FABP4在妊娠期高血壓疾病胎盤滋養(yǎng)細胞免疫炎癥反應中的作用研究

毛彩艷，張 輝，李旭生，楊松昊，鄧 梅，丁 寧，吳 凱，楊曉玲，張慧萍，姜怡鄧

(寧夏醫(yī)科大學 1. 總醫(yī)院、2. 基礎醫(yī)學院、3. 臨床醫(yī)學院，寧夏 銀川 750004)

FABP4在妊娠期高血壓疾病胎盤滋養(yǎng)細胞免疫炎癥反應中的作用研究

毛彩艷2，張 輝3，李旭生1，楊松昊2，鄧 梅2，丁 寧2，吳 凱2，楊曉玲2，張慧萍1，姜怡鄧2

(寧夏醫(yī)科大學 1. 總醫(yī)院、2. 基礎醫(yī)學院、3. 臨床醫(yī)學院，寧夏 銀川 750004)

目的 探討脂肪酸結合蛋白4(fatty acid binding protein 4, FABP4)在妊娠期高血壓疾病胎盤滋養(yǎng)細胞免疫炎癥反應中的作用。方法 體外培養(yǎng)人胎盤滋養(yǎng)細胞株(HTR-8)，分別加入0、10、100、500、1 000 μmol·L-1N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)，孵育48 h后，采用ELISA檢測炎癥因子IL-6、TNF-α改變；qRT-PCR、Western blot檢測FABP4 mRNA和蛋白表達；構建FABP4腺病毒過表達載體轉染細胞后，采用100 μmol·L-1L-NAME干預，ELISA分析炎癥因子IL-6、TNF-α的變化。 結果 與對照組比較，L-NAME干預組IL-6、TNF-α及FABP4表達量明顯增高(P<0.01)；過表達FABP4組與對照組相比，炎癥因子IL-6、TNF-α明顯增加(P<0.01)。結論 FABP4參與了妊娠期高血壓疾病胎盤滋養(yǎng)細胞免疫炎癥反應的調控。

脂肪酸結合蛋白4；妊娠期高血壓疾??；滋養(yǎng)細胞；IL-6；TNF-α;N-硝基-L-精氨酸甲酯

妊娠期高血壓疾病(hypertension disorder complicating pregnancy，HDCP)是孕婦因妊娠后內環(huán)境改變而導致的以一過性血壓升高、全身小動脈痙攣等致血管內皮廣泛損傷為主要特征的嚴重危害母嬰健康的疾病，是引起孕產婦和圍生兒死亡的主要原因之一[1]。胎盤滋養(yǎng)細胞是妊娠得以建立和維持的基礎，參與局部的免疫調節(jié)[2]，在免疫調節(jié)中與其它來源的細胞因子共同發(fā)揮重要的作用，分泌集落刺激因子-Ⅰ(colony stimulating factor-Ⅰ， CSF-Ⅰ)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte macrophage-colony stimulating factor，GM-CSF)、白介素-1(interleukin-1，IL-1)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等[3]。脂肪酸結合蛋白4(fatty acid binding protein 4, FABP4)分布于各種正常組織和細胞中，其在機體炎癥、代謝及免疫等方面均具有重要的調節(jié)作用[4]。同時FABP4也是一類分子量較小，且對脂肪酸有高親和力的可溶性載體蛋白，在糖脂代謝、炎癥反應中起了重要的作用[5]。且HDCP是以血管內皮細胞受損、功能紊亂和胎盤血流灌注量減少為特征的一種妊娠期特有疾病，因此，闡明FABP4在HDCP胎盤滋養(yǎng)細胞免疫炎癥反應中的作用，將為進一步深入研究HDCP的作用機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 電泳儀、凝膠成像儀(Bio-Rad，美國)；酶標儀、熒光定量PCR儀(上海楓嶺生物技術有限公司)?？俁NA提取試劑盒(北京天根生物技術有限公司)；逆轉錄試劑盒、熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒(Fermentas公司,英國)； BCA蛋白含量檢測試劑盒(凱基生物科技發(fā)展有限公司，南京)；FABP4抗體(Abcam)；引物由上海生工公司合成；DMEM F12培養(yǎng)基、胎牛血清、100 kU·L-1青霉素和0.1 g·L-1鏈霉素(Gibco 公司)；N-硝基-L-精氨酸甲酯(N- nitro-L-arginine methylester，L-NAME)(Sigma公司)。

1.2 細胞培養(yǎng) 人胎盤滋養(yǎng)細胞株(HTR-8)購自復旦大學上海細胞庫，采用DMEM F12培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞(含10%胎牛血清、100 kU·L-1青霉素和0.1g·L-1鏈霉素)，培養(yǎng)條件為:37 ℃、5%的CO2。不同濃度的L-NAME(10、100、500、1 000 μmol·L-1) 干預48 h，收集細胞用于后續(xù)實驗。

1.3 qRT-PCR法檢測IL-6、TNF-α、FABP4 mRNA表達 按照總RNA抽提試劑盒說明書抽提總RNA。取5 μL RNA樣品進行凝膠電泳，瓊脂糖膠濃度為1.0% ，電壓為120 V，電泳15 min，利用凝膠成像系統(tǒng)檢測RNA的完整性和純度。在NCBI GenBank 數(shù)據(jù)庫中查詢IL-6、TNF-α、FABP4，利用Premier 5.0設計熒光PCR引物，IL-6的引物為上游：5′-GGTGAGTGGCTGTCTGTGTG-3′，下游：5′-TTCGGTCCAGTTGCCTTC-3′。TNF-α引物為上游：5′-AGCCCATGTTGTAGCAAACC-3′，下游:5′-GCTGGTTATCTCTCAGCTCCA-3′。FABP4引物為上游:5′-AAGAGAAAACGAGAGGATGATAAAC-3′，下游:5′-ATGCGAACTTCAGTCCAGGTC-3′。GAPDH引物為上游：5′-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3′，下游：5′-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3′。按反轉錄試劑盒說明書加入相應試劑反轉錄成cDNA，以cDNA為模板進行qRT-PCR。熒光PCR反應條件為: 95℃預變性2 min，95℃變性10 s、59℃退火30 s，72℃延長30 s，擴增40個循環(huán)。待反應結束后，結合擴增曲線及熔解曲線分析，選擇符合要求的qRT-PCR原始數(shù)據(jù)，用內參基因GAPDH 校正，結果用2-△△CT法分析。

1.4 Western blot檢測FABP4蛋白表達 收集實驗各組滋養(yǎng)細胞，提取總蛋白并定量；取30 μg總蛋白，8%分離膠和4%濃縮膠進行聚丙烯酰胺凝膠電泳；然后，將蛋白質電轉移至孔徑0.45 μm硝酸纖維素薄膜；取出含目的蛋白的膜，用含5%脫脂奶粉的PBST 封閉1 h；加入一抗(免抗FABP4，1 ∶1 000；鼠抗β-actin，1 ∶1 000)，4℃過夜；PBST 洗滌10 min，3次；再加入HRP 標記的羊抗兔或鼠二抗(均1 ∶5 000)，搖床孵育2 h；PBST 洗滌10 min，3次；用SuperSignal West Pico 化學發(fā)光底物顯影，膠片定影。圖片用Image-Pro Plus 6.0軟件進行光密度值分析，以β-actin為內參對照。

1.5 腺病毒轉染 委托上海漢恒生物公司構建FABP4腺病毒過表達載體，感染前選擇生長狀態(tài)較好的HTR-8細胞進行培養(yǎng)，吸去舊的培養(yǎng)液，PBS洗1遍，然后加入調整好滴度的腺病毒液，病毒感染2 h后，將培養(yǎng)液倒掉，加入新培養(yǎng)液3 mL，繼續(xù)培養(yǎng)，病毒感染48 h后，熒光倒置顯微鏡下觀察Ad-FABP4組綠色熒光，檢測是否轉染成功。

1.6 ELISA檢測炎癥因子的表達 設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50 μL;樣品孔中加待測樣品10 μL，再加稀釋液40 μL；除空白孔外，標準品孔和樣品孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的檢測抗體100 μL，封板膜封閉，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60 min；棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液靜置1 min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次；每孔加底物A、B各50 μL，37℃避光孵育15 min；每孔加入終止液50 μL，15 min內，450 nm波長處測定各孔的OD值。

2 結果

2.1 胎盤滋養(yǎng)細胞免疫炎癥因子IL-6、TNF-α的表達 與對照組比較，各組炎癥因子IL-6表達量隨著L-NAME劑量增大而逐漸增加(Fig 1A)，差異具有顯著性(P<0.05)；而TNF-α表達量則從100 μmol·L-1L-NAME干預組開始，隨著劑量增大呈逐漸降低的趨勢(Fig 1B)，差異具有顯著性(P<0.05)。結果提示，IL-6、TNF-α可能參與HDCP的發(fā)生過程。

Fig 1 Expression of immune inflammation factor IL-6 and TNF-α in placental trophoblast cells

A: ELISA method was used to detect the IL-6 expression level; B: TNF-α expression was detected by ELISA method.*P<0.05vscontrol

2.2 胎盤滋養(yǎng)細胞中FABP4表達 不同濃度L-NAME干預滋養(yǎng)細胞48 h后，qRT-PCR以及Western blot檢測各組細胞FABP4的mRNA、蛋白表達。Fig 2A結果顯示，100 μmol·L-1L-NAME組中FABP4 mRNA相對表達量較對照組升高了2.5倍，差異具有顯著性(P<0.01)。Fig 2B蛋白表達趨勢與FABP4 mRNA表達趨勢相一致，100 μmol·L-1L-NAME組中FABP4蛋白表達水平是對照組的2.6倍，差異具有顯著性(P<0.05)。

Fig 2 Expression of FABP4 in placental trophoblast cells

A: qRT-PCR detected the mRNA expression of FABP4; B:Western blot was used to detect the protein expression level of FABP4.*P<0.05,**P<0.01vscontrol

2.3 Ad-FABP4對滋養(yǎng)細胞炎癥因子IL-6、TNF-α表達的影響 為進一步探討FABP4在L-NAME對滋養(yǎng)細胞免疫炎癥因子表達的影響，將FABP4重組包裝的腺病毒感染HTR-8細胞48 h，熒光顯微鏡觀察，結果如Fig 3A所示，對照組中無熒光，空質粒組和重組質粒組細胞中可見綠色熒光。100 μmol·L-1L-NAME干預轉染慢病毒滋養(yǎng)細胞組48 h后，qRT-PCR以及Western blot檢測各組細胞FABP4的mRNA、蛋白表達。結果顯示，Ad-FABP4組比空質粒組FABP4 mRNA升高了5.7倍，差異具有顯著性(P<0.01)。100 μmol·L-1L-NAME干預轉染慢病毒組較Ad-FABP4組、100 μmol·L-1L-NAME組FABP4 mRNA各升高1.3倍、3.2倍(Fig 3B)，差異具有顯著性(P<0.01)。FABP4蛋白水平與FABP4 mRNA水平變化一致(Fig 3C)。為明確FABP4對妊娠高血壓胎盤滋養(yǎng)細胞炎癥因子表達的影響，ELISA法檢測各組細胞培養(yǎng)基上清中的炎癥因子IL-6、TNF-α表達。結果顯示，與FABP4表達趨勢相同(Fig 3D、3E)，差異具有顯著性(P<0.05)。提示FABP4在滋養(yǎng)細胞免疫炎癥中起了重要作用。

3 討論

胎盤是母體與胎兒間進行物質交換的器官，具有復雜的生理功能，其中胎盤滋養(yǎng)細胞是妊娠得以建立和維持的基礎，占妊娠胎盤的主要部分[6]。研究表明胎盤滋養(yǎng)細胞功能異常與HDCP 密切相關，同時研究發(fā)現(xiàn)，HDCP患者血漿NO較正常孕婦明顯下降，其下降的程度與病情嚴重程度呈正比，提示妊娠期間NO分泌不足可能是HDCP的重要致病因素之一[7]。適量的NO水平是保證子宮胎盤循環(huán)低阻、低壓、高流量的關鍵，這是機體對正常妊娠的保護性機制。L-NAME是一氧化氮合酶抑制劑，可以抑制NO的產生[8]，進而導致胎盤螺旋小動脈痙攣引起HDCP。因此，本實驗利用L-NAME干預胎盤滋養(yǎng)細胞抑制NO的合成來模擬HDCP微環(huán)境，這將有利于闡明HDCP的發(fā)病機制，為臨床防治HDCP提供實驗資料。

免疫炎癥反應是T淋巴細胞、B淋巴細胞、巨噬細胞、樹突細胞和肥大細胞的浸潤導致的炎癥過程，也是眾多免疫炎性反應的共同致病途徑。免疫細胞產生和分泌的一系列信號蛋白，如炎癥因子IL-6、TNF-α等，可以調節(jié)炎癥、免疫、造血系統(tǒng)等一系列生理活動[9]。IL-6 可通過體液和細胞免疫功能影響炎癥、宿主防御和組織損傷，是炎癥免疫反應的重要介質。TNF-α是一種對多種細胞的生長分化和功能具有抑制或刺激多重效應的細胞因子，其主要生物學活性為引起炎癥反應和抗腫瘤效應。本實驗結果顯示，炎癥因子IL-6表達量隨著L-NAME劑量增大而呈劑量依賴性；而在L-NAME干預下，TNF-α表達量增加，差異有顯著性。由于L-NAME是一氧化氮合酶抑制劑，可以改變胎盤滋養(yǎng)細胞NO的含量引起HDCP，而HDCP胎盤血流量下降，胎兒氧和營養(yǎng)物質的供應減少，使得胎兒處于急慢性缺氧狀態(tài)，可能有大量的炎性因子分泌，從而引起免疫炎癥[10]，IL-6、TNF-α表達增加。

Fig 3 Influence of Ad-FABP4 on expression of inflammatory cytokines IL-6 and TNF-α in placental trophoblast cells

A: The placental trophoblast cell transfected Ad-FABP4 lentivirus was observed under the fluorescence microscope(×40); B: qRT-PCR determined the mRNA expression of FABP4 after transfected Ad-FABP4 lentivirus; C: Western blot detected the protein expression level of FABP4 in the same condition; D, E: With overexpressed the FABP4, ELISA method was used to detect the IL-6, TNF-α expression in medium.*P<0.05vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsAd-GFP group;△P<0.05vsAd-FABP4 group.

FABP4是近年新發(fā)現(xiàn)的細胞質基質蛋白家族中的一員，因最早在成熟脂肪細胞被發(fā)現(xiàn)，故又稱脂肪型脂肪酸結合蛋白。脂肪酸結合蛋白家族包括9種高度保守的細胞質基質蛋白[11]，可逆性地與各種疏水性配體相結合。FABP4能夠調節(jié)脂肪細胞分化及糖脂代謝、調節(jié)巨噬細胞的膽固醇積聚、促進細胞的生長和分化、介導炎癥反應等[12]。本研究體外培養(yǎng)HTR-8，分別加入0、10、100、500、1 000 μmol·L-1L-NAME，孵育48 h后，檢測FABP4表達變化，發(fā)現(xiàn)隨著L-NAME濃度增大，F(xiàn)ABP4表達增加。為進一步明確FABP4在其中的作用，我們使用FABP4腺病毒過表達載體感染滋養(yǎng)細胞后發(fā)現(xiàn)，炎癥因子IL-6、TNF-α的表達也進一步增加，這提示FABP4可以促進滋養(yǎng)細胞免疫炎癥發(fā)生。目前認為在脂肪組織中免疫細胞的積累,特別是巨噬細胞的積累對于脂肪組織的炎癥反應十分重要[13]。采用巨噬細胞系和脂肪細胞系共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),脂肪細胞中FABP4的缺失將導致巨噬細胞炎性因子的表達減少[14]，這進一步佐證了FABP4在免疫炎癥中的作用。

本實驗證實了FABP4在胎盤滋養(yǎng)細胞免疫炎癥中有重要作用，F(xiàn)ABP4水平異常對于預測HDCP的發(fā)生、發(fā)展有重要意義。

(致謝：本實驗在寧夏醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院心腦血管重點實驗室完成，感謝各位老師和同學們對本課題的大力支持和指導！)

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Effect of FABP4 on placental trophoblastic immune inflammatory response in patients of hypertensive disorder complicating pregnancy

MAO Cai-yan2, ZHANG Hui3, LI Xu-sheng1, YANG Song-hao2, DENG Mei2, DING Ning2, WU Kai2, YANG Xiao-ling2, ZHANG Hui-ping1, JIANG Yi-deng2
(1.GeneralHospital, 2.DeptofPreclinicalMedicineCollege, 3.CollegeofClinicalMedicine,NingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,China)

Aim To investigate the role of fatty acid binding protein 4 (FABP4) in placental trophoblastic immune response in patients with hypertensive disorder complicating pregnancy. Methods The human placental trophoblast cell line (HTR-8) was culturedinvitroand incubated with L-NAME for 0, 10, 100, 500 and 1 000 μmol·L-1for 48 h. The levels of IL-6 and TNF-α were analysed by ELISA. The mRNA and protein expression levels of FABP4 were detected by Western blot and qRT-PCR. The cells transfected FABP4 adenovirus expression vector were intervented with 100 μmol·L-1L-NAME. Then, the levels of IL-6 and TNF-α were determined by ELISA. Results Com-pared with the control group, the expression levels of IL-6, TNF-α and FABP4 were significantly increased in the intervention group (P<0.01). Meanwhile, the expression levels of IL-6 and TNF-α were significantly increased in the overexpressed FABP4 group, compared with the control group (P<0.01). Conclusion FABP4 is involved in regulating the trophoblastic immune-inflammatory response in patients of hypertensive disorder complicating pregnancy.

fatty acid binding protein 4; hypertensive disorder of pregnancy; trophoblast; IL-6; TNF-α; N-nitro-L-arginine methylester

2017-04-14,

2017-05-14

國家自然科學基金資助項目(No 81570452，81660258)；寧夏高等學校科學研究項目(No NGY2016129，NGY2016086)

毛彩艷(1989-)，女，碩士生，研究方向：心血管病理生理學，E-mail:996106124@qq.com； 張慧萍(1975-)，女，主任醫(yī)師，碩士生導師，研究方向：圍生醫(yī)學，通訊作者，Tel：0951-6980046，E-mail :zhp19760820@163.com； 姜怡鄧(1974-)，男，博士，教授，博士生導師，研究方向：心血管病理生理學，通訊作者，Tel：0951-6980998，E-mail: jwcjyd@163.com

時間：2017-7-7 11:05 網(wǎng)絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170707.1104.034.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.08.017

A

1001-1978(2017)08-1126-06

R321.4；R392.12；R544.1；R714.252；R714.56；R977.6