木瓜黃精膏對(duì)衰老模型小鼠腎細(xì)胞凋亡的影響

郭芙蓮

（漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南漯河462002）

木瓜黃精膏對(duì)衰老模型小鼠腎細(xì)胞凋亡的影響

郭芙蓮

（漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南漯河462002）

目的探討木瓜黃精膏（PRO）對(duì)衰老模型小鼠組織勻漿中MDA含量、SOD活性以及腎細(xì)胞凋亡和凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2表達(dá)的影響。方法注射D-半乳糖造模，同時(shí)給予不同劑量的PRO，采用DNA末端標(biāo)記法（TUNEL）以及免疫組化SP法觀察腎細(xì)胞凋亡與腎臟Bax和Bcl-2表達(dá)水平。結(jié)果40日后，PRO可顯著提高小鼠組織勻漿中SOD活性，顯著降低MDA含量，與衰老模型組相比有顯著性差異（P＜0.01）。PRO組腎臟細(xì)胞凋亡率明顯下降（P＜0.05或P＜0.01），Bcl-2表達(dá)增強(qiáng)，Bax表達(dá)及Bax/Bcl-2比值下調(diào)（P＜0.05或P＜0.01），尤以PRO大、中劑量組作用顯著。結(jié)論P(yáng)RO具有較好的體內(nèi)抗氧化作用。

木瓜黃精膏；抗氧化；SOD；MDA；Bax；Bcl-2

目前，我國(guó)已進(jìn)入老齡化社會(huì)，截至2014年底，60歲以上老年人口達(dá)到2.1億，占全國(guó)總?cè)丝诘?5.5%，在這些老年人口中有將近4 000萬(wàn)人失能、半失能。據(jù)有關(guān)部門(mén)預(yù)測(cè)，到2035年，我國(guó)的老年人口將達(dá)到4億。隨著老齡化的不斷加劇，人們?cè)絹?lái)越關(guān)心如何應(yīng)對(duì)衰老以及怎樣延緩衰老。細(xì)胞的生理狀態(tài)和化學(xué)反應(yīng)發(fā)生復(fù)雜變化導(dǎo)致衰老，最終影響到其形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能。生物體內(nèi)絕大多數(shù)細(xì)胞都會(huì)經(jīng)歷未分化、分化、衰老、死亡幾個(gè)階段，衰老是一種正常生命現(xiàn)象。關(guān)于細(xì)胞衰老的原因，自由基學(xué)說(shuō)認(rèn)為：攻擊DNA引起基因突變或攻擊蛋白質(zhì)引起蛋白質(zhì)活性降低，從而導(dǎo)致組織器官功能衰退，機(jī)體進(jìn)入衰老狀態(tài)。細(xì)胞死亡受細(xì)胞內(nèi)某種由遺傳機(jī)制決定的“死亡程序”控制，稱為細(xì)胞程序性死亡（programmed cell death，PCD），又稱細(xì)胞凋亡。衰老就是細(xì)胞凋亡的過(guò)程，因此，抑制或減少衰老機(jī)體中細(xì)胞過(guò)度凋亡，可能有助于減緩機(jī)體衰老的發(fā)生和發(fā)展[1]。Bcl-2家族是細(xì)胞凋亡相關(guān)基因。Bcl-2是一種原癌基因，能夠抑制細(xì)胞凋亡并延長(zhǎng)細(xì)胞生存時(shí)間。Bcl-2家族成員的基因中，常含有3個(gè)保守的Bcl-2同源區(qū)，是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡及蛋白質(zhì)相互作用所必需的。Bax是凋亡促進(jìn)劑，Bcl-2是凋亡抑制劑，因此，檢測(cè)細(xì)胞中Bax、Bcl-2表達(dá)，可以判斷細(xì)胞凋亡的情況。研究表明，木瓜黃精膏（PRO）可以降低衰老模型小鼠血清及組織勻漿中MDA含量、提高SOD活性[2，3]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察PRO對(duì)衰老模型小鼠腎細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2表達(dá)的影響，觀察其抗氧化功能并探討其作用機(jī)理，為解決衰老問(wèn)題提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明種小白鼠60只，2月齡，雌雄各半，體重（22±3）g，由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 中藥及制備

所需中藥材均購(gòu)自鄭州市藥材公司，由我校生藥教研室鑒定。由漯河市中醫(yī)院制劑室將木瓜、黃精、大棗、荷葉按比例制成生理鹽水混懸液后進(jìn)行分裝，分別濃縮成生藥濃度5 g/m l，3 g/ml，2.5 g/m l。將配制好的藥液高壓滅菌，4℃冰箱保存。

1.3 主要試劑

D-半乳糖（上海試劑二廠）；原位缺口末端標(biāo)記法（Tdtmediated d-UTP-biotin nick end labeling，TUNEL）細(xì)胞凋亡試劑盒（MK1020）、兔抗Bax和Bcl-2多克隆抗體及SP法二抗試劑盒（SA2015，SA1022），由武漢博士德生物工程有限公司提供；其余試劑均為分析純。

1.4 儀器

721-分光光度計(jì)（上海第三分析儀器廠），GL6-HPIAS高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)（東方德公司），小型高速離心機(jī)（美國(guó)ThermoMicroMax CL17），常溫冰箱（新鄉(xiāng)BCD－312KA），電子天平（梅特勒AL10401），超低溫冰箱（美國(guó)ThermoForma702），超純水儀（美國(guó)Milli-QAcademic），移液器（法國(guó)GILSON）。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 分組及給藥將小白鼠置于（23±2）℃的動(dòng)物室中自由進(jìn)食水喂養(yǎng)7日后隨機(jī)分為5組，即空白對(duì)照組、衰老模型組、PRO大劑量組、PRO中劑量組、PRO小劑量組，每組12只。空白對(duì)照組頸后皮下注射0.5m l生理鹽水，其余各組皮下注射5%D-半乳糖0.5m l，每日1次，連用4周。造模成功后，空白對(duì)照組和衰老模型組每只每天灌胃等容積生理鹽水，PRO大劑量組按30.0 g/kg·d劑量灌胃，PRO中劑量組按15.0 g/kg·d劑量灌胃，PRO小劑量組按7.5 g/kg·d劑量灌胃。連續(xù)給藥40天。

1.5.2 標(biāo)本制備40天后將小白鼠處死，取各器官組織0.2 g制成10 g/100 ml的組織勻漿，4 000 r/min離心后取上清液待測(cè)。制作組織勻漿的同時(shí)將腎臟固定、脫水、石蠟包埋，檢測(cè)腎細(xì)胞凋亡及腎臟Bcl-2和Bax表達(dá)水平。

1.5.3 腎細(xì)胞凋亡檢測(cè)按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行腎組織石蠟切片，脫蠟入水，熒光素標(biāo)記，之后用結(jié)合了過(guò)氧化物酶（POD）的抗熒光素抗體與熒光素結(jié)合，再與底物DAB進(jìn)行顯色反應(yīng)，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、中性樹(shù)膠封片。胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒的細(xì)胞為凋亡細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)腎臟凋亡細(xì)胞數(shù)量，每組制作8張切片，在光鏡（400倍）下計(jì)數(shù)每張切片8個(gè)連續(xù)不重疊視野中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算每100個(gè)細(xì)胞中平均陽(yáng)性凋亡細(xì)胞數(shù)，即凋亡指數(shù)（Apoptosis Index，AI）。

1.5.4 免疫組化SP法檢測(cè)腎組織Bax和Bcl-2表達(dá)腎臟去除被膜取皮質(zhì)，4%中性福爾馬林固定、脫水、浸蠟、包埋、切片，厚度4μm，常規(guī)脫蠟水洗，一抗為兔抗大鼠Bax或Bcl-2多克隆抗體（1∶50稀釋），標(biāo)本置濕盒內(nèi)4℃過(guò)夜，滴加生物素化羊抗兔二抗IgG（1∶100稀釋），滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉素卵白素，DAB顯色，鏡下控制顯色時(shí)間，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，常規(guī)脫水、透明、中性樹(shù)膠封片。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，以博士德公司提供的扁桃腺切片作為陽(yáng)性對(duì)照。胞質(zhì)呈棕色顆粒的細(xì)胞為陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞，光鏡觀察陽(yáng)性信號(hào)。每組8張切片，每張切片在400倍視野下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，采用GL6-HPIAS高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)檢測(cè)平均吸光度（A值），了解Bax和Bcl-2表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel2007錄入和管理數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用SPSS 19.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

（1）PRO對(duì)衰老模型小鼠組織勻漿MDA及SOD的影響與相關(guān)研究一致[3]，衰老模型組與空白對(duì)照組比較，小鼠組織勻漿中MDA含量均顯著升高，SOD含量均減少，造模成功。

（2）PRO對(duì)衰老模型小鼠腎細(xì)胞凋亡的影響。光鏡下可見(jiàn)凋亡細(xì)胞胞核呈棕色或棕黑色，胞核略小或呈碎片狀，而正常細(xì)胞和壞死細(xì)胞的胞核則由蘇木素染藍(lán)紫色。本實(shí)驗(yàn)中，空白對(duì)照組與PRO組小鼠細(xì)胞核大而清晰，大小一致，只偶見(jiàn)染棕褐色細(xì)胞；衰老模型組可見(jiàn)較多散在且大小不一的棕褐色胞核，分布于腎小管的多于腎小球；PRO大、中劑量組只見(jiàn)到少量棕褐色顆粒；PRO小劑量組棕褐色陽(yáng)染顆粒數(shù)量與衰老模型組接近。PRO組凋亡指數(shù)顯著低于衰老模型組（P＜0.05或P＜0.01），尤以PRO大、中劑量組為著（見(jiàn)表1）。

表1 PRO對(duì)衰老模型小鼠腎細(xì)胞凋亡的影響（±s）

表1 PRO對(duì)衰老模型小鼠腎細(xì)胞凋亡的影響（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，△P＜0.01；與衰老模型組比較,*P＜0.05，**P＜0.01

組別劑量0.5ml/只0.5ml/只7.5 g/kg·d 15.0 g/kg·d 30.0 g/kg·d凋亡指數(shù)0.33±0.14 6.25±2.13△4.82±1.52* 1.13±0.74** 0.52±0.23**空白對(duì)照組衰老模型組PRO小劑量組PRO中劑量組PRO大劑量組視野數(shù)（個(gè)）64 64 64 64 64

（3）PRO對(duì)衰老模型組小鼠腎細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax表達(dá)的影響。Bcl-2主要在腎小管表達(dá)，而B(niǎo)ax在腎小管和腎小球均有表達(dá)。二者都定位于胞漿，呈灶性分布，染成棕黃色。與空白對(duì)照組比較，衰老模型組Bax表達(dá)明顯增加，Bcl-2表達(dá)較弱，Bax/Bcl-2比值明顯升高（P＜0.01）；與衰老模型組比較，PRO組Bcl-2表達(dá)明顯增強(qiáng)而B(niǎo)ax表達(dá)減弱，Bax/Bcl-2比值顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），見(jiàn)表2。

表2 PRO對(duì)衰老模型組小鼠腎臟凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s）

表2 PRO對(duì)衰老模型組小鼠腎臟凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，△P＜0.01；與衰老模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別劑量視野數(shù)（個(gè)）A值Bax/Bcl-2 Bax Bcl-2空白對(duì)照組衰老模型組PRO小劑量組PRO中劑量組PRO大劑量組0.5ml/只0.5m/只7.5g/kg·d 15.0g/kg·d 30.0g/kg·d 40 40 40 40 40 0.12±0.01 1.21±0.61△0.63±0.51* 0.31±0.72** 0.25±0.12** 0.24±0.01 0.13±0.12△0.51±0.32* 1.11±0.81** 1.42±1.25** 0.50±0.11 4.12±0.33△1.72±0.12* 0.83±0.21** 0.71±0.18**

3 討論

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的一種生理性調(diào)節(jié)機(jī)制，在控制細(xì)胞增殖和分化、腫瘤的發(fā)生和生長(zhǎng)以及機(jī)體免疫調(diào)節(jié)中起著重要作用，腎小管上皮細(xì)胞過(guò)度凋亡是急性腎小管壞死中腎功能異常的重要原因之一。損傷較輕時(shí)，引起細(xì)胞凋亡；損傷較重時(shí)，使細(xì)胞壞死。如能通過(guò)藥物干預(yù)，減少細(xì)胞凋亡，就能使腎小管上皮細(xì)胞再生，從而減少該病發(fā)生[4]。Bcl-2家族分為抑凋亡基因（如：Bcl-2、Bcl-Xl等）和促凋亡基因（如Bax、Bcl-Xs等）。Bcl-2與Bax的比例是決定細(xì)胞凋亡敏感性的變阻器，Bax-Bax同源二聚體促進(jìn)凋亡，Bcl-2-Bax異源二聚體抑制凋亡[5]。Bcl-2和Bax主要位于線粒體膜外側(cè)，僅用于凋亡的線粒體途徑。當(dāng)?shù)蛲霭l(fā)生時(shí)，Bax從胞漿移到線粒體并與線粒體膜結(jié)合，形成二聚體，導(dǎo)致線粒體功能紊亂，引起一系列改變：線粒體滲透性改變、氧化磷酸化和ATP合成功能破壞；細(xì)胞氧化還原作用改變及線粒體中ced-4同源體APaf-1從線粒體中釋放出來(lái)，與細(xì)胞色素C相互作用，激活Caspase，促進(jìn)凋亡[6]。研究表明，Bcl-2過(guò)量表達(dá)能夠延長(zhǎng)神經(jīng)細(xì)胞生存時(shí)間。將表達(dá)Bcl-2基因的質(zhì)粒顯微注入神經(jīng)細(xì)胞可防止其凋亡，如用反義RNA降低Bcl-2表達(dá)，則加速無(wú)生長(zhǎng)因子存在時(shí)的細(xì)胞死亡[7，8]。

木瓜黃精膏由木瓜、黃精、大棗、荷葉四味中藥組成，木瓜和胃健脾、美容養(yǎng)顏，富含17種氨基酸及鈣、鐵等，還含有木瓜蛋白酶、番木瓜堿等。木瓜在中國(guó)素有“萬(wàn)壽果”之稱，顧名思義，多吃可延年益壽。荷葉活血化瘀，涼血止血，清心解暑，另外還有抗衰老、抗氧化之功效[9]。黃精味甘，性平，補(bǔ)脾益氣、滋腎潤(rùn)肺，同時(shí)還可抗氧化及延緩衰老[10]。大棗在抗氧化、改善心血管系統(tǒng)及造血功能等方面有著明顯作用[11]。與空白對(duì)照組比較，衰老模型組小鼠組織勻漿中SOD活性明顯降低，MDA含量顯著升高。本研究觀察到，衰老模型組小鼠腎細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax表達(dá)相對(duì)于正常組增高，Bcl-2表達(dá)下降、Bax/Bcl-2比例升高，表明衰老模型組細(xì)胞凋亡增加。不同劑量PRO均能上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，下調(diào)Bax蛋白表達(dá)，從而使Bax/Bcl-2比值下降，起到調(diào)控腎細(xì)胞凋亡的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，PRO能明顯抑制衰老模型組小鼠腎細(xì)胞凋亡，且其延緩衰老作用呈一定的量效關(guān)系，高、中劑量組抑制細(xì)胞凋亡作用強(qiáng)于低劑量組。綜上所述，PRO能通過(guò)干預(yù)凋亡相關(guān)蛋白Bax/Bcl-2表達(dá)抑制腎細(xì)胞凋亡從而起到抗衰老作用，是一種具有良好應(yīng)用前景的抗衰老藥物。今后我們還要進(jìn)一步研究PRO的臨床治療效果和作用機(jī)理。

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G424.31

B

1671-1246（2017）13-0088-03

注：本文系河南省教育廳自然科學(xué)項(xiàng)目（2009C310008）