哺乳期干預(yù)甘油三酯型和磷脂型DHA對(duì)仔鼠體組織DHA水平的影響

王丹丹，吳 芳，溫 敏，王靜鳳，薛長(zhǎng)湖，王玉明

(中國(guó)海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003)

油脂營(yíng)養(yǎng)

哺乳期干預(yù)甘油三酯型和磷脂型DHA對(duì)仔鼠體組織DHA水平的影響

王丹丹，吳 芳，溫 敏，王靜鳳，薛長(zhǎng)湖，王玉明

(中國(guó)海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003)

研究哺乳期母鼠干預(yù)甘油三酯型DHA(DHA-TG)和磷脂型DHA(DHA-PL)對(duì)仔鼠體組織脂肪酸組成及二十二碳六烯酸(DHA)水平的影響。母鼠妊娠期給予n-3多不飽和脂肪酸(n-3 PUFAs)缺乏飼料，產(chǎn)仔后分別給予n-3 PUFAs缺乏飼料(缺乏組)、含DHA-TG飼料(DHA-TG組)和含DHA-PL飼料(DHA-PL組)，飼喂至仔鼠3周齡斷乳。測(cè)定仔鼠腦皮質(zhì)、肝臟、血清和紅細(xì)胞總脂中脂肪酸組成和DHA含量。與缺乏組相比，哺乳期干預(yù)DHA-TG和DHA-PL后仔鼠各組織中DHA和n-3 PUFAs含量均顯著升高，二十二碳五烯酸(DPA)、花生四烯酸(AA)、∑n-6 PUFAs與∑n-3 PUFAs比值均顯著降低。其中DHA-PL組仔鼠腦皮質(zhì)和紅細(xì)胞總脂中DHA水平顯著高于DHA-TG組，而肝臟和血清中DHA水平兩組之間無(wú)顯著性差異。總之，哺乳期母鼠補(bǔ)充DHA-TG和DHA-PL均可顯著提高仔鼠各組織中DHA水平，其中DHA-PL對(duì)腦皮質(zhì)和紅細(xì)胞中DHA的補(bǔ)充效果更佳。

二十二碳六烯酸(DHA)；n-3 PUFAs缺乏；仔鼠；哺乳期

二十二碳六烯酸(DHA)是典型的n-3多不飽和脂肪酸(n-3 PUFAs)，對(duì)嬰幼兒大腦的發(fā)育和功能十分重要[1]。n-3 PUFAs缺乏不僅影響發(fā)育期的腦結(jié)構(gòu)，引發(fā)學(xué)習(xí)、認(rèn)知行為障礙，還會(huì)增加子代成年期焦慮、抑郁癥等精神類疾病的風(fēng)險(xiǎn)[2]。大腦發(fā)育的高峰期集中在妊娠期第三階段以及哺乳期，需要蓄積足量DHA以滿足神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育[3]。大腦本身合成DHA的能力微弱，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足發(fā)育的需求，因此需要通過(guò)血液從肝臟和膳食中補(bǔ)充DHA。然而，嬰幼兒的肝臟利用n-3脂肪酸前體物質(zhì)ALA 合成 DHA的效率低下[4-5]，所以哺乳期嬰幼兒體內(nèi)DHA主要來(lái)源于母乳。據(jù)報(bào)道[6]，哺乳期母體補(bǔ)充DHA能夠顯著提高母乳中DHA含量以及總n-3 PUFAs與n-6 PUFAs比例，且與甘油三酯型DHA(DHA-TG)相比，磷脂型DHA(DHA-PL)具有更高的生物利用率[7]。近年來(lái)，發(fā)現(xiàn)DHA-PL具有多種生物學(xué)功效，但通過(guò)母乳對(duì)哺乳期子代體組織DHA的補(bǔ)充效果鮮有報(bào)道，而有關(guān)DHA-TG的相關(guān)研究較多。因此，本文通過(guò)對(duì)n-3 PUFAs 缺乏背景下的哺乳期母鼠干預(yù)DHA-TG和DHA-PL，比較二者對(duì)仔鼠體組織中脂肪酸組成及DHA水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

鳶烏賊(Sthenoteuthisoualaniensis)卵，由威海博宇食品有限公司提供；甘油酯型魚油(DHA-TG，純度>90%)，由宜賓匯海源生物科技有限公司提供；SPF級(jí)ICR小鼠，8周齡，20～25 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。氯仿、甲醇、正己烷、石油醚等均為分析純。

AB135-S型精密電子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司；IKA MS 3 Digital旋渦混勻器，德國(guó)IKA集團(tuán)；HD-200p型加熱器及氮吹設(shè)備，瑞士Blue Marlin公司；Agilent 7820型氣相色譜儀，美國(guó)Agilent科技公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DHA-PL的制備

將冷凍鳶烏賊卵室溫下解凍后勻漿、凍干，獲得卵粉，按照Folch法[8]從鳶烏賊卵中提取總脂，用冷丙酮洗滌數(shù)次獲得粗DHA-PL。粗DHA-PL經(jīng)硅膠柱層析法[9]純化后，得DHA-PL，純度達(dá)90%以上，脂肪酸組成中DHA占32%、EPA占13%。

1.2.2 動(dòng)物分組及飼料配制

ICR小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，雌雄合籠交配，以查到母鼠陰栓脫落為妊娠期開始的標(biāo)志。自妊娠之日起，飼喂n-3 PUFAs缺乏飼料，直至產(chǎn)仔。產(chǎn)仔后，母鼠隨機(jī)分為3組，分別飼喂n-3 PUFAs缺乏飼料(缺乏組)、含DHA-TG飼料(DHA-TG組)和含DHA-PL飼料(DHA-PL組)，飼喂至仔鼠3周齡斷乳。另設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組，即在妊娠期和哺乳期均飼喂n-3 PUFAs充足飼料(充足組)。采用氣相色譜法[10]測(cè)定各組飼料總脂中脂肪酸組成。飼料配方及總脂中脂肪酸組成如表1、表2所示。

表1 飼料配方組成 g/kg

表2 飼料總脂中脂肪酸組成

注：各飼料配方均建立在AIN93G基礎(chǔ)上，DHA-TG和DHA-PL兩組飼料中DHA+EPA添加量均按照飼料5 g/kg配制。SFA，飽和脂肪酸；MUFA，單不飽和脂肪酸；PUFA，多不飽和脂肪酸。ND表示未檢出。下同。

1.2.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

ICR母鼠在室溫(23±2)℃、相對(duì)濕度50%～60%、12 h∶12 h明暗交替的條件下，采用自由飲水和定量攝食的方式飼養(yǎng)，待母鼠產(chǎn)仔后，繼續(xù)飼養(yǎng)至仔鼠3周齡斷乳。仔鼠摘眼球取血，脫頸椎處死，分離肝臟、腦皮質(zhì)等組織，稱重并經(jīng)液氮速凍后，于-80℃保存?zhèn)溆?。血液室溫靜置30 min，離心(4℃，7 500 r/min，15 min)，分離上層血清和下層紅細(xì)胞。

1.2.4 小鼠各組織中脂肪酸分析

按照Folch法[10]從腦皮質(zhì)、肝臟、紅細(xì)胞、血清中提取總脂，經(jīng)皂化后室溫下用鹽酸-甲醇(體積比1∶5)試劑進(jìn)行甲酯化處理，利用氣相色譜儀分析各組織中脂肪酸組成。

氣相色譜條件：色譜柱為HP-INNOWax石英毛細(xì)管柱(30 m×320 μm×0.25 μm)，載氣為高純度氮?dú)?，模式為恒定壓?62.47 kPa)，流速為1.19 mL/min，分流比為20∶1；檢測(cè)器為火焰離子化檢測(cè)器(FID)，進(jìn)樣口溫度為240℃，檢測(cè)器溫度為250℃；升溫程序?yàn)?70℃(5 min)→3℃/min→210℃(30 min)，平衡時(shí)間3 min。各脂肪酸含量以其占總脂肪酸含量的百分比表示。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與討論

2.1 哺乳期補(bǔ)充DHA-TG和DHA-PL對(duì)仔鼠腦皮質(zhì)總脂中脂肪酸組成的影響

仔鼠腦皮質(zhì)總脂中主要脂肪酸組成如表3所示。哺乳期是小鼠腦發(fā)育的高峰期，腦內(nèi)DHA主要來(lái)源于母體(母乳)，母體DHA水平直接決定了仔鼠腦內(nèi)DHA水平[11]。據(jù)報(bào)道[12]，飲食中n-3 PUFAs 不足而n-6 PUFAs相對(duì)豐富的情況下，腦皮質(zhì)內(nèi)DPA(22∶5n-6)水平會(huì)上升，所以DPA可以作為n-3 PUFAs相對(duì)缺乏的一個(gè)指標(biāo)。由表3可知，與缺乏組相比，DHA-TG和DHA-PL兩組仔鼠腦皮質(zhì)內(nèi)DHA水平分別升高了32.50%(P<0.01)和50.65%(P<0.01)；AA和DPA水平均顯著降低，其中AA分別降低了17.05%(P<0.05)和26.94%(P<0.01)，DPA分別降低了40.00%(P<0.01)和47.42%(P<0.01)。此外，總n-3 PUFAs水平顯著高于缺乏組(P<0.05)，∑n-6 PUFAs與∑n-3 PUFAs比值顯著低于缺乏組(P<0.05)。

表3 仔鼠腦皮質(zhì)總脂中主要脂肪酸組成

注：缺乏組與充足組相比*P<0.05；**P<0.01。缺乏組與DHA-TG、DHA-PL組相比，不同字母表示存在顯著性差異，P<0.05。

本研究結(jié)果顯示，妊娠期及哺乳期缺乏n-3 PUFAs會(huì)導(dǎo)致仔鼠腦皮質(zhì)內(nèi)DHA含量顯著降低，DPA含量明顯升高，這與付慧聰[13]的研究結(jié)果相一致。在哺乳期給予母鼠DHA-TG和DHA-PL均可顯著提高仔鼠腦皮質(zhì)中DHA水平，且DHA-PL比DHA-TG作用效果更佳，這種差異可能是由于DHA-TG和DHA-PL在體內(nèi)的代謝途徑不同導(dǎo)致的[14]。同時(shí)，哺乳期補(bǔ)充DHA-TG和DHA-PL可顯著降低仔鼠腦皮質(zhì)內(nèi)AA和DPA等n-6 PUFAs水平。由此可知，哺乳期補(bǔ)充DHA對(duì)仔鼠腦皮質(zhì)內(nèi)DHA的蓄積以及脂肪酸組成具有重要意義。

2.2 哺乳期補(bǔ)充DHA-TG和DHA-PL對(duì)仔鼠肝臟總脂中脂肪酸組成的影響

仔鼠肝臟總脂中主要脂肪酸組成如表4所示。肝臟作為脂肪酸代謝的主要場(chǎng)所，膳食脂肪酸中DHA水平會(huì)影響肝臟中DHA的蓄積[15]。由表4可知，與缺乏組相比，哺乳期干預(yù)DHA-TG和DHA-PL后，仔鼠肝臟總脂中DHA水平顯著升高，且高于充足組；肝臟AA水平顯著低于缺乏組(6.27%±0.74%)，分別降低了21.21%和23.60%；此外，∑MUFAs水平顯著降低，∑n-3 PUFAs水平顯著升高(P<0.05)；∑n-6 PUFAs與∑n-3 PUFAs比值顯著低于缺乏組(P<0.01)。

表4 仔鼠肝臟總脂中主要脂肪酸組成

我們前期的研究表明[16]，在低脂和高脂飲食條件下，成年期小鼠短期補(bǔ)充DHA-TG和DHA-PL能夠同等程度地增加肝臟總脂中DHA水平和降低AA水平。同樣地，本研究發(fā)現(xiàn)，在n-3 PUFAs缺乏的基礎(chǔ)上，哺乳期母鼠補(bǔ)充DHA-TG和DHA-PL均會(huì)顯著提高仔鼠肝臟總脂中DHA水平，并下調(diào)AA水平，且兩種形式的DHA對(duì)肝臟的作用效果無(wú)顯著性差異，這與我們前期的研究結(jié)果相一致。

2.3 哺乳期補(bǔ)充DHA-TG和DHA-PL對(duì)仔鼠血清總脂中脂肪酸組成的影響

仔鼠血清總脂中主要脂肪酸組成如表5所示。據(jù)報(bào)道[6]，嬰兒血清中脂肪酸組成與作為膳食來(lái)源的母乳有較大關(guān)系。嬰兒早期血清中n-3 PUFAs水平可能對(duì)嬰兒晚期生長(zhǎng)具有顯著影響，早期血清中n-3 PUFAs(主要是其中的DHA)水平越高，則其在嬰兒晚期可以得到更為理想的體重指數(shù)(BMI)。由表5可知，缺乏組血清中DHA水平(1.29%±0.06%)顯著低于其他3組(P<0.01)；哺乳期干預(yù)DHA-TG和DHA-PL能夠顯著提高小鼠血清中DHA(11.54%±0.51%，11.05%±1.36%)和∑n-3 PUFAs水平；同時(shí)，AA水平分別降低了29.50%和60.21%。研究結(jié)果表明，在先天n-3 PUFAs缺乏的背景下，后天膳食補(bǔ)充DHA-TG或DHA-PL對(duì)嬰幼兒的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要作用。

表5 仔鼠血清總脂中主要脂肪酸組成

續(xù)表5

脂肪酸 充足組 缺乏組DHA-TG組DHA-PL組C20∶4n-6(AA)/%5.57±0.4813.12±0.84**a9.25±0.11b5.22±0.36cC20∶5n-3(EPA)/%4.18±0.202.19±0.07**2.51±0.121.66±0.03C22∶5n-6(DPA)/%2.23±0.111.69±0.04*2.43±0.702.00±0.42C22∶6n-3(DHA)/%7.30±0.541.29±0.06**a11.54±0.51b11.05±1.36b∑SFAs/%59.4352.4954.5255.32∑MUFAs/%7.7714.59**a6.01b8.10b∑PUFAs/%32.8032.9239.4736.58∑n-3PUFAs/%12.563.49**a18.13b13.74b∑n-6PUFAs/%20.2429.43*a21.34b22.84b∑n-6PUFAs與∑n-3PUFAs比值1.618.44**a1.18b1.66b

2.4 哺乳期補(bǔ)充DHA-TG和DHA-PL對(duì)仔鼠紅細(xì)胞總脂中脂肪酸組成的影響

仔鼠紅細(xì)胞總脂中主要脂肪酸組成如表6所示。紅細(xì)胞DHA水平往往被用作指示組織器官(如大腦)DHA狀態(tài)的指標(biāo)，目前許多研究將嬰幼兒紅細(xì)胞中脂肪酸組成作為評(píng)價(jià)孕產(chǎn)婦膳食結(jié)構(gòu)合理性的指標(biāo)[17]。由表6可知，妊娠期和哺乳期母體膳食中缺乏n-3 PUFAs能夠顯著降低仔鼠紅細(xì)胞中DHA水平(2.56%±0.05%，P<0.01)；DHA-TG和DHA-PL兩組仔鼠紅細(xì)胞中AA、∑MUFAs水平顯著低于缺乏組(P<0.05)，DHA和∑n-3 PUFAs水平顯著高于缺乏組，且DHA-PL組紅細(xì)胞中DHA水平是DHA-TG組的1.9倍，說(shuō)明妊娠期和哺乳期母體補(bǔ)充DHA-PL能夠更加顯著地增加?jì)胗變杭t細(xì)胞中DHA水平，有利于嬰幼兒大腦和其他組織的正常發(fā)育和成熟。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，DHA蓄積存在組織差異，肝臟DHA水平顯著高于腦皮質(zhì)、血清和紅細(xì)胞中DHA水平。

表6 仔鼠紅細(xì)胞總脂中主要脂肪酸組成

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)妊娠期母鼠飼喂n-3 PUFAs缺乏飼料，構(gòu)建出n-3 PUFAs缺乏小鼠模型，比較研究了DHA-TG和DHA-PL對(duì)仔鼠各組織中DHA的補(bǔ)充效果及其脂肪酸組成的影響。研究結(jié)果表明，哺乳期給予母鼠DHA-TG和DHA-PL均能夠顯著提高斷乳時(shí)仔鼠各組織中DHA水平，降低AA和DPA等n-6 PUFAs水平。與DHA-TG相比，DHA-PL對(duì)腦皮質(zhì)和紅細(xì)胞中DHA的補(bǔ)充效果更佳。本研究為孕產(chǎn)婦的膳食結(jié)構(gòu)和嬰幼兒配方奶粉中DHA的添加形式提供了有力的理論依據(jù)。

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Effect of dietary docosahexaenoic acid (DHA) in phospholipids and triglycerides on DHA level in body tissues of infant mice

WANG Dandan, WU Fang, WEN Min, WANG Jingfeng,XUE Changhu, WANG Yuming

(College of Food Science and Engineering, Ocean University of China,Qingdao 266003, Shandong, China)

The effect of dietary docosahexaenoic acid (DHA) in phospholipids and triglycerides during lactation on fatty acid composition and DHA level in body tissues of infant mice was investigated. Then-3 polyunsaturated fatty acids (n-3 PUFAs) deficient feeds were given to pregnant mice during the gestation period, after delivery the feeds would be changed inton-3 deficient (deficient group), DHA-TG (DHA-TG group) and DHA-PL (DHA-PL group) for 3 weeks until weaning. The fatty acid composition and DHA levels in total lipid of cerebral cortex, liver, serum and erythrocytes of infant mice were measured. Compared with the deficient group, the DHA andn-3 PUFAs contents in the DHA-TG and DHA-PL groups were significantly increased, docosahexaenoic acid (DPA), arachidonic acid (AA) and the ratio ofn-6 PUFAs ton-3 PUFAs were obviously decreased. The levels of DHA in total lipid of cerebral cortex and erythrocytes of infant mice in DHA-PL group were significantly higher than those in DHA-TG group, but there was no significant difference in the levels of DHA in total lipid of liver and serum. Given DHA-TG and DHA-PL during lactation could significantly improve DHA levels in infant’s body tissues, in which DHA-PL had a better effect on cerebral cortex and erythrocytes.

docosahexaenoic acid (DHA);n-3 PUFAs deficiency; infant mice; lactation

2016-10-13；

2017-03-03

國(guó)家自然科學(xué)基金(31371757)

王丹丹(1989)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)楹Ｑ蠡钚灾|(zhì)的分子營(yíng)養(yǎng)學(xué)(E-mail)2279371693@qq.com。

王玉明，教授(E-mail)wangyuming@ouc.edu.cn。

R151.2; Q547

A

1003-7969(2017)06-0065-06