金剛藤白藜蘆醇的純化及抗氧化活性研究

唐玉蓮，陳迪釗，肖小麗，鄒瓊宇

(1.中南林業(yè)科技大學材料科學與工程學院, 長沙 410004； 2.懷化學院 化學與材料工程學院，湖南 懷化418000)

油脂安全

金剛藤白藜蘆醇的純化及抗氧化活性研究

唐玉蓮1，陳迪釗2，肖小麗1，鄒瓊宇2

(1.中南林業(yè)科技大學材料科學與工程學院, 長沙 410004； 2.懷化學院 化學與材料工程學院，湖南 懷化418000)

采用超聲波輔助提取金剛藤白藜蘆醇，得到粗提物，再利用硅膠柱層析對粗提物進行純化，然后通過白藜蘆醇對油脂抗氧化及對羥基自由基、超氧陰離子自由基的清除效果，研究金剛藤白藜蘆醇的抗氧化活性。結(jié)果表明：從金剛藤中提取白藜蘆醇的得率為2.36%；金剛藤白藜蘆醇具有較強的抗油脂氧化和清除自由基的能力，當金剛藤白藜蘆醇質(zhì)量濃度為8 mg/mL時，對羥基自由基和超氧陰離子自由基的清除率分別為71.91%和75.14%；提取物經(jīng)過純化后，抗氧化活性明顯增強。

金剛藤；白藜蘆醇；純化；抗氧化活性

金剛藤是百合科菝葜屬植物菝葜(SmilaxchinaL.)的根莖，其性甘酸、平，有祛風利濕、解毒散瘀之功效，民間常用來治療風濕關(guān)節(jié)痛、跌打損傷、胃腸炎、痢疾等疾病。金剛藤的主要化學成分包括芪類、黃酮和皂苷類等成分[1]，白藜蘆醇為芪類化合物的主要成分之一[2]。已有研究表明白藜蘆醇具有抗氧化、清除自由基、降血脂等活性[3]，近年來已有不少學者對中草藥中白藜蘆醇的體外抗氧化活性進行了研究[4-8]。隨著人們對食品安全意識的加強，天然抗氧化劑因其毒性較低而逐漸引起關(guān)注，天然抗氧化劑取代合成抗氧化劑將是今后食品、藥品、化妝品行業(yè)的發(fā)展方向。因此，如何更高效地從天然植物中分離提取抗氧化劑的有效成分，以及研究各類天然抗氧化劑之間的協(xié)同增效作用等，已成為天然抗氧化劑研究刻不容緩的問題[9-11]。

為了充分利用懷化民族藥用植物資源金剛藤，并結(jié)合湖南正清制藥集團股份有限公司的生產(chǎn)工藝，嘗試利用硅膠柱層析純化金剛藤白藜蘆醇，通過金剛藤白藜蘆醇清除羥基自由基和超氧陰離子自由基的能力及抗油脂氧化的能力研究其體外抗氧化活性，為進一步研究金剛藤發(fā)揮治療作用的物質(zhì)基礎(chǔ)和開發(fā)具有保健功能的天然抗氧化劑提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

金剛藤來自湖南正清制藥集團股份有限公司，經(jīng)公司工程師宋思才鑒定為金剛藤；植物油為湖南省芷江楊家將油業(yè)有限公司生產(chǎn)(無添加劑)；白藜蘆醇標準品購于中國藥品生物制品鑒定所，反相硅膠購于青島海洋化工廠，其余試劑均為分析純，水為實驗室自制三重蒸餾水。

UV-1750型紫外可見分光光度計，LC-15C型高效液相色譜儀，RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀， GZX-9070型數(shù)顯鼓風干燥箱， FW100型粉碎機，AL204型電子分析天平，KQ-100DB型超聲波清洗機。

1.2 實驗方法

1.2.1 金剛藤白藜蘆醇的提取

金剛藤干燥后用粉碎機粉碎過50目篩，置于干燥器中備用。參照文獻[12]方法，準確稱取金剛藤粉末2.000 0 g，用20倍體積70%甲醇超聲提取40 min，抽濾，將殘渣繼續(xù)用70%甲醇提取兩次，合并濾液并旋轉(zhuǎn)蒸干，濃縮液用甲醇溶解并定容至10 mL，得白藜蘆醇粗提液(以下簡稱粗提液)，備用。

1.2.2 金剛藤白藜蘆醇的純化及含量測定

將粗提液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干，然后用50 mL石油醚-乙酸乙酯(體積比9∶1)[13]溶解。過80～120目的硅膠柱，用石油醚-乙酸乙酯(體積比 9∶1)以1 mL/min流速洗脫，得到純度較高的白藜蘆醇純化液(以下簡稱純化液)，備用。

精密稱取白藜蘆醇標準品10.0 mg，置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，得母液。分別吸取母液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，配成質(zhì)量濃度分別為20.0、40.0、60.0、80.0、100.0 μg/mL的標準品溶液。

分別吸取標準品溶液、粗提液及純化液20 μL注入高效液相色譜系統(tǒng)，檢測相應的色譜峰面積并計算白藜蘆醇的含量。色譜條件：WondaSilTMC18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相為水-甲醇(體積比4∶6)；檢測波長303 nm；流速0.8 mL/min；進樣量20 μL；柱溫為室溫。

1.2.3 金剛藤白藜蘆醇抗氧化活性測定

1.2.3.1 清除羥基自由基[14]能力

參照Fenton反應的方法建立羥基自由基產(chǎn)生體系模型[15]。反應體系中含H2O2(8.8 mmol/L)、FeSO4(9.0 mmol/L)、水楊酸-乙醇(9.0 mmol/L)各2.00 mL，以及2.00 mL不同質(zhì)量濃度的白藜蘆醇溶液，最后加H2O22.00 mL啟動反應，并用蒸餾水補充至25.00 mL，37℃水浴恒溫反應1 h，以蒸餾水為空白對照于510 nm波長下測吸光值，按下式計算羥基自由基清除率。

羥基自由基清除率=[1-(Ai-Aj)/Ao)] ×100%

式中：Ai、Aj和Ao分別為某質(zhì)量濃度白藜蘆醇、不加H2O2時該質(zhì)量濃度的本底及空白對照的吸光值。

1.2.3.2 清除超氧陰離子自由基能力

參照文獻[7,16]方法，取4.50 mL 0.05 mol/L的Tris-HCl(pH=8.2)緩沖液，加入不同質(zhì)量濃度的白藜蘆醇溶液1.00 mL及3.20 mL蒸餾水，于25℃水浴中恒溫20 min后，加入0.30 mL 3 mol/L的鄰苯三酚溶液，混合均勻，在325 nm波長處，每隔1 min測定反應體系的吸光值，共反應4 min；以吸光值A(chǔ)對反應時間t作線性關(guān)系圖，計算加樣后鄰苯三酚的自氧化速率△As；以10 mmol/L HCl代替鄰苯三酚作為對照，計算對照品溶液的自氧化速率△Ao，按下式計算超氧陰離子自由基清除率。

超氧陰離子自由基清除率=(1-△As/△Ao)×

100%

1.2.3.3 抑制植物油氧化能力

精確量取含有25.00 mg白藜蘆醇的甲醇溶液，加入到25.00 g植物油的碘量瓶中，充分攪拌配成含白藜蘆醇1.00 mg/g的母液，分別取0.00、6.00、9.00、12.00、15.00 g母液加入到盛有50.00 g植物油的錐形瓶中，即配成含白藜蘆醇0、120、180、240、300 mg/kg的樣品油試樣，并置于60℃的恒溫箱中強化保存。每隔24 h測定1次過氧化值，以不加白藜蘆醇的樣品為空白，每個樣品平行測定3次，取平均值。參照文獻[17]測量樣品溶液的過氧化值。

2 結(jié)果與討論

2.1 純化后白藜蘆醇的得率

以白藜蘆醇標準品溶液的質(zhì)量濃度對峰面積進行線性擬合，得回歸方程為Y=145 430.15X+372 576，相關(guān)系數(shù)r=0.999 0，相對標準偏差為1.95%，表明白藜蘆醇在20～100 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。根據(jù)純化液的峰面積及回歸方程計算純化后白藜蘆醇的得率為2.36%。

2.2 金剛藤白藜蘆醇的抗氧化活性

2.2.1 對羥基自由基的清除能力(見圖1)

由圖1可以看出，金剛藤白藜蘆醇對羥基自由基具有較強的清除能力，并且隨著其質(zhì)量濃度的增加，清除能力增強。粗提液經(jīng)純化后清除能力增強，在質(zhì)量濃度8 mg/mL時，純化后白藜蘆醇的羥基自由基清除率達到71.91%。

圖1 金剛藤白藜蘆醇對羥基自由基的清除能力

2.2.2 對超氧陰離子自由基的清除能力(見圖2)

圖2 金剛藤白藜蘆醇對超氧陰離子自由基的清除能力

由圖2可以看出，金剛藤白藜蘆醇對超氧陰離子自由基具有較強的清除能力，且隨著其質(zhì)量濃度的增加，清除能力增強。粗提液經(jīng)純化后，對超氧陰離子自由基的清除率明顯增強。在質(zhì)量濃度8 mg/mL時，純化后白藜蘆醇的超氧陰離子自由基清除率達到75.14%。

2.2.3 對植物油的抗氧化效果

不同添加量金剛藤白藜蘆醇對植物油的抗氧化作用如圖3所示，不同抗氧化劑對植物油的抗氧化作用如圖4所示。

圖3 不同添加量金剛藤白藜蘆醇對植物油的抗氧化作用

圖4 不同抗氧化劑對植物油的抗氧化作用

由圖3可知，添加金剛藤白藜蘆醇后，植物油的過氧化值均低于空白對照，說明金剛藤白藜蘆醇對植物油具有抗氧化作用，當添加量為240 mg/kg時，白藜蘆醇對植物油的抗氧化活性最強，作為實驗添加量。由圖4可知，金剛藤白藜蘆醇經(jīng)過純化后，對植物油的抗氧化能力相比粗提液大大提高，與VE相當，且略高于VE。

3 結(jié) 論

采用超聲波輔助提取金剛藤白藜蘆醇，再經(jīng)硅膠柱層析純化，考察白藜蘆醇對羥基自由基、超氧陰離子自由基清除作用。結(jié)果表明：經(jīng)過純化后，金剛藤白藜蘆醇對羥基自由基、超氧陰離子自由基的清除能力明顯增強，對油脂抗氧化能力大大增強。由此可知，金剛藤白藜蘆醇是一種很好的天然抗氧化劑。

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Purification of resveratrol fromSmilaxchinaL. and its antioxidant activity

TANG Yulian1, CHEN Dizhao2, XIAO Xiaoli1, ZOU Qiongyu2

(1.School of Materials Science and Engineering, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, China; 2.School of Chemistry and Materials Engineering,Huaihua University, Huaihua 418000, Hunan, China)

The crude resveratrol extract was obtained fromSmilaxchinaL. by ultrasound-assisted extraction and it was purified by silica gel column chromatography. The antioxidant activity of esveratrol was evaluated by researching the antioxidant effect of resveratrol on oil and the scavenging effect of resveratrol on superoxide anion radical and hydroxyl radical. The results showed that the yield of resveratrol extracted fromSmilaxchinaL. was 2.36%. And resveratrol fromSmilaxchinaL. had stronger antioxidant effect on oil and free radical-scavenging capacity. When the mass concentration of resveratrol fromSmilaxchinaL. was 8 mg/mL, the scavenging rates on hydroxyl radical and superoxide anion radical were 71.91% and 75.14% respectively. Moreover, the antioxidant activity of the extract improved apparently after purification.

SmilaxchinaL.; resveratrol; purification; antioxidant activity

2016-09-27；

2017-03-02

湖南省高校產(chǎn)業(yè)化培養(yǎng)項目(11CY013)

唐玉蓮(1982)，女，講師，碩士，研究方向為中藥現(xiàn)代化(E-mail)tangyulian0824@163.com。

陳迪釗，教授(E-mail)dzchen2002@163.com。

TS202.3; Q946.91

A

1003-7969(2017)06-0086-03