過氧化物酶體增殖物激活受體—γ激動劑對急性胰腺炎大鼠肺損傷的保護機制研究

陸貝　于源泉　殷俊杰　蔡陽

[摘要] 目的 探討過氧化物酶體增殖物激活受體-γ激動劑對胰腺炎大鼠肺損傷的保護作用及調(diào)節(jié)機制。 方法 72只大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組和羅格列酮組，各組再分為術(shù)后6 h、12 h、24 h組。模型組采用兩次腹腔注射L-精氨酸制備SAP模型，羅格列酮組術(shù)后30 min靜脈注射10%羅格列酮6 mg/kg，假手術(shù)組腹腔注射等體積生理鹽水。觀察大鼠肺病理改變，測定肺TLR4、NF-κB、肺髓過氧化物酶活性、肺干/濕重比、血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量。使用重復(fù)測量方差分析，SNK-q檢驗比較差異。 結(jié)果 ROSI組大鼠肺組織病理損害較SAP組減輕；與SAP組比較，肺內(nèi)NF-κB、TLR4蛋白下降（P<0.05），髓過氧化物酶活性及肺干/濕重比降低（P<0.05）；ROSI組外周血IL-1β、IL-6、TNF-α含量與SAP組比較明顯下降（P<0.05）。 結(jié)論 PPAR-γ激動劑能減輕急性胰腺炎大鼠肺組織的損傷，抑制NF-κB、TLR4表達，降低促炎細胞因子水平，推測PPAR-γ激動劑對NF-κB/TLR4通路的調(diào)節(jié)可能是胰腺炎的保護機制之一。

[關(guān)鍵詞] 急性胰腺炎；過氧化物酶體增殖物激活受體；核轉(zhuǎn)錄因子-κB；Toll樣受體

[中圖分類號] R576 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）18-0038-04

Protection of PPAR-γ agonists on lung injury in rats with acute pancreatitis

LU Bei1 YU Yuanquan2 YIN Junjie1 CAI Yang1

1.Department of HPB Surgery， Hangzhou First Peoples Hospital， Hangzhou 310006， China； 2.Department of HPB Surgery， the Second Affiliated Hospital of Zhejiang University School of Medicine， Hangzhou 310009， China

[Abstract] Objective To find the protection of PPAR-γ agonists on injured lung cells in rats and mechanism during acute pancreatitis. Methods Rats were divided randomly into three groups： sham operation group， SAP model group， rosiglitazone group. Each group was divided into 6 h， 12 h， and 24 h group after operation. SAP rats model were made via twice peritoneal injection of L-arginine. Rats in ROSI group were injected with 6 mg/kg of 10% rosiglitazone via femoral vein 30 min after operation. Sham operation group rats were peritoneally injected of same volume NS as SAP group. Pathological changes of lung tissue， TLR4， NF-κB， MPO， dry and wet ratio in lung tissue were tested. Serum TNF-α， interieukin-1β， interieukin-6 were also determined. Results The pathological injuries of lung cell were relieved in ROSI group compared with SAP group. There were statistic differences in TLR4， NF-κB， MPO， dry and wet ratio in lung between ROSI and SAP group， which were decreased in ROSI group compared with SAP group（P<0.05）. TNF-α， IL-1β， IL-6 were decreased in ROSI group compared with those in SAP group（P<0.05）. Conclusion The lung tissue injury during SAP may relived by PPAR-γ agonists， and also decrease NF-kappa B， TLR4 and inflammatory cytokines. The probable reason is that PPAR-γ agonists protect pancreas by adjusting NF-κB/TLR4 signal pathway.

[Key words] Severe acute pancreatitis； Peroxisome proliferator activating receptor； Nuclear factor-kappa B； Toll-like receptor

由重癥急性胰腺炎引發(fā)的胰外損害中急性肺損傷較為常見，嚴重者可發(fā)生呼吸衰竭甚至死亡。胰腺連鎖炎癥反應(yīng)與核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）關(guān)系密切，其中過氧化物酶體增殖物激活受體-γ（peroxisome proliferators-activated receptor-γ，PPAR-γ）激動劑如羅格列酮可能與NF-κB活化抑制以及AP進展有關(guān)。本研究證明羅格列酮能減輕SAP大鼠肺損害，其機制可能與NF-κB/TLR4相關(guān)。

1 材料與方法

1.1實驗材料

選擇72只SD大鼠，體質(zhì)量269.7～320.4 g（浙江省中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供）。戊巴比妥鈉、L-精氨酸針（Sigma，USA），羅格列酮（Cayman，USA），NF-κB、TLR4抗體（Santa Cruz，USA）、MPO等ELISA試劑盒購自R&D公司（R&D，USA）。

1.2 方法

1.2.1 建模與分組 大鼠隨機平均分為三組：模型組（SAP組）、羅格列酮組（ROSI組）、假手術(shù)組（SO組）（n=24），術(shù)后每組再隨機平均分為三組：6 h、12 h、24 h組（n=8）。2.5%戊巴比妥鈉0.2 mL/100 g腹腔內(nèi)注射麻醉成功。SAP組：腹腔內(nèi)注射濃度為20 g/L的L-精氨酸兩次，間隔1 h，每次2.0 g/kg，制模成功。SO組：腹腔內(nèi)注射等體積生理鹽水兩次，間隔1 h。ROSI組：術(shù)后30 min股靜脈注射10%羅格列酮溶液6 mg/kg。

1.2.2 肺組織病理 取右肺前葉HE染色制備組織切片。

1.2.3 肺TLR4、NF-κB檢測 取右肺中葉參照試劑盒說明書檢測TLR4、NF-κB。結(jié)果判定：光鏡下隨機取5個視野，陽性單位（positive unit）=陽性細胞平均光密度×陽性細胞面積比[3]。

1.2.4 肺髓過氧化物酶活性 取右肺后葉組織，制成組織勻漿后用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測MPO活性，具體操作參照MPO ELISA試劑盒說明書。

1.2.5 肺含水量（干/濕重比） 取左肺葉組織，去除脂肪，濾紙吸干表面液體，置電子天平稱量左肺濕重。置80℃烤箱干燥48 h，稱量干重，計算肺組織干/濕重比。

1.2.6 細胞因子檢測 心臟采血后，用ELISA試劑盒測定血清腫瘤壞死因子及白細胞介素1β、白介素6的含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS16.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析，用SNK-q檢驗及重復(fù)測量方差分析比較結(jié)果。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理變化

SO組肺組織病理無明顯改變，見封三圖3；SAP組肺組織肉眼可見明顯點狀出血斑，光鏡下肺間質(zhì)、肺泡、氣管出血，間質(zhì)及血管內(nèi)中性粒細胞浸潤明顯，肺泡隔增寬，肺泡破裂、塌陷，見封三圖4。與SAP組相比，ROSI組給藥12 h后病理改變程度減輕，見封三圖5。

2.2 肺組織TLR4、NF-κB比較

SAP組肺泡上皮細胞TLR4、NF-κBp65比SO組升高明顯（P<0.05）。ROSI組比SAP組降低明顯（P<0.05），見表1。

2.3 肺髓過氧化物酶活性

SAP組肺組織MPO活性較SO組明顯升高（P<0.05），ROSI組MPO活性不同程度低于SAP組（P<0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

2.4 各組肺干/濕重比（含水量）比較

SAP組肺臟干/濕重比較SO組增高（P<0.05），并隨時間延長逐漸遞增，ROSI組干/濕重比與SAP組比較有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）（除6 h），見表3。

2.5 各組血清炎癥細胞因子比較

SAP組、ROSI組TNF-α、IL-1β、IL-6等細胞因子均有不同程度升高，但兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（除6 h），見表4。

3討論

重癥急性胰腺炎除自身的出血壞死以外，早期胰外器官損傷中急性肺損傷（acute lung injury，ALI）的比例超過50%，早期因呼吸衰竭死亡患者比例高達60%[1-2]。但SAP引起ALI的具體機制比較復(fù)雜，可能與中性粒細胞、巨噬細胞、肥大細胞等炎癥反應(yīng)細胞有關(guān)，或者與TNF-α、IL等炎癥因子和趨化因子的作用有關(guān)，也可能與血小板活化因子、核因子-κB、基質(zhì)金屬蛋白酶等有關(guān)。核轉(zhuǎn)錄因子-κB控制多種炎癥因子，如TNF-α、IL-6、IL-8的表達，介導(dǎo)多種組織細胞凋亡，過度表達可對胰腺及胰外組織細胞造成不可逆損傷，因此被認為是SAP炎癥級聯(lián)瀑布反應(yīng)的上游靶點。抑制NF-κB活化后，胰腺及胰外器官的損害減輕，炎癥細胞因子含量降低[3-9]。Jiang C等[10]在上世紀末第一次證實PPAR-γ激動劑對炎癥細胞因子有調(diào)節(jié)作用，具體與NF-κB基因表達抑制和細胞因子降低密切相關(guān)。Hashimoto等[11]通過對AP大鼠注射PPAR-γ激動劑，證實能降低NF-κB活性，首次在動物層面證明PPAR-γ激動劑對AP治療有效。大多數(shù)實驗研究表明抑制NF-κB對AP有利，但同時也可能加重AP，并且該雙重作用可能與抑制劑的劑量相關(guān)，當(dāng)大劑量使用NF-κB抑制劑時，細胞凋亡過程被同時阻斷，導(dǎo)致組織損傷加重[12]。

本實驗中SAP組大鼠肺組織有明顯的急性損傷病理改變，ROSI組大鼠在SAP造模后30 min通過股靜脈注射10%羅格列酮，大體及鏡下肺病理損傷有減輕，肺組織NF-κB、TLR4活性下降，外周血IL-1β、IL-6、TNF-α下調(diào)，肺組織MPO活性及肺含水量（干/濕重比）下降，對比差異有統(tǒng)計學(xué)意義，羅格列酮的抑制作用與其他學(xué)者研究結(jié)果一致，并且羅格列酮的作用機制與NF-κB/TLR4通路相關(guān)，降低外周血細胞因子水平，減輕胰腺炎造成的肺損害。

羅格列酮是高選擇性PPAR-γ激動劑，已廣泛投入臨床用于治療糖尿病等疾病，同時它也發(fā)揮著獨特的抗炎作用[13-22]。裴紅紅等[23]發(fā)現(xiàn)羅格列酮能抑制NF-κB表達，減輕AP大鼠胰腺損傷，羅格列酮抑制劑可加重胰腺損傷，NF-κB表達增加。Ivashchenko等[24]對去除PPAR-γ表達的AP大鼠注射羅格列酮，發(fā)現(xiàn)其保護作用減弱明顯，間接證實PPAR-γ在AP過程中的重要作用。本研究進一步證實羅格列酮對AP大鼠的肺損傷有保護作用，NF-κB/TLR4通路與此過程密切相關(guān)，抑制NF-κB/TLR4通路能調(diào)控炎癥反應(yīng)，減輕組織器官損傷，希望不久的將來能為SAP肺損傷患者提供確切的治療。

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（收稿日期：2017-02-24）