腺病毒介導(dǎo)心臟特異性過表達(dá)RIP140對(duì)大鼠心臟功能及炎癥通路的影響

陳艷芳，張鑾坤，王若倫，劉培慶

(1. 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 廣州 510260；2. 中山大學(xué)腫瘤防治中心藥學(xué)部，廣東 廣州 510060；3. 中山大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

腺病毒介導(dǎo)心臟特異性過表達(dá)RIP140對(duì)大鼠心臟功能及炎癥通路的影響

陳艷芳1，張鑾坤2，王若倫1，劉培慶3

(1. 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 廣州 510260；2. 中山大學(xué)腫瘤防治中心藥學(xué)部，廣東 廣州 510060；3. 中山大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

目的 探討心臟組織特異性過表達(dá)受體相互作用蛋白140(receptor interacting protein 140，RIP140)對(duì)心臟功能及炎癥通路的影響。方法 大鼠心臟組織多點(diǎn)注射攜帶RIP140基因的腺病毒載體，使心肌組織過表達(dá)RIP140；免疫熒光驗(yàn)證RIP140蛋白在心臟組織中的過表達(dá)情況；超聲心動(dòng)圖與血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)評(píng)估心臟功能；ELISA分析TNF-α、IL-2、IL-1β等炎癥因子水平；Western blot分析p65、IκB-α的蛋白水平。結(jié)果 腺病毒載體介導(dǎo)的外源基因RIP140可成功過表達(dá)于心臟組織，誘導(dǎo)心室擴(kuò)張、左室射血分?jǐn)?shù)下降、心功能受損，促進(jìn)心肌組織TNF-α、IL-2、IL-1β炎癥因子釋放，p65蛋白入核、胞質(zhì)IκB-α蛋白降解。結(jié)論 腺病毒介導(dǎo)RIP140基因在心臟組織中的特異性過表達(dá)損傷心臟功能，激活NF-κB/p65炎癥通路，促進(jìn)炎癥因子釋放。

RIP140；炎癥因子；NF-κB；心臟組織；腺病毒；能量代謝

受體相互作用蛋白140(receptor interacting protein 140，RIP140)與過氧化物酶體增殖物受體γ共激活因子1α( PPARγ coactivator-1α，PGC-1α)為轉(zhuǎn)錄調(diào)控輔助因子，在能量代謝旺盛的心臟中，通過調(diào)控線粒體能量代謝途徑的關(guān)鍵酶及基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)心肌能量代謝平衡，維持心臟的正常形態(tài)及功能。代謝紊亂與炎癥反應(yīng)是心肌肥大、心力衰竭等心血管疾病發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制。越來越多的研究表明[1]，心臟能量代謝紊亂與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，高脂飲食喂養(yǎng)的肥胖小鼠心臟表現(xiàn)糖代謝減少、炎癥因子水平升高。心肌細(xì)胞中，激活核受體NF-κB可增加p65與PGC-1α的直接相互作用，抑制PDK4的表達(dá)，導(dǎo)致葡萄糖代謝的增加[2-3]。RIP140與PGC-1α共定位于細(xì)胞核中，在調(diào)控心肌能量代謝中有共同的下游靶基因，RIP140是否也與心肌NF-κB炎癥通路密切相關(guān)，有待進(jìn)一步證明。本研究通過心肌多點(diǎn)注射攜帶RIP140基因的腺病毒載體，誘導(dǎo)RIP140在心肌組織中的特異性過表達(dá)，探討其對(duì)心臟功能及炎癥通路的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 健康♂ SD大鼠，體質(zhì)量220～250 g，購自中山大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。腺病毒純化試劑盒(美國，Clontech)；發(fā)光液、核蛋白提取試劑盒、蛋白定量試劑盒(美國，Pierce)；RIP140、p65、IκB-α抗體(英國，Abcam)；α-tubulin、Histone H3(美國，Sigma)；RIPA蛋白裂解液(南京碧云天生物技術(shù)有限公司)；ELISA試劑盒(南京建成生物有限公司)。小動(dòng)物呼吸機(jī)HX-300、BL-420S生物信號(hào)采集與分析軟件(成都泰盟科技有限公司)；MPX DU8超聲心動(dòng)圖分析儀(意大利，Technos)；蛋白電泳儀、電轉(zhuǎn)儀、GEL DOC 2000成像系統(tǒng)、蛋白定量酶標(biāo)儀(美國，BioRad)；透射電鏡(日本，JEM1400)。

1.2 腺病毒純化 攜帶RIP140基因的腺病毒(Ad-RIP140)包裝與出毒方法參照前期研究[4]，收集裂解的細(xì)胞上清液對(duì)腺病毒進(jìn)行純化，嚴(yán)格按照Clontech腺病毒純化試劑盒(Adeno-XTMMaxi purification kit)操作規(guī)程，收集感染Ad-RIP140和Ad-Null的細(xì)胞沉淀，用富含5%的FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸，-80℃/37℃反復(fù)凍融3次，使細(xì)胞內(nèi)的病毒顆粒完全釋放，3 000 r·min-1離心5 min，將上清轉(zhuǎn)移至一新的離心管中。加入5 μL Nuclease于37℃放置30 min，去除核酸，加入等體積1×Dilution buffer混勻后，用帶0.45 μm濾膜的針頭濾器過濾上述待純化液體。用30 mL 1×Wash buffer清洗濾膜，卸下濾器，將其安裝到一新的裝有3 mL 1×Elution buffer的注射器管中，以3 mL·min-1的速率緩緩?fù)瞥? mL的1×Elution buffer，洗脫濾膜上的病毒顆粒，靜置5 min后，再將余下的洗脫液緩慢推出。取洗脫稀釋液，紫外分光光度法檢測病毒DNA在260 nm處的吸光度，測定線粒體的病毒滴度。病毒滴度(VP/mL)=OD260×稀釋度×1.1×1012。

1.3 心肌多點(diǎn)注射腺病毒載體 220～250 g SPF級(jí)SD大鼠20只，用水合氯醛(320 mg·kg-1)麻醉后，固定在手術(shù)臺(tái)上，經(jīng)口腔直接行氣管插管。剪除胸廓部位皮毛，碘伏消毒，斜向開口切開胸腔處皮膚，鈍性分離胸大肌和前鋸肌。將氣管套管連接呼吸機(jī)(呼吸參數(shù)：潮氣量，2.5 mL/100 kg；呼吸比，1 ∶1；呼吸頻率，79次/min)以及標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)С虒?dǎo)聯(lián)。右手持彎鑷于呼氣時(shí)在3、4肋間撐開胸膜，挑破心包膜，用左手?jǐn)D出心臟。準(zhǔn)備好帶1-gauge針頭的注射器，吸取純化好的腺病毒顆粒，參考并改良已發(fā)表的實(shí)驗(yàn)方法[9]，向心室室壁多點(diǎn)注射100 μL腺病毒(Ad-RIP140：5×109viral particles，Ad-Null：5×109viral particles, 3-5 regions)。

1.4 超聲心動(dòng)圖與血流動(dòng)力學(xué)分析 動(dòng)物造模4周后乙醚麻醉，胸廓剃毛后，在心臟乳突肌水平進(jìn)行2維短軸和M-型超聲心動(dòng)圖成像檢測，檢測左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end-systolic dimension, LVDs)、左室收縮末期室后壁厚度(left ventricular posterior wall end-systolic thickness, PWs)、左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction, LVEF)以及左室縮短分?jǐn)?shù)(left ventricular fraction shortening, LVFS)等心功能指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)后d 2，行血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)檢測，操作如下：動(dòng)物腹腔注射戊巴比妥鈉(30 mg·kg-1)麻醉，頸正中切口分離出右頸動(dòng)脈，連通壓力傳感器的聚乙烯導(dǎo)管插入該血管，并繼續(xù)推進(jìn)入升主動(dòng)脈，連接生理記錄儀連續(xù)記錄血壓5 min。導(dǎo)管繼續(xù)推進(jìn)感覺有突破感，此時(shí)進(jìn)入左心室，通過生理分析軟件分析計(jì)算左室收縮末期壓(left ventricular systolic pressure，LVSP)、左室舒張末期壓(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)、左室內(nèi)壓最大上升和下降速率(maximum ascending and declining rate of left ventricular pressure，±dp/dtmax)等心功能參數(shù)。

1.5 免疫熒光法觀察心臟組織RIP140過表達(dá)情況 取造模7 d后的心臟組織冰凍切片，室溫復(fù)溫2 h。PBS清洗5 min×3次。1%的TritonX-100透膜10 min后，再用PBS清洗5 min×3次。山羊血清封閉1 h后，37℃下于濕盒內(nèi)孵育RIP140一抗(稀釋度1 ∶100)1 h。PBS清洗5 min×3次后，孵育相應(yīng)的熒光二抗(1 ∶100)1 h。PBS清洗5 min×3次，DAPI復(fù)染細(xì)胞核10 min。再次清洗后甘油封片，激光共聚焦顯微鏡拍照。

1.6 ELISA與Western blot分析 從-80℃取出保存的心肌組織，立刻置冰上，勻漿后分為兩部分。一部分按照ELISA試劑盒測定心肌組織釋放的炎癥因子，另一部分用核蛋白試劑盒提取心肌細(xì)胞核蛋白，考馬斯亮藍(lán)定量后，分裝50 μg蛋白留作上樣。配置8%的分離膠和5%的濃縮膠，70 V分離30 min，于120 V電壓繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部。220 mA恒流電轉(zhuǎn)90 min，5%牛奶室溫封閉1 h，然后加入GFP(1 ∶1 000稀釋)、p65(1 ∶800稀釋)、IκB-α(1 ∶1 000)等抗體，4℃孵育過夜。二抗(1 ∶1 000)室溫孵育1 h，洗膜后于暗室下加入生物發(fā)光液顯影、定影。采用GEL DOC 2000成像系統(tǒng)、Quantity one軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度分析，以組蛋白Histone H3、tubulin分別作為核蛋白與胞質(zhì)蛋白的內(nèi)參對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 腺病毒介導(dǎo)RIP140基因在心肌組織中過表達(dá)驗(yàn)證 由于包裝的RIP140腺病毒自身攜帶GFP標(biāo)簽，借助免疫熒光技術(shù)驗(yàn)證外源基因是否導(dǎo)向心臟組織。如Fig 1所示，大鼠心室室壁多點(diǎn)注射攜帶RIP140的腺病毒載體7 d后，心臟組織冰凍切片后免疫熒光分析顯示，大量散在綠色熒光分布在細(xì)胞內(nèi)，說明腺病毒介導(dǎo)的RIP140基因可成功并特異性過表達(dá)于心臟。

Fig 1 Immunofluorescence detection for GFP tagged to Ad-RIP140 vector, confirming successful cardiac-specific overexpression of RIP140 7 days after injection(scale bar=20 μm)

2.2 心臟組織過表達(dá)RIP140對(duì)心臟功能的影響 腺病毒載體介導(dǎo)RIP140在心肌組織中過表達(dá)4周后，借助超聲心動(dòng)圖及血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)評(píng)估心臟功能。與對(duì)照組相比，過表達(dá)RIP140組大鼠心臟從外觀上即可見明顯心室擴(kuò)張；HE染色結(jié)果表明心肌細(xì)胞腫脹、纖維化更為明顯，并伴有炎癥細(xì)胞浸潤；超聲心動(dòng)圖成像也提示心室內(nèi)徑擴(kuò)大，收縮期室內(nèi)徑擴(kuò)大更為明顯(Fig 2)。Tab 1結(jié)果顯示，盡管心臟舒張期內(nèi)徑(LVDd)、室壁厚度(PWs)、左室心室壓上升速率(-dp/dtmax)較對(duì)照組有輕微改變，但差異無顯著性(P>0.05)。心臟收縮期內(nèi)徑增大約25%(P<0.05)，血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)也提示心室舒張壓(LVEDP)明顯增高、左室心室壓上升速率明顯下降(+dp/dtmax)(P<0.05)。此外，心臟射血分?jǐn)?shù)值(EF%)與縮短分?jǐn)?shù)(FS%)均明顯下降(P<0.05)，提示大鼠心臟過表達(dá)RIP140使得心輸出量下降、心臟功能受損。

Tab 1 Echocardiographic and hemodynamic data from hearts with Ad-RIP140 or Ad-Null treatment(±s)

LVDd:left ventricular end-diastolic dimension; LVDs: left ventricular end-systolic dimension; PWs: left ventricular posterior wall end-systolic thickness; EF: ejection fraction; FS: fraction shortening; LVEDP: left ventricle end-diastolic pressure;+dp/dtmax: maximum ascending rate of left ventricular pressure; -dp/dtmax: maximum declining rate of left ventricular pressure.*P<0.05vsAd-Null group

Fig 2 Cardiac wall morphogenesis(scale bar=5 mm), HE staining(scale bar=100 μm) and echocardiographic image of heart injected with Ad-Null or Ad-RIP140

2.3 心臟組織過表達(dá)RIP140對(duì)炎癥通路的影響 炎癥反應(yīng)中，NF-κB是相當(dāng)保守的蛋白，它調(diào)控著多個(gè)病理反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)中的多個(gè)誘導(dǎo)因子和效應(yīng)因子的表達(dá)。TNF-α、IL-1β等促炎癥因子都是NF-κB的靶基因。心臟組織中過表達(dá)RIP140促進(jìn)炎癥因子的釋放，與對(duì)照組相比，TNF-α、IL-2、IL-1β分別升高3.96、4.04、3.41倍(Tab 2，P<0.05)。與腺病毒空載Ad-Null注射組比較，過表達(dá)RIP140組心臟組織核蛋白p65含量明顯增加(Fig 3A，P<0.01)，IκB-α的含量下降(Fig 3B，P<0.05)，提示心臟組織中過表達(dá)RIP140促發(fā)的炎癥反應(yīng)與NF-κB/p65通路激活相關(guān)。

Tab 2 Levels of inflammatory cytokines released in cardiac tissues(±s)

*P<0.05vsAd-Null group

3 討論

RIP140為轉(zhuǎn)錄輔抑制因子，在能量代謝旺盛的細(xì)胞和組織中通過抑制線粒體能量代謝相關(guān)基因、酶的表達(dá)，從而抑制葡萄糖和脂肪酸的攝入、氧化以及能量ATP的合成。巨噬細(xì)胞中RIP140促進(jìn)NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性，誘導(dǎo)促炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)與分泌[5-6]，說明RIP140在轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面具有雙重作用，是調(diào)控能量代謝及炎癥的雙重開關(guān)。我們前期的研究也表明，乳鼠心肌細(xì)胞過表達(dá)RIP140可通過激活NF-κB通路，下調(diào)PPARs的表達(dá)，從而抑制CPT-1β、CPT-2、PDK4等代謝基因的表達(dá)、損傷線粒體結(jié)構(gòu)，最終使得ATP生物合成減少[7]。本研究在前期心肌細(xì)胞水平的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步借助腺病毒過表達(dá)載體，探討心肌組織中特異性過表達(dá)RIP140對(duì)大鼠心臟炎癥通路及心功能的影響。

Fig 3 Activated NF-κB/p65 signaling in rats with intro-myocardial RIP140 overexpression

RIP140 induced p65 protein translocation into the nucleus(A) and IκB-α protein degradation in cytoplasm(B).*P<0.05,**P<0.01vsAd-Null group

轉(zhuǎn)錄因子NF-κB調(diào)控多種基因的表達(dá)，這些基因參與了炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、細(xì)胞存活與凋亡等多種病理生理學(xué)效應(yīng)。哺乳動(dòng)物的NF-κB家族包括5個(gè)成員，分別是p65 (RelA)、RelB、c-Rel、p50/p105 (NF-κB1) 和p52/p100(NF-κB2)。NF-κB是由以上亞基組成的同源或異源二聚體，p65/p50是最常見的活性二聚體。靜息情況下，抑制蛋白IκB(α、β、ε)與NF-κB相互結(jié)合，封鎖后者的核定位序列，存在于胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞遇到外源性刺激時(shí)，通過IκB激酶使NF-κB抑制蛋白IκB-α發(fā)生磷酸化，進(jìn)而由泛素化途徑降解，NF-κB的核定位序列得以釋放，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)后與靶基因的κB位點(diǎn)結(jié)合，促進(jìn)炎癥因子的轉(zhuǎn)錄，誘發(fā)炎癥和免疫反應(yīng)[8]。本研究發(fā)現(xiàn)心臟組織過表達(dá)RIP140，促進(jìn)炎癥因子TNF-α、IL-2、IL-1β釋放、誘導(dǎo)胞質(zhì)組織IκB-α蛋白的降解及核蛋白p65的核轉(zhuǎn)位、損傷心臟結(jié)構(gòu)與功能。本研究在前期細(xì)胞水平上，進(jìn)一步從動(dòng)物整體水平上驗(yàn)證了RIP140與炎癥反應(yīng)之間的關(guān)系。腺病毒介導(dǎo)RIP140基因在心臟組織中的特異性過表達(dá)損傷心臟功能，激活NF-κB/p65炎癥通路，促進(jìn)炎癥因子釋放。

腺病毒介導(dǎo)外源基因RIP140在心肌組織中的特異性表達(dá)是本研究的特色與創(chuàng)新之處，雖然國外目前已有RIP140的轉(zhuǎn)基因小鼠，但并非心臟特異性過表達(dá)RIP140的轉(zhuǎn)基因小鼠。然而，轉(zhuǎn)基因小鼠RIP140過表達(dá)往往早于所研究的疾病發(fā)生前，不利于觀察在缺血、缺氧等疾病應(yīng)激下，RIP140對(duì)疾病發(fā)展進(jìn)程的動(dòng)態(tài)影響。轉(zhuǎn)基因小鼠中RIP140對(duì)其他代謝旺盛組織(如肌肉、腦、肝臟等組織)的作用勢必會(huì)間接影響心臟。最后，轉(zhuǎn)基因技術(shù)所需要的動(dòng)物成本非常高。本研究我們成功借助前期收獲的Ad-RIP140腺病毒，通過純化將其多點(diǎn)注射在大鼠心臟室壁周圍，7 d后取心臟組織切片免疫熒光驗(yàn)證了RIP140成功表達(dá)于心肌中。國外文獻(xiàn)以及我們前期研究證實(shí)，腺病毒介導(dǎo)的外源基因可在心肌組織中持續(xù)高表達(dá)1月余[9-11]。盡管腺病毒載體只是瞬時(shí)表達(dá)的工具，本研究發(fā)現(xiàn)心肌多點(diǎn)注射Ad-RIP140載體4周后，大鼠心室擴(kuò)張明顯、射血分?jǐn)?shù)值下降明顯，充分說明腺病毒介導(dǎo)RIP140基因在心肌組織中的過表達(dá)足以損傷心臟功能。此外，通過控制注射的Ad-RIP140滴度，開展量效關(guān)系研究，為后續(xù)的分子機(jī)制研究奠定了可靠的基礎(chǔ)?？傊延械奈墨I(xiàn)和我們前期的研究基礎(chǔ)均驗(yàn)證了這種通過腺病毒攜帶蛋白過表達(dá)心臟組織中的特異性、安全性及可靠性，該項(xiàng)技術(shù)的創(chuàng)新為后續(xù)分子機(jī)制研究提供了更為經(jīng)濟(jì)、便利、可靠的途徑。

(致謝：本研究的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由中山大學(xué)動(dòng)物中心提供，在中山大學(xué)藥學(xué)院藥理毒理實(shí)驗(yàn)室完成。)

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Role of adenovirus-mediated cardiac-specific RIP140 overexpression in cardiac function and inflammation pathway

CHEN Yan-fang1, ZHANG Luan-kun2, WANG Ruo-lun1, LIU Pei-qing3
(1.DeptofPharmacy,theSecondAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510260,China; 2.DeptofPharmacy,CancerCenterofSunYat-senUniversity,Guangzhou510060,China; 3.SchoolofPharmaceuticalSciences,SunYat-senUniversity,Guangzhou510006,China)

Aim To explore the role of cardiac-specific overexpression of RIP140 in cardiac function and inflammation signaling pathway.Methods Direct intra-myocardial injection of adenovirus vector expressing RIP140 drove transgene expression in heart tissue. RIP140 overexpression was confirmed using immunofluorescence technique in heart. Cardiac function was assessed by echocardiographic and hemodynamic assessment. TNF-α, IL-2 and IL-1β inflammatory cytokines were detected by ELISA, and the protein levels of p65 and IκB-α were measured by Western blot.Results Adenovirus-mediated foreign gene of RIP140 was successfully transferred in cardiac tissue. RIP140 overexpression in heart induced ventricular dilation, decreased left ventricular ejection fraction and cardiac malfunction, as well as increased releases of TNF-α, IL-2 and IL-1β inflammatory cytokines, p65 protein translocation into the nucleus and IκB-α protein degradation in cytoplasm.Conclusion Adenovirus-mediated RIP140 overexpression in cardiac tissue impairs cardiac function, activates NF-κB/p65 inflammatory signaling pathway and induces the release of inflammatory cytokines.

receptor interacting protein 140; inflammatory cytokines; nuclear factor κB; cardiac tissue; adenovirus; energy metabolism

2017-05-20,

2017-06-17

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81402923)

陳艷芳(1984-)，女，博士，副主任藥師，研究方向：心血管藥理學(xué)，E-mail: yfchen312@126.com； 劉培慶(1964-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：心血管藥理學(xué)，通訊作者，E-mail: peiqingliu2013@163.com

時(shí)間：2017-7-7 11:04 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170707.1104.014.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.08.007

A

1001-1978(2017)08-1068-05

R-332；R322.11；R331.31；R373.1；R392.12；R977.6