔ)，以不同用量MDV、ILTV、FPV的DNA為模板(1 ng、100 pg、10 pg、1 pg、100 fg、10 fg、1 fg)進(jìn)行復(fù)合PCR試驗(yàn)。結(jié)果顯示，復(fù)合PCR對(duì)MDV、ILTV、FPV DNA的檢測(cè)極限為100 fg(圖5)。

圖5 MDV、ILTV、FPV復(fù)合PCR敏感性檢測(cè)結(jié)果

2.5 復(fù)合PCR的特異性檢測(cè)結(jié)果

以優(yōu)化的復(fù)合PCR反應(yīng)條件為基礎(chǔ)，以MDV、ILTV、FPV、IBV、AIV、NDV的核酸為模板，進(jìn)行復(fù)合PCR擴(kuò)增，檢測(cè)復(fù)合PCR擴(kuò)增的特異性。結(jié)果顯示，IBV、NDV和AIV分別與MDV、ILTV、FPV的核酸混合，分別出現(xiàn)與預(yù)期MDV、ILTV、FPV相符的目的片段，而單獨(dú)擴(kuò)增IBV、NDV和AIV的核酸均沒(méi)有擴(kuò)增出任何條帶，混合6種病毒核酸的復(fù)合PCR體系只能擴(kuò)增出與試驗(yàn)設(shè)計(jì)相符的MDV、ILTV、FPV核酸的特異性擴(kuò)增條帶(圖6)。

圖6 MDV、ILTV、FPV復(fù)合PCR的特異性檢測(cè)結(jié)果

2.6 復(fù)合PCR的簡(jiǎn)化結(jié)果

將復(fù)合PCR的三溫循環(huán)簡(jiǎn)化為二溫循環(huán)，使退火和延伸在同一溫度下完成，結(jié)果顯示，退火延伸溫度為62℃時(shí)擴(kuò)增效果較好(圖7)。

圖7 簡(jiǎn)化復(fù)合PCR的退火延伸溫度篩選結(jié)果

2.7 復(fù)合PCR檢測(cè)驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

分別應(yīng)用復(fù)合PCR、單一PCR、AGP和ELISA對(duì)137份雞的組織病料進(jìn)行檢測(cè)(表2)，復(fù)合PCR、單一PCR的檢出率均為79.6%(109/137)，AGP、ELISA的檢出率分別為41.6%(57/137)、70.1% (96/137)，復(fù)合PCR和單一PCR的檢出符合率均為100%，AGP、ELISA的檢出符合率分別為52.3%、88.1%。

表2 復(fù)合PCR與單一PCR、AGP、ELISA檢測(cè)結(jié)果的比較

3 結(jié)論與討論

多重PCR技術(shù)是能同時(shí)擴(kuò)增同一病原核酸的不同基因片段或多個(gè)病原不同核酸片段的技術(shù)，具有高效快捷、特異性強(qiáng)、敏感性高、成本低等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于多種病原的鑒別診斷比單一PCR診斷更為快速［18-21］。建立多病原高效復(fù)合PCR檢測(cè)方法的關(guān)鍵是設(shè)計(jì)引物，引物的各項(xiàng)指標(biāo)直接關(guān)系到復(fù)合PCR檢測(cè)方法的成敗，與單一PCR引物相比，復(fù)合PCR引物要具有高度特異性，每對(duì)引物自身不僅不能存在互補(bǔ)序列，而且不同引物對(duì)之間也不能存在互補(bǔ)序列，確保所有引物均無(wú)發(fā)卡結(jié)構(gòu)和引物二聚體;引物對(duì)之間既具有相近的退火溫度，同時(shí)具有較高的擴(kuò)增特異性，只擴(kuò)增目的片段［22］;擴(kuò)增片段的大小具有明顯的差異，確保各病毒擴(kuò)增片段在電泳圖譜上可以直觀地區(qū)分。其次是引物濃度和Taq DNA聚合酶用量的優(yōu)化，可使建立的復(fù)合PCR方法對(duì)病毒的檢測(cè)具有更高的敏感性。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，建立的復(fù)合PCR檢測(cè)方法只能擴(kuò)增MDV、ILTV、FPV的DNA片段，具有較高的特異性;擴(kuò)增片段的大小差異明顯(228、400、499 bp)，便于肉眼直觀鑒別，對(duì)3種病毒的最低檢出極限為100 fg，具有較高的敏感性;復(fù)合PCR、單一PCR、AGP、ELISA對(duì)臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果顯示，復(fù)合PCR與單一PCR的檢出結(jié)果完全一致，二者的檢出率均明顯高于AGP和ELISA，表明復(fù)合PCR對(duì)臨床樣品檢測(cè)結(jié)果可靠。

Taq DNA聚合酶是PCR反應(yīng)體系中的關(guān)鍵試劑之一，Taq DNA聚合酶在不同溫度下均具有DNA互補(bǔ)片段的延伸活性，其最佳活性溫度為70～75℃，此溫度下互補(bǔ)鏈的合成延伸速度為150～300 bp/s，當(dāng)溫度降為60～70℃時(shí)互補(bǔ)鏈延伸速度為60～120 bp/s，當(dāng)溫度升至75～80℃時(shí)互補(bǔ)鏈延伸速度約為150 bp/s;對(duì)于小于500 bp的擴(kuò)增片段，選擇上述任何一個(gè)溫度范圍，均可在較短時(shí)間內(nèi)完成互補(bǔ)鏈的延伸并產(chǎn)生目的片段［13］。常規(guī)PCR的擴(kuò)增均為三溫?zé)嵫h(huán)擴(kuò)增，即變性溫度、退火溫度和延伸溫度，Taq DNA聚合酶的寬溫度范圍活性特點(diǎn)為退火和延伸的合并奠定了基礎(chǔ)［17］。本試驗(yàn)經(jīng)反復(fù)篩選確定了退火延伸溫度為62℃，實(shí)現(xiàn)了退火和延伸同溫進(jìn)行，將復(fù)合PCR的三溫?zé)嵫h(huán)簡(jiǎn)化為二溫?zé)嵫h(huán)，不僅縮短了PCR的反應(yīng)時(shí)間，而且二溫?zé)嵫h(huán)的退火延伸溫度高于三溫?zé)嵫h(huán)的退火溫度，進(jìn)一步保障了擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。不同檢測(cè)方法對(duì)臨床病料的檢測(cè)結(jié)果表明，復(fù)合PCR與單一PCR具有相同的檢出結(jié)果，能夠應(yīng)用于臨床檢測(cè)，為多病原混合感染的鑒別診斷奠定了基礎(chǔ)。

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Establishment of Multiplex PCR Detection Method for Three Kinds of Main DNA Viruses in Chicken

LI Xuewu1，LIU Yuan2，WANG Li1，DENG Ruiguang1，ZHAO Dong1，YANG Jifei1，CHAI Shujun1
(1.Key Laboratory of Animal Immunology，Henan Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou 450002，China; 2.College of Animal Science and Technology，Henan Science and Technology University，Luoyang 471023，China)

Specific primers were designed upon the conservative sequences of Marek’s disease virus (MDV)，infectious laryngotracheitis virus(ILTV)，and fowlpox virus(FPV)genomic nucleotide sequences from registered in GenBank.Three pairs of specific primers for each virus were designed，a total of 9 pairs of primers for three viruses(MDV，ILTV，F(xiàn)PV)were screened by biological software，and three pairs of primers matched each other.After verification of three pair suitable primers with singleplex PCR，the reaction conditions of the multiplex PCR were optimized，including annealing temperature，concentrations of primers and Taq DNA polymerase.The simple multiplex PCR assay was successfully established after specificity，sensitivity and simplified test.The specific bands with lengths of 228 bp(MDV)，400 bp (ILTV)，499 bp(FPV)were amplified by the multiplex PCR，which were consistent with those expected.The results demonstrated that the method could simultaneously amplify these three viruses at a sensitivity of 100 fg when all three viruses were present.According to the principle of PCR technology，the classical PCR(a three step thermal cycle assay)was improved to be a two step thermal cycle assay，namely annealing and extension step were merged into one step(62℃)，and the reaction time was shortened.This mul-tiplex PCR for three DNA viruses was both highly specific and sensitive，and could be used as a rapid diagnostic assay for clinical samples.

Marek’s disease virus;infectious laryngotracheitis virus;fowlpox virus;DNA viruses;multiplex PCR

S855.3

A

1004－3268(2017)07－0101－05

2017－01－12

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201303033)

李學(xué)伍(1964－)，男，河南通許人，研究員，博士，主要從事動(dòng)物病原學(xué)和免疫學(xué)研究。E－mail:lixuewu2002@126.com