氫溴酸樟柳堿對(duì)抗大鼠急性腦缺血/再灌注損傷的作用機(jī)制研究

陳丹丹，彭 成，萬(wàn) 峰，劉 莟，敖 慧，謝曉芳

(1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137；2. 雅安職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)檢驗(yàn)系，四川 雅安 625000；3. 中藥資源系統(tǒng)研究與開(kāi)發(fā)利用省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川 成都 611137；4. 成都第一制藥有限公司，四川 成都 610031)

氫溴酸樟柳堿對(duì)抗大鼠急性腦缺血/再灌注損傷的作用機(jī)制研究

陳丹丹1, 2，彭 成1, 3，萬(wàn) 峰4，劉 莟1，敖 慧1，謝曉芳1, 3

(1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137；2. 雅安職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)檢驗(yàn)系，四川 雅安 625000；3. 中藥資源系統(tǒng)研究與開(kāi)發(fā)利用省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川 成都 611137；4. 成都第一制藥有限公司，四川 成都 610031)

目的 探討氫溴酸樟柳堿對(duì)抗大鼠急性腦缺血/再灌注損傷的作用機(jī)制。方法 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)采用線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)致腦缺血/再灌注損傷模型，氫溴酸樟柳堿尾靜脈注射進(jìn)行干預(yù)。HE染色評(píng)價(jià)腦組織一般病理學(xué)情況；尼氏染色評(píng)價(jià)腦組織健存神經(jīng)元情況；檢測(cè)腦組織勻漿過(guò)氧化氫酶(CAT)活性、脂質(zhì)過(guò)氧化物(LPO)含量、乳酸脫氫酶(LDH)活性；采用Western blot技術(shù)檢測(cè)腦組織Bax、Bcl-2、caspase-3、p-Akt等蛋白的表達(dá)。體外實(shí)驗(yàn)采用PC12細(xì)胞氧糖剝奪再灌注損傷模型(OGD-R)， 采用Western blot技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Bax、Bcl-2、caspase-3、p-Akt等蛋白的表達(dá)情況，對(duì)氫溴酸樟柳堿作用的信號(hào)通路進(jìn)行確認(rèn)。結(jié)果 氫溴酸樟柳堿0.15 mg·kg-1能明顯降低MCAO模型大鼠一般病理學(xué)評(píng)分，提高存活神經(jīng)元數(shù)目；氫溴酸樟柳堿0.3、0.15 mg·kg-1能明顯提高腦組織CAT活性，氫溴酸樟柳堿0.3 mg·kg-1能明顯降低LPO含量；氫溴酸樟柳堿1.2 mg·kg-1明顯降低LDH活性；各劑量組均能明顯降低促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，提高Bcl-2/Bax比值，促進(jìn)p-Akt表達(dá)，明顯提高p-Akt/Akt比值，除氫溴酸樟柳堿0.15 mg·kg-1劑量外，其余劑量均能明顯提高抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，氫溴酸樟柳堿在25～100 μmol·L-1時(shí)能明顯提高Bcl-2蛋白的表達(dá)，提高Bcl-2/Bax比值，在50 μmol·L-1劑量下能明顯提高p-Akt/Akt的比值。結(jié)論 氫溴酸樟柳堿對(duì)抗急性腦缺血/再灌注損傷大鼠的作用機(jī)制與抗氧化損傷及提高p-Akt的表達(dá)有關(guān)。

氫溴酸樟柳堿；腦缺血/再灌注；HE染色；尼氏染色；氧化應(yīng)激；p-Akt

缺血性腦卒中是最常見(jiàn)的卒中類型，是由于腦部血液供應(yīng)障礙，缺血、缺氧引起的局限性腦組織的缺血性壞死或腦軟化。臨床上該病具有發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高等特點(diǎn)。藥物治療是目前腦卒中的主要治療方式之一，而其中溶栓治療又是缺血性腦卒中急性期采取的最有效的措施之一。但是，由于溶栓治療時(shí)間窗的限制(如病人就診較晚、診斷延遲、或者醫(yī)生未當(dāng)機(jī)立斷等)導(dǎo)致目前急性缺血性腦卒中作溶栓治療的比例還很低。因此，需要積極探索更多行之有效的治療腦卒中的藥物。

近年來(lái)，莨菪烷類生物堿對(duì)抗腦缺血/再灌注的研究比較活躍[1-2]，但是其抗缺血性腦卒中的分子機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。樟柳堿是從茄科植物唐古特山莨菪的根中所提取出的一種莨菪烷類生物堿，氫溴酸樟柳堿(anisodine hydrobromide，AH)為其氫溴酸鹽。20世紀(jì)90年代，Xu等[3]就對(duì)其抗大鼠腦缺血/再灌注損傷進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，樟柳堿可使急性腦缺血/再灌注大鼠異常升高的前腦鈣含量和伊文思藍(lán)含量明顯降低，減少腦組織水腫。基于目前的研究現(xiàn)狀，本研究采用線栓法建立大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)致腦缺血/再灌注損傷模型，擬從一般病理學(xué)形態(tài)、神經(jīng)元存活情況、生化指標(biāo)以及PI3K/Akt信號(hào)通路等方面來(lái)探索AH抗缺血性腦卒中的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞 SD大鼠，SPF級(jí)，♂，體質(zhì)量(300±20)g，購(gòu)自四川省中醫(yī)藥科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK(川)2013-19。大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞(pheochromocytoma cells，PC12 cells)購(gòu)于江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 藥品與試劑 原料藥AH由成都第一藥業(yè)有限公司提供，生產(chǎn)批號(hào)140903，使用時(shí)超純水充分溶解并過(guò)0.22 μm微孔濾膜備用。尼莫地平(nimodipine，Nim)注射液，由拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司生產(chǎn)，批號(hào)BXGVZ71；丁苯酞(n-butylphthalide，NBP)氯化鈉注射液，石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司，批號(hào)：618160320；DMEM高糖培養(yǎng)基、DMEM無(wú)糖培養(yǎng)基(Gibco公司)；小牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)；連二亞硫酸鈉(分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；水合氯醛(成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)2015090602)；脂質(zhì)過(guò)氧化物(lipid peroxidation，LPO)測(cè)試盒(批號(hào)：20160413)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)測(cè)定試劑盒(批號(hào)：20160413)、過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)測(cè)試盒(批號(hào)：20160414)、蛋白定量測(cè)試盒(批號(hào)：20160407)，均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；兔抗Bcl-2抗體、Bax抗體、Akt抗體(Abcam公司)；兔抗p-Akt抗體、caspase-3 抗體(Cell Signaling公司)；兔抗GAPDH抗體(博士德生物公司)；鼠抗β-actin抗體、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG、HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG，均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器 Enspire多標(biāo)記微孔板檢測(cè)儀(珀金埃爾默新加坡有限公司)；TDZ4A-WS臺(tái)式低速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開(kāi)發(fā)有限公司)；FA2004B型電子天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司)；EPED-E2-30TJ實(shí)驗(yàn)室級(jí)超純水器(南京易普達(dá)科技發(fā)展有限公司)；1384 型超凈工作臺(tái)、3111型CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；BA400Digital數(shù)碼三目攝像顯微鏡(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)；GS-900校準(zhǔn)型光密度計(jì)、電泳槽/電轉(zhuǎn)移槽/電源(美國(guó)Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 大鼠MCAO模型的復(fù)制 采用線栓法制備急性大鼠腦缺血/再灌注模型，具體方法在參考文獻(xiàn)[4]方法的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)：術(shù)前大鼠禁食12 h，自由飲水，手術(shù)過(guò)程中用10%水合氯醛0.3 g·kg-1腹腔注射麻醉。待大鼠翻正反射消失后，取仰臥位固定，剪去頸部被毛，消毒，正中切口。于氣管左側(cè)找到頸總動(dòng)脈(common carotid artery，CCA)，結(jié)扎CCA近心端、遠(yuǎn)心端被線，再分離頸外動(dòng)脈(external carotid artery，ECA)和頸內(nèi)動(dòng)脈(internal carotid artery，ICA)，結(jié)扎ECA，在ICA遠(yuǎn)端放置動(dòng)脈夾，CCA切口，近心端距分叉處 4 mm切口插入直徑為 0.285 mm、頭端打磨光滑的魚(yú)線，直視下進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈，插入長(zhǎng)度約為 20 mm，完全阻斷其對(duì)大腦中動(dòng)脈的供血，固定栓線。缺血2 h后再灌注時(shí)，輕柔回抽魚(yú)線約10 mm。術(shù)中和術(shù)后保持室溫 25℃左右，同時(shí)白熾燈照動(dòng)物使其肛溫維持在(37±1)℃，直到動(dòng)物恢復(fù)活動(dòng)。假手術(shù)組動(dòng)物除不插入魚(yú)線外，其余操作同模型動(dòng)物。

2.2 動(dòng)物分組與給藥 手術(shù)動(dòng)物術(shù)后按照Longa等[4]的5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級(jí)評(píng)分：0分，無(wú)明顯神經(jīng)損傷癥狀；1分，不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪；2分，向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分，向?qū)?cè)傾倒；4分，不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。評(píng)分為1～3分者入選本次實(shí)驗(yàn)，其余評(píng)分動(dòng)物剔除。本次實(shí)驗(yàn)造模成功率約50%，將復(fù)制成功的模型動(dòng)物隨機(jī)分為MCAO模型組，Nim組和AH 1.2、0.6、0.3、0.15 mg·kg-14個(gè)劑量組。再灌注時(shí)假手術(shù)組注射生理鹽水，Nim組注射尼莫地平注射液1 mg·kg-1，AH各劑量組對(duì)應(yīng)尾靜脈注射AH 1.2、0.6、0.3、0.15 mg·kg-1，再灌注6 h同法進(jìn)行第2次給藥，共計(jì)給藥2次。

2.3 PC12細(xì)胞的培養(yǎng)及氧糖剝奪再灌注(oxygen and glucose deprivation -reperfusion, OGD-R)模型的復(fù)制 PC12 細(xì)胞用含10%小牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)顯微鏡下觀察到細(xì)胞覆蓋瓶底約達(dá)70%～80%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化離心，完全培養(yǎng)基重懸，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為2×108·L-1接種于60 cm培養(yǎng)皿中，設(shè)空白對(duì)照組(control group，control)、OGD-R組、NBP陽(yáng)性對(duì)照組、AH 100、50、25 μmol·L-1組。于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄上清，用PBS 清洗2次；除空白對(duì)照組加入無(wú)血清的高糖DMEM 培養(yǎng)液2 mL外，其余各組加入含有8 mmol·L-1連二亞硫酸鈉的無(wú)糖DMEM培養(yǎng)液2 mL，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h，棄原液，用PBS清洗2次?？瞻讓?duì)照組和模型組分別加入含10%小牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)液2 mL，AH各組及陽(yáng)性對(duì)照組分別加入培養(yǎng)基含終濃度分別為100、50、25 μmol·L-1AH及130 μmol·L-1NBP，復(fù)糖復(fù)氧2 h[5]。

2.4 大鼠腦組織蘇木精伊紅(HE)染色和尼氏染色 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后水合氯醛麻醉動(dòng)物，斷頭處死，迅速選取缺血側(cè)視交叉附近約1 mm厚度冠狀切片腦組織，10%甲醛溶液固定，按照常規(guī)HE和尼氏染色實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行染色。HE染色腦組織病理評(píng)分按以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行量化：光鏡下未見(jiàn)病變?cè)u(píng)分為0分； 光鏡下若見(jiàn)小灶性灰、白質(zhì)輕度水腫，細(xì)胞溶解，灶性少許細(xì)胞增生(增生細(xì)胞主要為膠質(zhì)細(xì)胞)，少許炎細(xì)胞浸潤(rùn)，輕度灰質(zhì)萎縮等病理表現(xiàn)評(píng)分為1分；光鏡下若見(jiàn)多灶性灰、白質(zhì)水腫，細(xì)胞溶解、變性、壞死，灶性較多細(xì)胞增生(增生細(xì)胞主要為膠質(zhì)細(xì)胞)，較多炎細(xì)胞浸潤(rùn)等病理表現(xiàn)評(píng)分為2分；光鏡下若見(jiàn)彌漫性灰、白質(zhì)水腫，細(xì)胞溶解、變性、壞死，灶性大量細(xì)胞增生(增生細(xì)胞主要為膠質(zhì)細(xì)胞)，大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)等病理表現(xiàn)評(píng)分為3分。尼氏染色每個(gè)腦組織均選取3個(gè)視野400倍鏡下觀察，計(jì)數(shù)神經(jīng)元，每個(gè)視野計(jì)數(shù)后取均值作為該樣本的細(xì)胞密度。

2.5 腦組織生化指標(biāo)的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后水合氯醛麻醉動(dòng)物，斷頭處死，每只大鼠取缺血側(cè)視交叉附近冠狀切片腦組織約100 mg，按1 ∶9(W/V)加入冰冷生理鹽水，制成 10%的腦組織勻漿。將勻漿液3 000 r·min-1離心15 min，取上清液， -80℃超低溫冰箱保存待測(cè)。按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定腦組織勻漿LDH、CAT活性以及LPO含量。

2.6 腦組織Bcl-2、Bax、caspase-3、p-Akt以及Akt蛋白表達(dá)的測(cè)定 斷頭處死動(dòng)物后，每組隨機(jī)選取3只大鼠，取缺血側(cè)半暗帶附近固定解剖部位腦組織約50 mg，加入含蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液(W ∶V=1 ∶10)提取腦組織蛋白，用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白含量的測(cè)量。按10 μL蛋白樣品/泳道上樣，行SDS-PAGE電泳，然后電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用脫脂奶粉封閉2 h，進(jìn)行一抗孵育，用TBST洗膜，10 min × 3次，將PVDF膜放入稀釋好的Bcl-2、Bax、caspase -3、p-Akt、Akt、β-actin及GAPDH (1∶1 000 稀釋)一抗中，4 ℃封閉過(guò)夜；TBST 洗膜3次后，將PVDF 膜放入HRP標(biāo)記的二抗中(1 ∶5 000)，37℃孵育1 h；TBST 洗膜后，暗室中加ECL發(fā)光液并進(jìn)行曝光、顯影、定影，利用BIO-RAD GS-900校準(zhǔn)型光密度計(jì)掃描X線膠片，采用Image-lab圖像處理軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.7 PC12細(xì)胞Bcl-2、Bax、caspase-3、p-Akt以及Akt蛋白表達(dá)的測(cè)定 藥物作用結(jié)束后，收集細(xì)胞，蛋白裂解液裂解，測(cè)定蛋白含量，按20μL蛋白樣品/泳道上樣，其余操作同“2.6”。

3 結(jié)果

3.1 HE染色 由Fig 1可見(jiàn)，假手術(shù)組動(dòng)物腦皮層、白質(zhì)區(qū)域?qū)哟吻宄?，?xì)胞排列整齊有序，形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，染色清晰。與假手術(shù)組相比，模型組動(dòng)物腦皮層白質(zhì)區(qū)域細(xì)胞可見(jiàn)彌漫性不同程度的水腫，部分細(xì)胞變性、壞死，皮質(zhì)顆粒層細(xì)胞排列紊亂，可見(jiàn)數(shù)量不等的膠質(zhì)細(xì)胞增生，神經(jīng)纖維排列紊亂，呈網(wǎng)狀和條索狀，病理評(píng)分明顯增加(P<0.01)；與模型組相比，AH 0.15 mg·kg-1劑量組能明顯減輕病理改變，評(píng)分明顯降低(P<0.01)，AH其他劑量組與模型組比較也有降低病理評(píng)分的趨勢(shì)(Tab 1)。

Fig 1 HE staining of brain tissue in all groups (×400)

A: Sham group; B: MCAO group; C: Nim group; D: AH 1.2 mg·kg-1group; E: AH 0.6 mg·kg-1group; F: AH 0.3 mg·kg-1group; G: AH 0.15 mg·kg-1group

Tab 1 Effects of anisodine hydrobromide on morphological changes of MCAO model rats(±s,n=8)

##P<0.01vssham;**P<0.01 vs MCAO

3.2 神經(jīng)元存活情況 Fig 2結(jié)果顯示，假手術(shù)組神經(jīng)元細(xì)胞排列整齊致密，胞體較大，胞質(zhì)藍(lán)染，尼氏體豐富；模型組細(xì)胞排列疏松，核仁消失，出現(xiàn)空泡樣變性，尼氏體明顯減少， 大量細(xì)胞脫失，存活細(xì)胞減少，與假手術(shù)組比較差異有顯著性(P<0.01)；陽(yáng)性藥物Nim和AH 0.15 mg·kg-1可明顯提高大鼠腦組織存活神經(jīng)元數(shù)目(P<0.05或P<0.01)；AH其他劑量組也表現(xiàn)出提高腦組織存活神經(jīng)元數(shù)目的趨勢(shì)(Tab 2)。

3.3 AH對(duì)MCAO大鼠腦組織LPO含量、CAT及 LDH活性的影響 由Tab 3可知，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織LPO含量明顯增加(P<0.05)，CAT活性明顯降低(P<0.05)，腦組織LDH活性明顯增加(P<0.05)；AH 0.3 mg·kg-1劑量組能明顯降低模型大鼠腦組織LPO含量和明顯提升腦組織CAT含量，與模型組比較差異有顯著性(P<0.05或P<0.01)；AH 0.15 mg·kg-1劑量組能明顯升高腦組織CAT含量，與模型組比較差異有顯著性(P<0.05)。AH 1.2 mg·kg-1劑量組能明顯降低模型大鼠腦組織LDH含量，與模型組比較差異有顯著性(P<0.05)。

Fig 2 Nissl staining of all groups(×400)

A: Sham group; B: MCAO group; C: Nim group; D: AH 1.2 mg·kg-1group; E: AH 0.6 mg·kg-1group; F: AH 0.3 mg·kg-1group; G: AH 0.15 mg·kg-1group

Tab 2 Effects of anisodine hydrobromide on number of surviving neurons of MCAO model rats(±s,n=8)

##P<0.01vssham；*P<0.05，**P<0.01vsMCAO

3.4 AH對(duì)MCAO大鼠腦組織Bax、Bcl-2、caspase-3及p-Akt表達(dá)的影響 如Fig 3、Tab 4所示，模型動(dòng)物腦組織Bax、Bcl-2、caspase-3及p-Akt的表達(dá)均明顯升高，與假手術(shù)組比較差異有顯著性(P<0.01)；與模型組相比，AH各劑量組均可明顯降低Bax的表達(dá)(P<0.01)，與此同時(shí)AH各劑量組均可調(diào)高Bcl-2/Bax、p-Akt/Akt的比值(P<0.05或P<0.01)；AH在0.3～1.2 mg·kg-1劑量下可明顯提高Bcl-2的表達(dá)(P<0.01)，在0.3～0.6 mg·kg-1劑量下可明顯降低caspase-3的表達(dá)(P<0.05或P<0.01)。

Tab 3 Effects of anisodine hydrobromide on contents of LPO and activities of CAT， LDH in brain tissue of

#P<0.05vssham；*P<0.05，**P<0.01vsMCAO

Fig 3 Expression of Bax, Bcl-2, p-Akt, Akt and caspase-3 protein expression in all rats

1:Sham group;2:MCAO group;3:Nim group;4:AH 1.2 mg·kg-1;5: AH 0.6 mg·kg-1;6:AH 0.3 mg·kg-1;7:AH 0.15 mg·kg-1

3.5 AH對(duì)PC12細(xì)胞OGD-R模型Bax、Bcl-2、caspase-3及p-Akt表達(dá)的影響 如Fig 4、Tab 5所示，PC12細(xì)胞OGD-R后抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表達(dá)有所提升，與空白對(duì)照組相比差異有顯著性(P<0.01)，而促凋亡蛋白Bax及caspase-3的表達(dá)也有升高趨勢(shì)；與模型組相比，AH各劑量組均可明顯提高Bcl-2的表達(dá)(P<0.01)，也表現(xiàn)出降低Bax表達(dá)的趨勢(shì)；AH在較低劑量25～50 μmol·L-1表現(xiàn)出降低caspase-3表達(dá)的趨勢(shì)。同時(shí)，與空白對(duì)照組相比，模型組Bcl-2/Bax比值有明顯提升(P<0.05)，而與模型組相比，AH各劑量組均可明顯提高Bcl-2/Bax比值(P<0.01)；在PC12細(xì)胞OGD-R模型中，p-Akt表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)，與模型組相比，AH在50 μmol·L-1劑量下可明顯提高p-Akt/Akt比值(P<0.01)。

Fig 4 Expression of Bax, Bcl-2, p-Akt, Akt and caspase-3 protein in PC12 cells

1:Contol group；2: OGD-R group；3: NBP group；4: AH 100 μmol·L-1；5: AH 50 μmol·L-1；6: AH 25 μmol·L-1

4 討論

缺血性腦卒中是腦卒中的主要類型，也是腦卒中死亡的首要原因，其高致殘率為患者家庭和社會(huì)帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。研究資料顯示，缺血性腦卒中是由多因素、多環(huán)節(jié)損傷所致的動(dòng)態(tài)復(fù)雜的疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其公認(rèn)的主要機(jī)制之一為氧化應(yīng)激[6]。而報(bào)道顯示，抗氧化損傷為莨菪烷類藥物抗缺血/再灌注損傷的重要機(jī)制[7]。LPO在體內(nèi)水平的高低反映了體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的速率，CAT是機(jī)體內(nèi)源性抗過(guò)氧化損傷的主要酶系[8]。本研究結(jié)果顯示，模型動(dòng)物腦組織CAT活性明顯降低， LPO含量明顯增加，而AH在較低劑量(0.3 mg·kg-1)以下，可明顯提高M(jìn)CAO大鼠腦組織CAT活性，減少LPO含量。LDH是腦血管疾病時(shí)腦組織損害最敏感的酶[9]，本研究中模型動(dòng)物L(fēng)DH活性明顯增加，AH在大劑量時(shí)(1.2 mg·kg-1)時(shí)能明顯降低模型大鼠腦組織LDH活性，表明AH對(duì)抗缺血/再灌注損傷的作用機(jī)制與其抗自由基過(guò)氧化有關(guān)。

尼氏小體是神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的一種正常結(jié)構(gòu)，它由大量平行排列的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和夾雜其間的核糖核蛋白體組成，是細(xì)胞內(nèi)的一種蛋白質(zhì)合成裝置，可作為觀察神經(jīng)元細(xì)胞功能狀態(tài)的指標(biāo)[10]。本研究中，模型動(dòng)物大量神經(jīng)元丟失，尼氏體明顯減少,氫溴酸各劑量組對(duì)神經(jīng)元的存活情況都有一定程度的改善，尤以小劑量(0.15 mg·kg-1)效果明顯。

Bcl-2、Bax基因是目前已知的在凋亡調(diào)控過(guò)程中功能相互對(duì)立的一對(duì)最重要的調(diào)控基因。研究資料顯示，細(xì)胞內(nèi)這兩種對(duì)立蛋白的比率關(guān)系是決定細(xì)胞存亡的關(guān)鍵。當(dāng)Bcl-2高表達(dá)時(shí)，對(duì)抗細(xì)胞凋亡，反之，細(xì)胞對(duì)死亡信號(hào)的反應(yīng)性增強(qiáng)，啟動(dòng)凋亡。而caspase 家族成員中的caspase-3在細(xì)胞凋亡過(guò)程中占據(jù)核心地位，被稱為“死亡執(zhí)行蛋白酶”[11]。本研究中，MCAO模型動(dòng)物腦組織Bax、Bcl-2及caspase-3水平明顯升高，AH各劑量組能明顯降低促凋亡基因Bax及凋亡執(zhí)行者caspase-3的表達(dá)，提升Bcl-2及Bcl-2/Bax水平，表明AH能對(duì)抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

Tab 4 Effects of anisodine hydrobromide on expression of Bax, Bcl-2, caspase-3 and p-Akt protein in brain tissue of MCAO model rats(±s,n=3)

##P<0.01vssham；*P<0.05，**P<0.01vsMCAO

Tab 5 Effects of anisodine hydrobromide on Bax, Bcl-2, caspase-3 and p-Akt protein expression in PC12 cells of OGD-R model

#P<0.05,##P<0.01vssham；*P<0.05，**P<0.01vsMCAO

PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是重要的細(xì)胞存活通路，其中發(fā)揮作用的是Akt。盡管目前的文獻(xiàn)報(bào)道，動(dòng)物腦缺血/再灌注模型和PC12細(xì)胞OGD-R模型中p-Akt的表達(dá)強(qiáng)弱較正常組尚存爭(zhēng)議，但是p-Akt表達(dá)的增強(qiáng)可發(fā)揮抗凋亡作用是得到公認(rèn)的[12-16]。激活的Akt 可以通過(guò)磷酸化Bad、caspase-9、Forkhead、NF-κB、GSK-3β等抑制細(xì)胞凋亡[17-18]。本研究中，AH各劑量組均能明顯提高M(jìn)CAO大鼠p-Akt的表達(dá)，表明AH對(duì)抗細(xì)胞凋亡與激活A(yù)kt有關(guān)。

PC12細(xì)胞在神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)及信號(hào)通路的研究中被廣泛應(yīng)用，而氧糖剝奪模型也是國(guó)際公認(rèn)的研究腦缺血的經(jīng)典模型[19]。本實(shí)驗(yàn)的體外研究中，AH能明顯提高PC12細(xì)胞OGD-R模型Bcl-2及p-Akt的表達(dá)，同時(shí)能明顯提高Bcl-2/Bax比率，在蛋白表達(dá)的調(diào)控上表現(xiàn)出了與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相近的作用趨勢(shì)。這也從另一個(gè)角度確證了提高p-Akt蛋白的表達(dá)是AH抗凋亡的作用機(jī)制之一。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，AH在不同劑量下均可對(duì)大腦缺血/再灌注損傷不同指標(biāo)作出一定程度的改善。但是由于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)個(gè)體差異大，加之缺血性腦卒中發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，在本研究所采取的各方面評(píng)價(jià)指標(biāo)中，藥物未顯示出良好的量效關(guān)系，但是綜合各方面指標(biāo)分析，藥物在較小劑量時(shí)療效相對(duì)較好，這與早期Xu等[3]的報(bào)道基本吻合。本研究的不足之處為在PI3K/Akt信號(hào)通路中只研究了Akt的表達(dá)，缺乏對(duì)其下游或上游相關(guān)蛋白的進(jìn)一步探討，這些都是本課題下一步值得探討的問(wèn)題。

(致謝: 本實(shí)驗(yàn)完成于成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源系統(tǒng)研究與開(kāi)發(fā)利用省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中得到該實(shí)驗(yàn)室全體老師的指導(dǎo)及同學(xué)的協(xié)助，在此表示感謝。同時(shí)感謝成都第一制藥有限公司給予本實(shí)驗(yàn)的大力支持。)

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The protective mechanism of anisodine hydrobromide against cerebral ischemia-reperfusion injury in rats

CHEN Dan-dan1,2， PENG Cheng1,3, WAN Feng4， LIU Han1, AO Hui1, XIE Xiao-fang1,3
(1.CollegeofPharmacy,ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine,Chengdu611137，China; 2.DeptofPharmacyandExamination,Ya’anPolytechnicalColledge,Ya’anSichuan625000,China; 3.StateKeyLabBreedingBaseofSystematicResearch,DevelopmentandUtilizationofChineseMedicineResources,SichuanProvinceandMinistryofScienceandTechnology,Chengdu611137,China; 4.ChengduNo.1PharmaceuticalCoLtd.,Chengdu610031,China)

Aim To investigate the protective mechanism of anisodine hydrobromide against cerebral ischemia-reperfusion injury in rats. MethodsInvivo: the cerebral ischemia-reperfusion injury model was established by middle cerebral artery occlusion (MCAO) via suture method in rats; the rats were injected anisodine hydrobromide(1.2, 0.6, 0.3, 0.15 mg·kg-1); the morphological changes were detected by HE staining; the Nissl staining was used to count the number of surviving neurons; the activity of CAT and LDH, the LPO contents in the brain tissue were measured; the expressions of Bax, Bcl-2, caspase-3 and p-Akt in brain tissue were detected by Western blot.Invitro: Western blot assay was used to determine the expression of Bax, Bcl-2, caspase-3 and p-Akt protein expression in the OGD-R model of PC12 cells. The signal pathway of anisodine hydrobromide was identified. Results Anisodine hydrobromide with the dose of 0.15 mg·kg-1could significantly lessen the morphological changes, and improve the number of surviving neurons; the dose of 0.3 and 0.15 mg·kg-1could significantly improve the activity of CAT; the dose of 0.3 mg·kg-1could significantly reduce the contents of LPO in the rat brain tissue; the dose of 1.2 mg·kg-1could significantly decrease the activity of LDH; the dose of 0.15 ～1.2 mg·kg-1could inhibit the expression of Bax, promote the expression of p-Akt in rat brain tissue. All the doses except 0.15 mg·kg-1could promote the expression of Bcl-2 in rat brain tissue.Invitro, the results showed that anisodine hydrobromide in 25～100 μmol·L-1could significantly improve the expression of Bcl-2 and the ratio of Bcl-2/Bax, and the dose of 50 μmol·L-1could significantly improve the ratio of p-Akt/Akt. Conclusion The mechanism of anisodine hydrobromide against cerebral ischemia-reperfusion injury model rats might be related to its anti-oxidative activity and the activation of Akt.

anisodine hydrobromid; cerebral ischemia-reperfusion; HE staining; Nissl staining; oxidative stress; p-Akt

2017-05-04,

2017-06-07

四川省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(No 2016SZ0027)

陳丹丹(1986-)，女，博士生，講師，研究方向：疾病動(dòng)物模型與中藥復(fù)方藥理學(xué)，E-mail:chendandan619@126.com； 謝曉芳( 1983-)，女，博士，副研究員，研究方向:中藥藥理學(xué)與毒理學(xué)，通訊作者，E-mail: xxf14544@163.com

時(shí)間：2017-7-7 11:04 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170707.1104.024.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.08.012

A

1001-1978(2017)08-1096-07

R-332；R284.1；R322.81；R743.310.22；R977.3；R977.6