草地早熟禾的石蠟切片制作技術(shù)的優(yōu)化

陳 陽， 金一鋒， 孫華山， 趙春麗， 王 琦， 王玉書

(1. 齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院， 黑龍江 齊齊哈爾 161006； 2. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院， 黑龍江 哈爾濱 150030； 3. 福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所， 福建 福州350002)

草地早熟禾(PoapratensisL.)是隸屬于禾本科早熟禾屬多年生草本植物，其具備抗寒、葉色濃綠、分蘗性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，常用于我國(guó)北方住宅區(qū)、街道、公園等園林綠化[1-4]。草坪業(yè)是耗水耗肥產(chǎn)業(yè)，易受外界環(huán)境因素影響。草坪草逆境脅迫下的生長(zhǎng)形態(tài)和生理代謝研究一直是研究重點(diǎn)[5-7]。采用石蠟切片技術(shù)觀察植物解剖結(jié)構(gòu)已經(jīng)成為研究植物逆境脅迫后生長(zhǎng)形態(tài)發(fā)育過程的重要手段[8-10]。石蠟切片其快速、便捷、易觀察等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于各植物材料中，但不同植物其組織、器官結(jié)構(gòu)特點(diǎn)不同，使得針對(duì)不同植物優(yōu)化篩選得到適宜的、有針對(duì)性的石蠟切片制作過程十分有必要。目前針對(duì)草地早熟禾解剖結(jié)構(gòu)的研究集中于研究器官結(jié)構(gòu)、花芽分化，但石蠟切片效果存在器官結(jié)構(gòu)破裂、染色效果不佳、制片模糊不宜觀察等情況，針對(duì)草地早熟禾的石蠟切片技術(shù)優(yōu)化甚少。本研究以草地早熟禾根、莖、葉為供試器官，對(duì)石蠟切片操作過程中的關(guān)鍵因素進(jìn)行優(yōu)化，深入探究染色時(shí)間處理對(duì)石蠟切片效果的影響，以期獲取完整的、清晰的、易觀察的草地早熟禾解剖結(jié)構(gòu)質(zhì)，為進(jìn)一步開展草地早熟禾逆境脅迫后生長(zhǎng)形態(tài)發(fā)育過程的研究提供理論數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

供試材料為黑龍江野生草地早熟禾，選取生長(zhǎng)兩年的植株，取其根、莖、葉三個(gè)部位制作成石蠟切片，然后用顯微鏡觀察。

1.2 方法

1.2.1固定與沖洗 采用FAA固定劑對(duì)其各部位固定24 h。用50%乙醇(180 ml)+冰醋酸(10 ml)+40%甲醛(10 ml)的FAA固定劑對(duì)草地早熟禾根、莖、葉進(jìn)行固定。用70%乙醇(180 ml)+冰醋酸(10ml)+40%甲醛(10 ml)的FAA固定劑對(duì)草地早熟禾各組的根頸、須根進(jìn)行固定。將經(jīng)FAA固定的實(shí)驗(yàn)材料，用50%或70%(與固定液同濃度)的乙醇沖洗，每次沖洗1～2 h，每20 min晃動(dòng)一次U形管可以保證沖洗的更徹底，共沖洗3次。

1.2.2脫水 經(jīng) 70%，80%，85%，90%，95%乙醇逐級(jí)梯度脫水后再用無水乙醇脫水5次(每次 30 min)，乙醇逐級(jí)脫水時(shí)間進(jìn)行兩組處理：a.70%，80%，85%，90%，95%乙醇逐級(jí)梯度脫水1 h；b.70%，80%，85%，90%，95%乙醇逐級(jí)梯度脫水2 h。

1.2.3透明 采用逐級(jí)過渡的方法將材料從乙醇中逐漸過渡到純二甲苯。其中純二甲苯更換方式分為兩種：a.純二甲苯更換兩次，每次1 h；b.純二甲苯更換三次，每次0.8 h。透明具體過程：將材料置于2/3乙醇+1/3二甲苯混合后處理1 h，重復(fù)3次，再將材料轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)入二甲苯處理1 h或0.8 h(注：1/3、2/3代表體積比)。

1.2.4浸蠟 將試驗(yàn)材料從低溫(55℃)到高溫(65℃)，從低濃度石蠟(1/2透明劑+1/2石蠟)，共處理9 h轉(zhuǎn)移到純石蠟中，共浸蠟24 h，期間更換5次純蠟。

1.2.5包埋、切片、展片及貼片 烘箱調(diào)至為70℃包埋，將實(shí)驗(yàn)材料插入裝有熔化石蠟的方形紙盒中，在石蠟表面凝固前要將所有植物材料迅速插入其中，均勻排布。切片刀口的傾斜角度在5～8度為佳，切片的厚度調(diào)整到8 μm為最佳。展片時(shí)采用50℃恒溫水浴鍋展片，展好的片用粘有粘貼劑的載玻片撈出，石蠟切片正好位于載玻片中央且保持完整性。展片后，在工作臺(tái)上停留片刻使多余的溶液蒸發(fā)掉讓實(shí)驗(yàn)材料緊密的貼在載玻片上，然后等其自然風(fēng)干(10天左右)。

1.2.6染色與封片 本實(shí)驗(yàn)采用番紅-固綠染色法，對(duì)其染色時(shí)間進(jìn)行了篩選，見表1。草地早熟禾染色過程為：將材料置于二甲苯中處理3 min，重復(fù)2次；轉(zhuǎn)入到1/2二甲苯+1/2乙醇中3 min，依次轉(zhuǎn)入到100%、90%、80%、70%乙醇，每次處理2 min；將材料置于番紅溶液中數(shù)小時(shí)，再依次轉(zhuǎn)入到60%、70%、80%的乙醇，每次處理2 min；將材料置于固綠溶液數(shù)秒后，轉(zhuǎn)入到乙醇中處理三次，每次2 min，再將材料逐漸過渡到二甲苯中。本實(shí)驗(yàn)采用加拿大樹膠作為封固劑，將適量的封固劑滴到材料上，最后蓋上蓋玻片，等其在自然條件風(fēng)干。

1.2.7觀察及測(cè)量 石蠟切片制作好后，用顯微鏡進(jìn)行觀察、測(cè)量、記錄、拍攝植物各典型結(jié)構(gòu)解剖圖。

表1 染色時(shí)間的篩選Table 1 Screening of staining time

2 結(jié)果與分析

2.1 不同脫水方式對(duì)于浸蠟和切片的影響

脫水目的是除凈材料中的水分，使材料變硬，形狀更穩(wěn)定，使包埋劑(石蠟)和封固劑(加拿大樹膠)滲透到草地早熟禾的各組織中。若脫水不徹底，后續(xù)浸蠟時(shí)蠟將不能完全滲入植物組織的每一個(gè)細(xì)胞，導(dǎo)致石蠟切片上的植物材料脫落，形成孔、洞。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，a組70%，80%，85%，90%，95%乙醇逐級(jí)梯度脫水1 h后，發(fā)現(xiàn)脫水不徹底導(dǎo)致了草地早熟禾材料從石蠟切片上脫落下來，而b組逐級(jí)梯度脫水2 h后未發(fā)生材料脫落現(xiàn)象，效果較好。

2.2 不同透明方式對(duì)于切片的影響

本實(shí)驗(yàn)中采用逐級(jí)過渡方法將草地早熟禾從乙醇中逐漸過渡到純二甲苯。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：a組純二甲苯更換兩次，每次1 h后，其草地早熟禾組織部位透明不徹底，影響后續(xù)染色；b組將純二甲苯更換三次，每次0.8 h，增加了更換頻率，同時(shí)減少了每次處理時(shí)間，其透明較徹底，效果良好。

2.3 不同染色方式對(duì)于切片的影響

本實(shí)驗(yàn)采用番紅-固綠染色法，進(jìn)行石蠟切片染色，番紅溶液將木質(zhì)化部分染成紅色，固綠溶液將纖維素的細(xì)胞壁染成綠色，對(duì)于維管束，木質(zhì)部被染番紅溶液成紅色，韌皮部被固綠溶液染成綠色。番紅和固綠的染色時(shí)間對(duì)石蠟切片的制作至關(guān)重要，不同植物其解剖結(jié)構(gòu)差異較大，需篩選適宜的染色方法，故本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了篩選實(shí)驗(yàn)(見表2)，來探索哪種方法對(duì)草地早熟禾的石蠟切片的染色效果更好。

表2 番紅-固綠染色時(shí)間處理下的效果比較Table 2 Comparison of dying effects with Sarranine-Fast green dying times

從表2、圖1可以看到，當(dāng)番紅處理同為2h時(shí)，固綠溶液僅處理5s時(shí)，紅色區(qū)域較多，其中細(xì)胞壁、韌皮部都被染成紅色，圖像整體呈現(xiàn)紅色，結(jié)構(gòu)不易區(qū)分。隨著固綠溶液處理時(shí)間逐漸增多，圖像綠色區(qū)域隨之增加，但是當(dāng)固綠溶液處理40～120 s時(shí)，圖像整體呈現(xiàn)綠色，結(jié)構(gòu)不易區(qū)分。綜合幾組實(shí)驗(yàn)圖像，第4組即番紅溶液(3 h)、固綠溶液(40 s)時(shí)染色效果更好，紅色和綠色部分更明顯，更易區(qū)分材料橫剖面的各組織，能更好的體現(xiàn)番紅-固綠雙色染色法的價(jià)值。

圖1 番紅-固綠不同染色時(shí)間下的染色效果圖Fig.1 Comparison of dying effects with Sarranine-Fast green dying times(注：A.番紅2 h，固綠5 s ；B.番紅2 h，固綠20 s；C.番紅2 h，固綠40 s；D.番紅3 h，固綠40 s；E.番紅2 h，固綠120 s)(Note：A.Safranin solution dyed 2 h，then fast green 5 s；B.Safranin solution dyed 2 h，then fast green 20 s；C.Safranin solution dyed 2 h， then fast green 40 s；D.Safranin solution dyed 3 h，then fast green 40 s；E.Safranin solution dyed 2 h，then fast green 120 s)

3 討論與結(jié)論

本研究通過對(duì)草地早熟禾石蠟切片關(guān)鍵步驟進(jìn)行相應(yīng)優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)不同脫水方式嚴(yán)重影響后續(xù)浸蠟的程度，如果脫水不完全，浸蠟不徹底，切片過程中易出現(xiàn)孔、洞，石蠟切片中的器官組織不完整，但有研究發(fā)現(xiàn)，過度脫水易造成后續(xù)展片不完整，出現(xiàn)褶皺的現(xiàn)象[11]。本試驗(yàn)優(yōu)化不同透明方式對(duì)于切片的影響時(shí)，增加的二甲苯更換頻率，同時(shí)減少了每次更換的時(shí)間，可有效使草地早熟禾器官組織中的顏色透明，易于后續(xù)染色。有研究發(fā)現(xiàn)，同一種植物不同器官或者不同植物中的透明過程有較大差異，如草地早熟禾胚胎結(jié)構(gòu)[11]、蘋果花藥[12]、馬鈴薯胚胎[13]、三葉草莖與葉片結(jié)構(gòu)[14,15]等，篩選與優(yōu)化適宜草地早熟禾根莖葉的透明方式很有必要。本實(shí)驗(yàn)篩選染色方式中，進(jìn)行了傳統(tǒng)番紅-固綠染色方法的優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)針對(duì)草地早熟禾染色方法的優(yōu)化十分必要，若方法不當(dāng)，易出現(xiàn)維管束內(nèi)部結(jié)構(gòu)區(qū)分不明顯、局部顏色過紅或過綠，觀察效果不好。由于植物之間的結(jié)構(gòu)組織不相同，內(nèi)部解剖結(jié)構(gòu)存在一定差異，針對(duì)特定植物特定位置的染色方法可以利于更好的觀察。本研究發(fā)現(xiàn)番紅3 h，固綠40 s染色處理下表皮、同化組織、維管束結(jié)構(gòu)清晰，紅色、綠色的染色效果較好，結(jié)構(gòu)易區(qū)分，能較好的觀察草地早熟禾根莖葉中的解剖結(jié)構(gòu)，這有利于后續(xù)觀察草地早熟禾解剖結(jié)構(gòu)與抗逆性的關(guān)系、不同時(shí)期草地早熟禾形態(tài)結(jié)構(gòu)的發(fā)育過程等。