4種保存液對(duì)犬紅細(xì)胞低溫保存效果的比較

李 燕， 王昌虹， 劉新峰， 郝志明， 丁向彬

(天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津 300384)

4種保存液對(duì)犬紅細(xì)胞低溫保存效果的比較

李 燕， 王昌虹， 劉新峰， 郝志明， 丁向彬*

(天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津 300384)

犬類(lèi)紅細(xì)胞低溫保存具有較大的臨床應(yīng)用價(jià)值，犬紅細(xì)胞低溫保存液對(duì)犬紅細(xì)胞低溫保存的時(shí)間和保存效果具有重要影響，該實(shí)驗(yàn)選用CPDA-1、CPDA-2、CPDA-3和MAP保存液對(duì)犬紅細(xì)胞進(jìn)行4 ℃下低溫保存，于保存的第0、10和20天分別檢測(cè)各組紅細(xì)胞樣品的紅細(xì)胞數(shù)及K+、Na+和Cl-的濃度，對(duì)低溫保存效果進(jìn)行比較，以尋找適合犬紅細(xì)胞低溫保存的保存液。結(jié)果表明：選用MAP保存液對(duì)犬紅細(xì)胞進(jìn)行保存時(shí)，紅細(xì)胞相對(duì)減少量顯著低于其它組(P<0.05)，紅細(xì)胞樣品中K+濃度的相對(duì)增加量顯著低于其它組(P<0.05)，Na+和Cl-濃度的相對(duì)減少量顯著低于其它組(P<0.05)，說(shuō)明MAP保存液較適合用于犬紅細(xì)胞的低溫保存。

犬；紅細(xì)胞；低溫保存；紅細(xì)胞保存液

隨著養(yǎng)犬人群的日益增長(zhǎng)，犬的健康問(wèn)題得到了越來(lái)越多的關(guān)注，當(dāng)犬出現(xiàn)貧血、失血及嚴(yán)重感染性疾病時(shí)必須緊急輸血，輸血療法是搶救這些危重病例最有效的方法。輸血可以起到迅速補(bǔ)充循環(huán)血量、維持一定血壓、增加血液的凝固性和血紅蛋白的濃度、增加血液運(yùn)輸氧的能力以及刺激機(jī)體的造血機(jī)能等作用。但是新鮮血源并不容易找到，要依靠血庫(kù)提供可用血液，目前在發(fā)達(dá)國(guó)家已有商業(yè)性動(dòng)物血庫(kù)或中心，而我國(guó)在這方面的工作亟待開(kāi)展。延長(zhǎng)犬血液的保存期限，避免血資源浪費(fèi)，顯得尤為重要。存放時(shí)間和溫度對(duì)血液中紅細(xì)胞的功能具有較大的影響[1-2]。紅細(xì)胞保存有4 ℃下的短期保存和-80 ℃或-196 ℃深低溫長(zhǎng)期保存，前者保存期為35～42 d，由于保存期短，往往造成大量紅細(xì)胞的浪費(fèi)，后者保存期可長(zhǎng)達(dá)10年，但應(yīng)用于臨床耗時(shí)費(fèi)力，保存費(fèi)用昂貴，僅用于稀有血型的保存。經(jīng)歷了從常溫保存到低溫保存再到深低溫保存的長(zhǎng)期發(fā)展，人體血液的保存技術(shù)已經(jīng)日趨成熟。紅細(xì)胞低溫保存研究在人上進(jìn)行的比較多，犬類(lèi)紅細(xì)胞低溫保存的研究還比較少。在人紅細(xì)胞4 ℃低溫保存研究中使用過(guò)的保存液有ACD保存液、CPD保存液、CPDA保存液和MAP保存液等[3-5]。這些保存液對(duì)犬紅細(xì)胞低溫保存的效果還需要進(jìn)一步研究，本實(shí)驗(yàn)選用人類(lèi)的紅細(xì)胞保存液(MAP保存液、CPDA-1保存液、CPDA-2保存液、CPDA-3保存液)對(duì)犬的紅細(xì)胞進(jìn)行低溫保存研究，以期找到適合犬紅細(xì)胞低溫保存的保存液，延長(zhǎng)犬紅細(xì)胞低溫保存的時(shí)間，為犬紅細(xì)胞低溫保存研究及動(dòng)物血庫(kù)建立提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

健康雄性犬，3歲，臨床檢查血液相關(guān)指標(biāo)正常，無(wú)受血經(jīng)歷。

1.2 試劑

氯化鈉、葡萄糖、甘露醇、腺嘌呤、磷酸二氫鈉、檸檬酸鈉、檸檬酸，均購(gòu)自天津北方化玻采購(gòu)銷(xiāo)售中心。

1.3 液體配制

1) CPDA-1紅細(xì)胞保存液 檸檬酸鈉2.63 g，檸檬酸0.327 g，磷酸二氫鈉0.222 g，葡萄糖3.19 g，腺嘌呤0.027 g，加蒸餾水至100 mL。

2) CPDA-2紅細(xì)胞保存液 檸檬酸鈉2.63 g，檸檬酸0.327 g，磷酸二氫鈉0.222 g，葡萄糖4.46 g，腺嘌呤0.054 g，加蒸餾水至100 mL。

3) CPDA-3紅細(xì)胞保存液 檸檬酸鈉2.63 g，檸檬酸0.327 g，磷酸二氫鈉0.222 g，葡萄糖5.1 g，腺嘌呤0.054 g，加蒸餾水至100 mL。

4) MAP紅細(xì)胞保存液 葡萄糖0.793 g，磷酸二氫鈉0.094 g，氯化鈉0.497 g，甘露醇1.457 g，檸檬酸鈉0.15 g，腺嘌呤0.014 g，檸檬酸0.02 g，加蒸餾水至100 mL。

1.4 血液采集及低溫保存紅細(xì)胞樣品制備

用加入相應(yīng)比例抗凝劑(3.8%檸檬酸鈉溶液，與血液比例為1∶9)的注射器采集犬前肢內(nèi)側(cè)靜脈血液，離心收集紅細(xì)胞，以3 000 r/min離心10 min，棄上清液，制成濃縮紅細(xì)胞。將濃縮紅細(xì)胞分為4組，每組按1∶1比例加入CPDA-1保存液、CPDA-2保存液、CPDA-3保存液和MAP保存液，每組樣品分裝到9個(gè)保存管中，將添加各種不同保存液的紅細(xì)胞放入4 ℃冰箱中密封保存。于保存的第0、10和20天分別檢測(cè)各組紅細(xì)胞樣品的紅細(xì)胞數(shù)量及K+、Na+和Cl-的濃度。

1.5 紅細(xì)胞計(jì)數(shù)及K+、Na+和Cl-濃度測(cè)定

吸取10 μL各組紅細(xì)胞樣品，用900 μL 0.9%生理鹽水稀釋?zhuān)缓蟛捎醚?xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)各組紅細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

吸取500 μL各組紅細(xì)胞樣品，3 000 r/min離心10 min，吸出上清，采用IMS-972電解質(zhì)分析儀檢測(cè)上清中K+、Na+和Cl-的濃度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)資料分析以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±sd)表示，P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同保存液對(duì)低溫保存后紅細(xì)胞數(shù)量的影響

通過(guò)紅細(xì)胞計(jì)數(shù)法對(duì)4種保存液中紅細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)，由表1可知，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，各組低溫保存樣品中紅細(xì)胞數(shù)量與保存前(第0天)樣品中紅細(xì)胞數(shù)量相比均有不同程度的下降。各組之間紅細(xì)胞的相對(duì)減少量均差異顯著(P<0.05)。其中,CPDA-3組的紅細(xì)胞減少量最高，MAP組的紅細(xì)胞減少量最低，說(shuō)明MAP保存液較適合用于犬紅細(xì)胞的低溫保存。

表1 不同保存液中紅細(xì)胞數(shù)量變化

注：同列中不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05),紅細(xì)胞減少量為第20天和第0天比較。

2.2 不同保存液對(duì)低溫保存紅細(xì)胞樣品中K+濃度的影響

采用電解質(zhì)分析儀檢測(cè)4組紅細(xì)胞樣品上清中K+的濃度。由表2可知，隨時(shí)間的延長(zhǎng)各組紅細(xì)胞樣品上清中K+濃度均呈上升趨勢(shì)，各組低溫保存樣品中K+濃度與保存前(第0天)樣品中K+濃度相比均有不同程度的上升。其中,CPDA-3組K+濃度的相對(duì)增加量最高，MAP組K+濃度的相對(duì)增加量最低，MAP組與其它各組均存在顯著差異(P<0.05)，說(shuō)明MAP保存液較適合用于犬紅細(xì)胞的低溫保存。

表2 不同保存液中K+濃度變化

注：同列中不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。K+相對(duì)增加量為第20天和第0天比較。

2.3 不同保存液對(duì)低溫保存紅細(xì)胞樣品中Na+和Cl-濃度的影響

采用電解質(zhì)分析儀檢測(cè)4組紅細(xì)胞樣品上清中Na+的濃度。由表3可知，隨時(shí)間的延長(zhǎng)各組紅細(xì)胞樣品上清中Na+濃度均呈下降趨勢(shì)，各組低溫保存樣品中Na+濃度與保存前(第0天)樣品中濃度相比均有不同程度的下降。其中,CPDA-3組Na+濃度的相對(duì)減少量最高，MAP組Na+濃度的相對(duì)減少量最低，MAP組與其它各組均存在顯著差異(P<0.05)。

表3 不同保存液中Na+濃度變化

注：同列中不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，Na+相對(duì)減少量為第20天和第0天比較。

采用電解質(zhì)分析儀檢測(cè)4組紅細(xì)胞樣品上清中Cl-的濃度。由表4可知，隨時(shí)間的延長(zhǎng)各組紅細(xì)胞樣品上清中Cl-濃度均呈下降趨勢(shì)，各組低溫保存樣品中Cl-濃度與保存前(第0天)樣品中濃度相比均有不同程度的下降。其中,CPDA-3組Cl-濃度的相對(duì)減少量最高，MAP組Cl-濃度的相對(duì)減少量最低，MAP組與其它各組均存在顯著差異(P<0.05)。

表4 不同保存液中Cl-濃度變化

注：同列中不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，Cl-相對(duì)減少量為第20 天和第0天比較。

3 討論

紅細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變影響和反映了紅細(xì)胞質(zhì)量及回輸后的功能。紅細(xì)胞在保存過(guò)程中，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，紅細(xì)胞會(huì)發(fā)生保存損傷[6-7]和細(xì)胞老化現(xiàn)象。紅細(xì)胞突然接觸血袋中的高滲或低滲溶液、抗凝劑和添加劑，或溶液pH值發(fā)生驟變，都可能引起紅細(xì)胞滲透脆性增高或紅細(xì)胞的破壞。有研究表明，隨著紅細(xì)胞保存時(shí)期的延長(zhǎng)，超氧化物歧化酶活性下降，使紅細(xì)胞內(nèi)自由基清除效率降低，紅細(xì)胞膜的脂質(zhì)過(guò)氧化，膜結(jié)構(gòu)和功能被破壞，進(jìn)而使紅細(xì)胞損傷和死亡[8]。也有研究表明，紅細(xì)胞保存過(guò)程中ATP水平的下降會(huì)影響紅細(xì)胞膜上ATP酶的活性，造成紅細(xì)胞的損傷，使紅細(xì)胞存活率下降[9]。紅細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞容易導(dǎo)致紅細(xì)胞溶血，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，溶血現(xiàn)象逐漸嚴(yán)重，紅細(xì)胞的數(shù)目也相應(yīng)地不斷減少。在紅細(xì)胞低溫保存研究中，研究者們開(kāi)發(fā)出了多種紅細(xì)胞保存液，比如ACD保存液(檸檬酸+檸檬酸鈉+葡萄糖)、CPD保存液(檸檬酸+檸檬酸鈉+葡萄糖+磷酸鹽)、CPDA保存液(檸檬酸+檸檬酸鈉+葡萄糖+磷酸鹽+腺嘌呤)和MAP保存液(檸檬酸+檸檬酸鈉+氯化鈉+腺嘌呤+葡萄糖+甘露醇+磷酸鹽)[3-5]。保存液是血細(xì)胞保存的外部環(huán)境，保存體系的成分組成，以及各種理化性質(zhì)如電導(dǎo)率、滲透壓、pH值等對(duì)于細(xì)胞的代謝和氧化作用影響很大[10]。合適的保存液對(duì)改善血細(xì)胞保存質(zhì)量，延長(zhǎng)血液保存時(shí)間有著重要的意義。

本實(shí)驗(yàn)選用CPDA-1、CPDA-2、CPDA-3和MAP保存液對(duì)犬的紅細(xì)胞進(jìn)行4 ℃下低溫保存，以尋找適合犬紅細(xì)胞保存的保存液，試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著紅細(xì)胞保存時(shí)間的延長(zhǎng)，各保存液組的溶血現(xiàn)象都逐漸加重，紅細(xì)胞的數(shù)量也不斷減少，溶血現(xiàn)象逐漸嚴(yán)重。其中，MAP組的紅細(xì)胞數(shù)目減少量最少，說(shuō)明從保存后紅細(xì)胞的數(shù)目看，MAP保存液的保存效果最好。

鉀是生命所必需的無(wú)機(jī)離子之一，對(duì)人和動(dòng)物機(jī)體極其重要，血清鉀的高低對(duì)機(jī)體的影響較大，紅細(xì)胞內(nèi)鉀濃度約為105 mmol/L，血清中鉀濃度僅為3.5～5.5 mmol/L，紅細(xì)胞內(nèi)鉀濃度約為血清鉀濃度的20倍。在紅細(xì)胞保存過(guò)程中，K+濃度可以反映出紅細(xì)胞破壞的程度。隨保存時(shí)間延長(zhǎng)紅細(xì)胞膜上的脂蛋白及脂質(zhì)逐漸喪失，紅細(xì)胞內(nèi)K+逐漸釋放至紅細(xì)胞外，致使紅細(xì)胞懸液的K+含量升高[11]。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用不同的保存液對(duì)犬紅細(xì)胞進(jìn)行低溫保存后，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)各組K+濃度逐漸升高，在保存的第10天和第20天紅細(xì)胞樣品中K+濃度均高于保存前K+的濃度，說(shuō)明保存后紅細(xì)胞確實(shí)有不同程度的破壞。其中，MAP組K+濃度的相對(duì)增加量最低，說(shuō)明MAP保存液較適合用于犬紅細(xì)胞的低溫保存。

鈉有維持血壓的功能，鈉調(diào)節(jié)細(xì)胞外液容量，構(gòu)成細(xì)胞外液滲透壓，細(xì)胞外液鈉濃度的持續(xù)變化對(duì)血壓有很大影響。體內(nèi)水量的恒定主要靠鈉的調(diào)節(jié)。有研究表明，在紅細(xì)胞體外保存過(guò)程中，隨著保存天數(shù)的增多，紅細(xì)胞懸液中的Na+和Cl-含量隨著保存期延長(zhǎng)而逐漸降低[11-12]。這可能是由于保存后紅細(xì)胞受不同程度的破壞，紅細(xì)胞懸液的K+含量升高，Na+和Cl-濃度的下降有助于維持紅細(xì)胞內(nèi)外的離子濃度平衡。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用不同的保存液對(duì)犬的紅細(xì)胞進(jìn)行低溫保存后，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)各組Na+和Cl-濃度逐漸降低，在保存的第10天和第20天紅細(xì)胞樣品中Na+和Cl-濃度均低于保存前的濃度，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，紅細(xì)胞內(nèi)外離子濃度變化加劇，這種離子濃度的變化可能會(huì)對(duì)紅細(xì)胞的形態(tài)和脆性造成影響，使其更易發(fā)生溶血。本試驗(yàn)中，MAP組Na+和Cl-濃度的相對(duì)減少量最低，說(shuō)明MAP保存液較適合用于犬紅細(xì)胞的低溫保存。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)選用CPDA-1、CPDA-2、CPDA-3和MAP保存液對(duì)犬的紅細(xì)胞進(jìn)行4 ℃下低溫保存，通過(guò)紅細(xì)胞樣品中紅細(xì)胞數(shù)及K+、Na+和Cl-的濃度變化檢測(cè)對(duì)犬紅細(xì)胞低溫保存的效果進(jìn)行研究。試驗(yàn)結(jié)果表明，選用MAP保存液對(duì)紅細(xì)胞進(jìn)行保存時(shí)，紅細(xì)胞相對(duì)減少量、紅細(xì)胞樣品中K+濃度的相對(duì)增加量、Na+和Cl-的相對(duì)減少量均顯著低于其它組，說(shuō)明MAP保存液中紅細(xì)胞破壞較少，紅細(xì)胞內(nèi)外離子濃度變化較小，有利于維持紅細(xì)胞的正常形態(tài)，比較適合用于犬紅細(xì)胞的低溫保存。

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Effects of four different preservation solutions on low-temperature preservation of canine erythrocyte

LI Yan, WANG Changhong, LIU Xinfeng, HAO Zhiming, DING Xiangbin*

(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,TianjinAgriculturalUniversity,Tianjin300384,China)

Low-temperature preservation of canine erythrocyte has important clinical value，the preservation solution plays an important role in canine erythrocyte preservation. In this study, four different preservation solutions (CPDA-1, CPDA-2, CPDA-3 and MAP) were used for canine erythrocyte preservation at 4 ℃, the proper preservation solution was selected according to the erythrocyte number and K+, Na+and Cl-concentrations. The results showed that the erythrocyte number in preservation solution was decreased, and the reduction number of erythrocyte in MAP group was significantly lower than that of other groups (P<0.05). The K+concentration in preservation solution was increased, but the K+augmenter in MAP group was significantly lower than that of other groups (P<0.05). The Na+/Cl-concentration in preservation solution was decreased, but the Na+/Cl-concentration decrements in MAP group was significantly lower than that of other groups (P<0.05). These results indicated the MAP solution was more suitable for the low-temperature preservation of canine erythrocyte.

canine; erythrocyte; low-temperature preservation; erythrocyte preservation solutions

2017-03-26 基金項(xiàng)目：天津市“131”創(chuàng)新型人才培養(yǎng)計(jì)劃第2層次人選資助計(jì)劃項(xiàng)目

李燕(1991—)，女，貴州遵義人，在讀碩士，研究方向?yàn)閯?dòng)物細(xì)胞工程與繁殖生物技術(shù)。丁向彬?yàn)橥ㄐ抛髡撸?/p>

E-mail：xiangbinding@163.com

1004-7999(2017)02-0071-05

10.13478/j.cnki.jasyu.2017.02.012

S829.2

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