子宮頸上皮內(nèi)瘤變及鱗狀細胞癌組織cyclin D1的表達特征及與HPV16 E7的相關(guān)性

劉曉輝

子宮頸上皮內(nèi)瘤變及鱗狀細胞癌組織cyclin D1的表達特征及與HPV16 E7的相關(guān)性

劉曉輝

目的 探討細胞周期蛋白 D1(cyclin D1)在子宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)及鱗狀細胞癌中的表達及其與人乳頭狀瘤病毒(HPV)16 E7的關(guān)系。方法 選擇2013-09—2015-09內(nèi)蒙古自治區(qū)赤峰學院醫(yī)學院附屬醫(yī)院經(jīng)病理確診為子宮頸上皮內(nèi)瘤和宮頸鱗癌的患者以及同期宮頸正常上皮人群作為研究對象，取其子宮頸組織制成石蠟標本。其中子宮頸上皮內(nèi)瘤81例，宮頸鱗癌40例，宮頸正常上皮50例。采用即時熒光定量PCR、免疫組織化學法檢測cyclin D1在三組細胞組織中的基因以及蛋白的表達情況；采用逆轉(zhuǎn)錄PCR、W estern blot、免疫組織化學法檢測cyclin D1在不同E7表達狀態(tài)的的三組細胞中的表達情況。結(jié)果 正常宮頸組織組cyclin D1表達均為陽性，CIN組和鱗狀細胞組只有少數(shù)表達為陽性，顯著少于正常宮頸組織組，且隨著宮頸上皮內(nèi)瘤變等級的升高cyclin D1表達量逐漸降低；E7基因在正常宮頸組織中不表達或微表達，在CIN組以及鱗狀細胞癌組表達更高，以上差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。結(jié)論 子宮頸癌的發(fā)生受多重因素影響，HPV感染是該癥發(fā)生的主要因素。隨著宮頸上皮內(nèi)瘤變等級的升高cyclin D1表達量逐漸降低，且E7基因的高度表達是導致cyclin D1低表達的主要原因。

宮頸上皮內(nèi)瘤變；宮頸鱗癌；cyclin D1；HPV16 E7

宮頸鱗癌是臨床上常見的婦科惡性腫瘤，有研究表明該病的發(fā)生與發(fā)展與人乳頭狀瘤病毒(HPV)16，尤其是其E7基因密切相關(guān)[1]。細胞周期蛋白D1(cyclin D1)是正常子宮頸上皮細胞一種較為重要的周期蛋白，它與細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)和細胞周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白共同精密調(diào)控細胞增殖[2]。研究表明，cyclin D1參與細胞周期G1/S期的轉(zhuǎn)換，其超常的表達可加速細胞的增殖，與多種癌癥的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)[3-4]。為了探究cyclin D1在子宮頸上皮內(nèi)瘤變及鱗狀細胞癌中的表達及其與HPV16 E7的關(guān)系，我院特做了一次研究，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料和方法

1.1 臨床資料 選擇2013-09—2015-09我院經(jīng)病理確診為子宮頸上皮內(nèi)瘤和宮頸鱗癌的患者以及同期宮頸正常上皮人群作為研究對象，取其子宮頸組織制成石蠟標本。其中子宮頸上皮內(nèi)瘤患者81例，其中Ⅰ級34例、Ⅱ級33例、Ⅲ級14例；宮頸鱗癌患者40例，宮頸正常上皮50例。本次研究已獲得醫(yī)院倫理委員會的審核批準。

1.2 研究方法 細胞以及試劑準備：宮頸鱗狀癌細胞Hcc94和SiHa細胞、核酸提取試劑盒、HiFi-MMLV Two Step RT-PCR試劑盒。細胞培養(yǎng)：先設(shè)計靶向HPV16 E7基因啟動子區(qū)的siRNA序列，構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SiHa細胞，從這批細胞中篩選出穩(wěn)定沉默E7基因的細胞株，命名為A細胞株。用10%的胎牛血清以及濃度為1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基來培養(yǎng)SiHa細胞和A細胞株，用10%的胎牛血清以及濃度為1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI 1 640培養(yǎng)基來培養(yǎng)Hcc94細胞，細胞培養(yǎng)均在37℃、5%的CO2條件下培養(yǎng)，利用EDTA胰消化酶實現(xiàn)細胞傳代，進行長期細胞實驗。

1.3 觀察指標 ①觀察比較cyclin D1在正常宮頸組織、宮頸上皮內(nèi)瘤變組織以及鱗狀細胞癌組織中的表達情況。②比較不同級別的宮頸上皮內(nèi)瘤變組織cyclin D1的表達情況。③比較E7基因在Hcc94和SiHa細胞中的表達情況。

1.4 統(tǒng)計學方法 通過SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析，定量資料以(±s)表示，組間比較采用t檢驗，定性資料的組間比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 cyclin D1在正常宮頸組織、宮頸上皮內(nèi)瘤變組織以及鱗狀細胞癌組織中的表達情況對比 正常宮頸組織組cyclin D1表達均為陽性，CIN組和鱗狀細胞組只有少數(shù)表達為陽性，顯著少于正常宮頸組織組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，表1)。

表1 cyclin D1在正常宮頸組織、宮頸上皮內(nèi)瘤變組織以及鱗狀細胞癌組織中的表達情況對比[n(%)]

2.2 不同級別的宮頸上皮內(nèi)瘤變組織cyclin D1的表達情況對比 隨著宮頸上皮內(nèi)瘤變等級的升高cyclin D1表達量逐漸降低(表2)。

表2 不同級別的宮頸上皮內(nèi)瘤變組織cyclin D1的表達情況對比[n(%)]

2.3 E7基因在正常宮頸組織、宮頸上皮內(nèi)瘤變組織以及鱗狀細胞癌組織中的表達情況對比 E7基因在正常宮頸組織中不表達或微表達，在CIN組以及鱗狀細胞癌組表達更高，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，表3)。

表3 E7基因在正常宮頸組織、宮頸上皮內(nèi)瘤變組織以及鱗狀細胞癌組織中的表達情況對比[n(%)]

3 討論

cyclin D1是人體內(nèi)重要的細胞周期蛋白，與CDK4結(jié)合并激活其激酶活性，誘導細胞從G1期進入S期，從而促進細胞增殖。正常情況下，當細胞進入S期后cyclin D1基因則會迅速分解，細胞得以正常增殖[5]。因其他不良因素導致的cyclin D1過量表達則可能導致細胞的大量增殖，導致癌變，與主張cyclin D1與癌癥形成與發(fā)展密切相關(guān)的言論不謀而合。有研究表明，cyclin D1在正常宮頸組織、宮頸上皮內(nèi)瘤變組織以及鱗狀細胞癌組織內(nèi)的表達正逐漸升高[6]。

在此次研究中，我們發(fā)現(xiàn)正常宮頸組織組cyclin D1表達均為陽性，CIN組和鱗狀細胞組只有少數(shù)表達為陽性，顯著少于正常宮頸組織組，且隨著宮頸上皮內(nèi)瘤變等級的升高cyclin D1表達量逐漸降低。此外，E7基因在正常宮頸組織中不表達或微表達，在CIN組以及鱗狀細胞癌組表達更高，提示E7基因的高度表達是導致cyclin D1低表達的主要原因[7-8]。這是因為E7基因編碼的E7蛋白可以直接與pRb結(jié)合，使其高磷酸化，活化核轉(zhuǎn)錄因子E2F，誘導細胞進入S期，從而避開了cuclin D1與CDK共同作用下的正常細胞增殖，使得細胞增殖異常[9-11]。因此宮頸癌細胞中尤其是級別較高的細胞中E7基因呈高表達，相應(yīng)的cycvlin D1則呈低表達。

綜上所述，子宮頸癌的發(fā)生受多重因素影響，HPV感染是該癥發(fā)生的主要因素。隨著宮頸上皮內(nèi)瘤變等級的升高cyclin D1表達量逐漸降低，且E7基因的高度表達是導致cyclin D1低表達的主要原因。

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Objective To explore the expression features of cyclin D1 in cervical intraepithelial neoplasia(CIN)and squamous cell carcinoma and its correlation w ith HPV16 E7.Methods Sufferers diagnosed w ith cervical intraepithelial neoplasia(CIN)and squamous cell carcinoma and people with normal cervical epithelium at Chifeng College Medical School Affiliated Hospital of the Nei mongol Autonomous Region from September 2013 to September 2015 were taken as the study objects，whose cervical tissues were made into paraffin-embedded specimens.There were 81 cases w ith cervical intraepithelial neoplasia，40 cases w ith cervical squamous carcinoma，and 50 cases w ith normal cervical epithelium.Real time fluorescence quantitative PCR and immunohistochem ical method were adopted to detect the expression of cyclin D1 in genes and albumen of the three kinds of cell tissues；Reverse transcription PCR，Western blot，and immunohistochemical method were adopted to detect the expression of cyclin D1 in the three kinds of cell tissues w ith different E7 expression status.Results The expression of cyclin D1 in the normal cervical tissue group was all positive，while only a little of expression in the CIN group and the cervical squamous carcinoma group was positive，which was clearly less than the normal cervical tissue group.With the rising of cervical intraepithelial neoplasias levels，the expression of cyclin D1 gradually lowered.Gene E7 had no or little expression in normal cervical tissues，but quite high in the CIN group and the cervical squamous carcinoma group，w ith differences of statistical significance(P＜0.05).Conclusion The occurrence of cervical cancer has multiple influencing factors，among which HPV infection is the principal factor.W ith the rising of cervical intraepithelial neoplasias levels，the expression of cyclin D1 gradually lowered，and the high expression of gene E7 is a main cause leading to the low expression of cyclin D1.

Cervical intraepithelial neoplasia；Cervical squamous carcinoma；Cyclin D1；HPV16 E7

2016-07-08)

1005-619X(2017)02-0125-03

10.13517/j.cnki.ccm.2017.02.005

024000 內(nèi)蒙古自治區(qū)赤峰學院醫(yī)學院附屬醫(yī)院病理科