綠豆分子遺傳圖譜構建及若干農(nóng)藝性狀的QTL定位分析

王建花張耀文程須珍王麗俠

1山西大學, 山西太原 030006;2中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所, 北京 100081;3山西省農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所, 山西太原030031

綠豆分子遺傳圖譜構建及若干農(nóng)藝性狀的QTL定位分析

王建花1,2,3張耀文3程須珍2,*王麗俠2,*

1山西大學, 山西太原 030006;2中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所, 北京 100081;3山西省農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所, 山西太原030031

利用花葉1號×紫莖1號雜交后代衍生的208個F2家系組建群體, 構建含有95個SSR標記位點的遺傳連鎖圖譜, 該圖譜包含11個連鎖群, 全長1457.47 cM, 標記平均間距為15.34 cM。利用復合區(qū)間作圖法, 對株高、幼莖色、主莖色、生長習性、結莢習性、復葉葉形和成熟葉色等農(nóng)藝性狀進行QTL分析, 分別檢測到與株高、幼莖色、主莖色、復葉葉形有關的QTL各1個, 貢獻率在8.49%～66.64%之間; 與結莢習性有關的QTL3個, 貢獻率在60.32%～80.36%之間; 與成熟葉色有關QTL 4個, 貢獻率在69.06%～87.35%之間; 與生長習性有關的QTL數(shù)量最多, 共26個, 貢獻率在58.32%～99.51%之間。上述QTL主要分布在LG1、LG2、LG4、LG8和LG10連鎖群, 其中LG1最少, 僅檢測到生長習性的1個QTL, LG4最多, 包含了幼莖色、主莖色、結莢習性、生長習性、復葉葉形、成熟期葉色6個農(nóng)藝性狀的15個QTL; 這些QTL既可以應用于綠豆育種的分子標記輔助選擇, 也對深入研究這些性狀的遺傳奠定了基礎。

綠豆; 連鎖遺傳圖譜; SSR標記; 復合區(qū)間作圖法; QTL; 貢獻率

綠豆[Vigna radiata (L.) Wilczek](2n=2x=22)是豆科(Leguminosae)蝶 形 花 亞 科 (Papilionaceae)菜 豆 族(Phaseoleae)豇豆屬(Vigna)的一個種, 是一種快速生長的熱季豆類作物, 主要在亞洲發(fā)展中國家種植, 是世界上重要的豆類作物。綠豆的基因組較小, Kang等[1]使用MAKER pipeline[2]預測并通過測序得到綠豆的基因組為421 Mbp (占全基因組得到的80%), 與豆科模式植物百脈根和蒺藜苜?；蚪M(均約為 470 Mbp)大小相近[3], 并繪制了豇豆屬的第一個基因組序列草圖。

圖譜構建與基因定位是綠豆基因組研究的重要環(huán)節(jié),是基因克隆乃至基因組結構與功能研究的基礎。目前, 綠豆的基因定位研究還處于起步階段, 已定位的性狀主要有抗白粉病和抗豆象, Humphry等[4]、Reddy[5]、Parinya等[6]、Chaitieng等[7]、Young等[8]都有相關報道, 其中Reddy[5]以3個抗白粉病綠豆株系(V4718、V4758、V4785)為研究材料, 證明抗白粉病基因是由單顯性基因控制的,主要有 Pm1、Pm2等。梅麗等[9]、趙丹等[10]、鐘敏[11]和吳傳書等[12]利用Berken/ACC41為材料, 將抗豆象基因定位在第9連鎖群上一個2.4 cM的區(qū)間內(nèi), 離其兩側的標記C220和Vr2-627的距離分別為0.7 cM和1.7 cM。此外,梅麗等[9]以Berken/ACC41為材料, 利用基于混合線性模型[13]的QTLNetwork 2.0[14]軟件的復合區(qū)間作圖法進行QTL分析,并檢測出播種到出苗時間、播種到開花時間、生育期等9個農(nóng)藝性狀相關的33個加性效應位點(趙丹等[10]和鐘敏[11])。

綠豆中除了產(chǎn)量相關性狀外, 還有好多表型性狀可用于品種純度鑒定、特性鑒別等研究中, 如花青甙顯色、葉形等等。本研究利用具有特異葉形的花葉1號和具有明顯花青甙顯色的紫花1號的后代群體, 對某些表型性狀進行 QTL定位, 旨在盡可能發(fā)掘有利用價值的等位基因,將分子標記輔助選擇用于育種實踐, 以培育優(yōu)質高產(chǎn)和多抗新品種; 另一方面可從眾多綠豆種質資源中選擇出有價值的材料。

1 材料與方法

1.1 分離群體材料

2015年選用紫莖1號為父本、花葉1號為母本, 配制雜交組合。以幼莖色鑒別真假雜種后, 將雜種F2種植在北京, 小區(qū)行長1 m, 株距10 cm, 田間對親本及208個F2群體的株高(PH)、幼莖色(YSC)、主莖色(MSC)、生長習性(GH)、結莢習性(PHA)、成熟葉色(MLC)(注: 收莢時葉片的顏色)和復葉葉形(TLS)性狀, 嚴格按照《綠豆種質資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標準》[15]的分級標準統(tǒng)計分析(其中復葉葉形人為劃分為花、半圓、圓3個等級)并轉換為“1”、“2”、“3”。

1.2 SSR引物

SSR引物均基于 SSR富集文庫, 利用磁珠富集法開發(fā)[15], 其中單核苷酸單元重復序列引物(Vr1) 2007對, 二核苷酸單元重復序列引物(Vr2) 1696對, 三核苷酸單元重復序列引物(Vr3) 1485對, 共5188對。均由北京賽百盛生物技術有限公司合成。

1.3 總DNA提取和PCR擴增

采集親本以及 F2群體每個單株的幼嫩葉片, 分別放入液氮罐中備用。用 Retsch MM400混合型碾磨儀研磨,改良的CTAB法[16]提取基因組DNA, 紫外分光光度計法檢測DNA的質量。

PCR擴增反應總體積10 μL, 含30 ng基因組DNA, 1×Taq緩沖液 (20 mmol L–1Tris-HCl, pH 8.8; 10 mmol L–1KCl; 10 mmol L–1(NH4)2SO4; 1.5 mmol L–1MgCl2; 0.1% Triton X-100), 1 mmol L–1dNTPs, 上下游引物各 0.25 μmol L–1和1 U Taq DNA聚合酶。PCR程序為95℃預變性5 min, 95℃變性30 s, 55℃退火45 s, 72℃延伸45 s, 進行35個循環(huán), 最后72℃延伸5 min, 4℃保存。整個反應在東勝EDC-810 PCR擴增儀上進行。

用 8%的聚丙烯酰胺非變性凝膠電泳分離擴增產(chǎn)物,在200 V恒壓下電泳, 根據(jù)SNP分子量的大小及差異帶型的可辨程度調整電泳時間, 一般在1.0～1.5 h左右。將凝膠用蒸餾水洗滌2次后, 用0.2%的AgNO3溶液染色10 min,蒸餾水洗滌2次后用1.5% NaOH加0.5%甲醛溶液顯影至條帶清晰, 蒸餾水洗滌2次后讀帶。

1.4 連鎖圖譜的構建

根據(jù)電泳結果, 用 A、B、H、“-”表示標記的母本、父本、雜合、缺失。根據(jù)已知分子量的Marker (600 bp DNA marker)計算各多態(tài)性條帶的分子量。將 SSR多態(tài)性帶按親本來源歸類, 分別轉化為“0”、“2”、“1”、“–1”。根據(jù)各位點在作圖群體中的分離比, 采用JoinMap 4.0軟件構建F2群體的遺傳連鎖圖譜。

1.5 QTL定位分析

利用QTL IciMapping V4.0軟件進行QTL的定位。采用區(qū)間作圖法對基因型和性狀進行分析, 將 Permutation次數(shù)設置為1000次, LOD≥3.68作為QTL的入選臨界值。檢測性狀與作圖標記之間的關系及 QTL位點在遺傳連鎖圖譜上的位置, 估算出與農(nóng)藝性狀相關基因位點的貢獻率等參數(shù)。最后利用JoinMap 4.0整合的MapChart輸出圖譜。

2 結果與分析

2.1 SSR標記的多態(tài)性分析

共篩選5188對SSR引物, 4281對引物有穩(wěn)定的擴增產(chǎn)物, 親本間有多態(tài)且擴增穩(wěn)定的的引物99對。其中Vr1引物有效擴增1651對, 有效擴增率82.26%, 多態(tài)性引物64對; Vr2引物有效擴增 1309對, 有效擴增率 77.18%,多態(tài)性引物55對; Vr3引物有效擴增1321對, 有效擴增率88.96%, 多態(tài)性引物32對, 表明二核苷酸單元重復序列引物多態(tài)性比率(4.20%)最高, 單核苷酸單元重復序列引物的多態(tài)性比率(3.88%)次之, 三核苷酸單元重復序列引物多態(tài)性比率(2.42%)最低。另外還從豇豆SSR引物和綠豆公布序列引物中分別得到親本多態(tài)性引物 1對和3對。

2.2 連鎖圖譜的構建

利用篩選的 99對引物分析 208個 F2群體后, 應用JoinMap 4.0軟件進行連鎖分析, 構建綠豆遺傳連鎖圖譜。該圖譜包含了 95個 SSR標記(其中Vr3-985、Vr2-657、Vr1-574和Vr2-1430未連鎖上), 分屬11個連鎖群(LG), 總覆蓋基因組長度 1457.47 cM, 各連鎖群長度在 5.52～613.74 cM之間, 其中LG6最短, LG4最長。不同連鎖群上包含的標記位點在 2～28個之間, 標記之間平均距離在1.38～21.92 cM之間。

表1 不同引物在F2群體親本中的擴增Table 1 Amplification of different markers in parents of F2

表2 遺傳圖譜分析Table 2 Analysis of genetic map

根據(jù)已知綠豆基因組引物標記分布情況, 比對本文連鎖圖譜可知, 第一連鎖群(LG1)有11個標記, 其中只有Vr2-401位于綠豆基因組的Chr.6; LG2有19個標記, 其中70%的標記對應于綠豆基因組的Chr.9; LG3有7個標記,其中43%的標記對應于綠豆基因組的Chr.1; LG4有28個標記, 7個標記對應綠豆基因組的Chr.4, 8個對應綠豆基因組的Chr.5, 7個標記對應綠豆基因組的Chr.8; LG5有3個標記, 全都對應綠豆基因組的Chr.1; LG6有4個標記, 2個對應綠豆基因組的Chr.1, 另外2個對應Chr.7; LG7有2個標記, 對應綠豆基因組Chr.8; LG8有4個標記, 全都對應綠豆基因組Chr.7; LG9有5個標記, 其中3個對應綠豆基因組Chr.11; LG10有7個標記, 與綠豆基因組無明顯的對應關系; LG11有5個標記, 全部對應綠豆基因組Chr.7。

2.3 綠豆重要農(nóng)藝性狀在F2群體中的表現(xiàn)

分析表明, 數(shù)量性狀株高在F2群體中存在差異。各單株的株高差異明顯, 標準差為 5.92, 變異幅度大, 且株高在F2群體中均呈正態(tài)分布(圖1)。其余6個均為質量性狀,且用 SAS統(tǒng)計軟件對 F2群體 208個單株進行統(tǒng)計分析,株高(PH)、幼莖色(YSC)、主莖色(MSC)、生長習性(GH)、結莢習性(PHA)、復葉葉形(TLS)成熟葉色(MLC)的卡方檢驗結果(P=0.05)均不符合孟德爾遺傳分離比(圖1)。故可認為7個農(nóng)藝性狀均為多基因控制的遺傳性狀。

2.4 綠豆重要農(nóng)藝性狀的QTL定位

應用復合區(qū)間作圖法, LOD等于3.68作為閾值。檢測到7個性狀的38個QTL (表3)。檢測到1個株高QTL, 位于連鎖群 8的 Vr3-932–Vr2-1233 (11.79 cM)區(qū)間, 與Vr2-1233的遺傳距離為11.79 cM, 遺傳貢獻率為8.49%。

檢測到1個幼莖色QTL, 位于連鎖群4的Vr2-1042–Vr1-1057 (63.74 cM)區(qū)間, 與 Vr2-1042的遺傳距離為28 cM, 遺傳貢獻率為66.64%。

檢測到1個主莖色QTL, 位于連鎖群4的Vr04-12148918–Vr2-1042 (45.49 cM)區(qū)間, 與Vr2-1042的遺傳距離為19 cM, 遺傳貢獻率為38.68%。

檢測到 3個結莢習性 QTL, 一個位于連鎖群 2的Vr3-837–Vr2-440 (25.54 cM)區(qū)間, 與Vr2-440的遺傳距離為9.7 cM, 遺傳貢獻率為60.32%; 另外2個都位于連鎖群4的Vr1-545–Vr3-1177 (63.36 cM)區(qū)間, 其中一個位于346 cM處, 與Vr1-545的遺傳距離為25.99 cM; 另一個位于361 cM處, 與Vr3-1177的遺傳距離為22.37 cM, 遺傳貢獻率分別為67.82%、80.36%。

圖1 F2群體中數(shù)量性狀與質量性狀的分布Fig. 1 Distribution of quantitative and quality traits in F2population

檢測到 26個生長習性 QTL, 一個位于連鎖群 1的Vr3-791–Vr3-303 (3.55 cM)區(qū)間, 與Vr3-303的遺傳距離為1.58 cM, 遺傳貢獻率為58.32%; 16個位于連鎖群2的Vr3-837–Vr2-440 (25.54 cM)、Vr2-440–Vr1-1509 (53.86 cM)區(qū)間, 遺傳貢獻率均為 99.51%; 8個位于連鎖群 4的Vr3-1117–Vr3-1177 (98.33 cM)區(qū)間, 遺傳貢獻率均為99.51%; 1個位于連鎖群10的Vr3-1246–Vr3-40 (17.87 cM)區(qū)間, 與Vr3-40的遺傳距離為6.29 cM, 遺傳貢獻率均為99.51%。

檢測到一個復葉葉形QTL, 位于連鎖群4的Vr1-598～Vr1-2059 (67.79 cM)區(qū)間, 與 Vr1-2059的遺傳距離為31.32 cM, 遺傳貢獻率為54.96%。

檢測到4個成熟期葉色QTL, 2個位于連鎖群2, 其中一個位于Vr2-1675–Vr3-107 (52.14 cM)區(qū)間, 與Vr3-107的遺傳距離為 25.14 cM; 另一個位于 Vr2-440–Vr1-1509 (53.86 cM)區(qū)間, 與Vr1-1509的遺傳距離為25.56 cM, 遺傳貢獻率分別為87.35%和69.06%; 2個位于連鎖群4, 其中一個位于Vr1-598–Vr1-2059 (67.79 cM)區(qū)間, 與Vr1-2059的遺傳距離為 32.32 cM; 另一個位于 Vr04-12148918–Vr2-1042 (45.49 cM)區(qū)間, 與Vr04-12148918的遺傳距離為21.49 cM, 遺傳貢獻率分別為87.2%、84.3%。

3 討論

3.1 綠豆遺傳圖譜的構建

遺傳圖是定位和挖掘基因的基本工具。綠豆現(xiàn)有遺傳圖的標記密度仍然很低, 并且只有少數(shù)基因被定位。早期圖譜由 RFLP標記構建的 14個連鎖群組成, 平均標記間距為9 cM[18], 另2個圖譜由12個連鎖群組[19]組成, 而基于RFLP標記的另一個連鎖圖譜只有9個連鎖群[20]。Wang等[21]整合了一張含有560個標記物的11個連鎖群遺傳圖譜, 連鎖群的長度為 45.2～117.0 cM, 總覆蓋度為 732.9 cM, 平均間隔在1.3 cM之間, 是比較飽和的遺傳圖譜。本研究所構建的新圖譜大于鐘敏[11]構建圖譜的長度735.0 cM, 小于趙丹等[10]的 1831.8 cM, 且標記間距遠大于Humphry等[22]和Wang等[21]的3.0 cM和1.3 cM, 圖譜上的標記較少。其主要原因是試驗所用的親本都為栽培品種,與前人用的野生種、野生種加栽培種相比, 栽培種之間的遺傳背景相似, 基因組變化較小, 所以篩選到的多態(tài)性引物比較少, 導致所繪制的連鎖圖譜長度比之前研究發(fā)表的圖譜長, 標記間平均距離大。另外本文使用的是F2群體的208個家系, 前人研究所用材料為RIL群體, 對圖譜的構建也會造成一定影響。

表3 綠豆7個產(chǎn)量相關性狀的QTL及其遺傳分析Table 3 QTLs for seven yield-related traits and their genetic analysis in F2population

圖2 檢測到的主效QTL在連鎖群上的分布(LG)Fig. 2 Location of additive effects QTLs on linkage groupsGH: growth habit; MLC: mature leaf color; PHA: podding habit; TLS: trilobate leaf shape; MSC: main stem color; YSC: young stem color; PH: plant height.

3.2 綠豆農(nóng)藝性狀的QTL定位相關分析

本研究所構建圖譜與趙丹等[10]、鐘敏[11]加密連鎖圖譜的QTL定位結果相比, 將株高QTL定位在LG8, 與梅麗[23]的研究結果(第 2、第 8、第 9連鎖群)基本一致, 對其他6個農(nóng)藝性狀都是首次進行QTL定位。且本研究中發(fā)現(xiàn), 控制生長習性的QTL主要集中在第2、第4連鎖群,且成簇出現(xiàn)。在第2連鎖群Vr3-837～Vr1-1509之間79.4 cM, 檢測到16個生長習性QTL, 且各個位點之間的距離為2～15 cM, 第4連鎖群Vr3-1117～Vr3-1177之間98.33 cM, 檢測到 8個生長習性 QTL, 且各個位點之間的距離為2～31 cM。在鐘敏[11]的研究中也發(fā)現(xiàn)相同的現(xiàn)象, 影響莢長的QTL在第9連鎖群的P3-334～P1-37有2個。復葉葉形(TLS) QTL被定位在LG4的Vr1-598～Vr1-2059之間,相距67.79 cM, 且Vr1-598屬于第5染色體, Vr1-2059屬于第 8染色體, 而 Jiao等[24]將葉瓣邊緣基因(lma)定位在綠豆的Chr.3, 結果不一致。

對比已知的綠豆基因組染色體標記可知, LG2= Chr.9; LG3上43%的標記與LG5上全部標記對應于綠豆基因組的第1染色體上, 理論上LG3和LG5為同一條連鎖群, 即LG3+ LG5=Chr.1; LG8與LG11的所有標記全都對應于綠豆基因組的第7染色體上, 理論上LG8和LG11為同一條連鎖群, 即LG8+LG11=Chr.7; LG9上60%標記全都對應于綠豆基因組的第 11條染色體上,理論上LG9=Chr.11; LG4上由Chr.4、Chr.5和Chr.8的標記所組成, 理論上應該拆分為3條染色體, 即Chr.4、Chr.5和Chr.8。其余的連鎖群上標記分布散亂, 無規(guī)律可循, 導致上述結果的原因可能是標記數(shù)量少、各連鎖群上的標記區(qū)間過大。實驗所觀測的7個農(nóng)藝性狀主要集中在 LG1、LG2、LG4、LG8、LG10上, 其中 LG1最少, LG4最多; 其余連鎖群沒有檢測到相關農(nóng)藝性狀的QTL。

今后的研究工作應注重構建新的 NIL群體用于連鎖圖譜分析, 增加結果的可靠性, 并開發(fā)新的標型記類, 提高引物多態(tài)性, 提高連鎖圖譜上的標記密度。

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Construction of Genetic Map and Identification of QTLs Related to Agronomic Traits in Mung Bean

WANG Jian-Hua1,2,3, ZHANG Yao-Wen3, CHENG Xu-Zhen2,*, and WANG Li-Xia2,*

1Shanxi University, Taiyuan 030006, China;2Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China;3Institute of Crop Science, Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Taiyuan 030031, China

Two hundreds and eight individuals of F2population, derived from a cross between two mung bean genotypes (Huaye 1 and Zijing 1) were used to construct genetic map, and to identify QTLs related to important agronomic traits. This genetic map contained 11 linkage groups with a total length of 1457.47 cM and an average interval of 15.34 cM. QTLs mapping was conducted for plant height, young stem color, main stem color, growth habit, podding habit, trilobate leaf shape and mature leaf color using composite interval mapping method. Only one QTL for each trait was detected including plant height, young stem color, main stem color and trilobate leaf shape, and with a contribution ranging from 8.49% to 66.64%. Three QTLs with high contribution rates from 60.32% to 80.36% were identified for the trait of pod habit in mung bean. Four QTLs related to mature leaf color showed at contribution rate from 69.06% to 87.35%. There were 26 QTLs related to growth habit, the most of the tested QTLs, with a contribution rate each from 58.32% to 99.51%. The present QTLs for seven agronomic traits distributed on LG1, LG2, LG4, LG8, and LG10, respectively, could be used in molecular breeding based on marker-assisted selection in mung bean, and also lay a foundation for further study of the inheritance of these traits.

Mung bean; Genetic linkage map; SSR markers; Composite interval mapping (CIM); QTL; Contribution rate

(

): 2016-12-11; Accepted(接受日期): 2017-03-02; Published online(網(wǎng)絡出版日期): 2017-03-19.

10.3724/SP.J.1006.2017.01096

本研究由國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項(CARS-09)和中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程資助。

This study was supported by the China Agriculture Research System (CARS-09) and the Agricultural Science and Technology Innovation Program of CAAS。

*通訊作者(Corresponding authors): 程須珍, E-mail: chengxuzhen@caas.cn, 王麗俠, E-mail: wanglixia03@caas.cn, Tel: 010-62180535

聯(lián)系方式: E-mail: 986254540@qq.com

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20170319.1749.002.html