我國沈陽一起GII.17型諾如病毒胃腸炎暴發(fā)的分子病原學特征研究

王冰 張春青 王萍 張眉眉 連志勇

110031 沈陽市疾病預防控制中心(王冰、張春青、王萍、連志勇)；110005 沈陽，遼寧省疾病預防控制中心(張眉眉)

·論著·

我國沈陽一起GII.17型諾如病毒胃腸炎暴發(fā)的分子病原學特征研究

王冰 張春青 王萍 張眉眉 連志勇

110031 沈陽市疾病預防控制中心(王冰、張春青、王萍、連志勇)；110005 沈陽，遼寧省疾病預防控制中心(張眉眉)

目的 明確沈陽地區(qū)一起學校急性胃腸炎暴發(fā)的病原和基因特征。方法 采集2015年12月沈陽地區(qū)某高校暴發(fā)疫情中的學生和食堂從業(yè)人員病例肛拭子標本共計15份，采用熒光定量RT-PCR進行諾如病毒檢測，并對陽性標本進一步進行傳統(tǒng)RT-PCR方法擴增、序列測定和系統(tǒng)進化分析。結果 熒光定量RT-PCR檢測確定12份標本為諾如病毒陽性，系統(tǒng)進化分析表明，12個毒株均為GII.17基因型，與引起我國2014—2015年流行的GII.17新變異株KR020503株同源性為99%以上。結論 引起我國2014—2015年流行的GII.17新變異株是引起此高校急性胃腸炎暴發(fā)的病原，并且GII.17型諾如病毒為東北地區(qū)首次檢出。

Fund programs: National Science and Technology Major Project of China(2012ZX10004209)

諾如病毒(Norovirus,NoV)屬于杯狀病毒科諾如病毒屬，目前被認為是引起全球冬季急性胃腸炎暴發(fā)的最主要病原[1]。NoV為單股正鏈無包膜RNA病毒，基因組約為7.5 Kb，共有三個開放閱讀框(Open reading frams, ORFs)，根據(jù)ORF1編碼的RNA聚合酶區(qū)(RNA dependent RNA polymerase, RdRp)和ORF2編碼的衣殼蛋白區(qū)(Capsid)核苷酸序列差異，將NoV分為5個基因組(GI-GV)，其中GI、GII、GIV可感染人類，又以GII型多見[2]。自1995年以來，GII.4基因型一直是NoV引起全球暴發(fā)流行的優(yōu)勢株，我國從2006年開始建立病毒性腹瀉監(jiān)測網(wǎng)絡，監(jiān)測結果顯示我國NoV引起的胃腸炎暴發(fā)型別多以GII.4/2006b變異株為主(占88.2%)[3]，這與其他國家報道基本一致。但在2014—2015年冬春季節(jié)，我國出現(xiàn)新的GII.17變異株引起的NoV暴發(fā)激增，并在日本同期引起流行，歐洲及美國也有GII.17新變異株引起暴發(fā)的報道。迄今為止，在我國東北地區(qū)由GII.17引起的急性胃腸炎暴發(fā)鮮有報道，本研究對我市2015年12月暴發(fā)的一起學校聚集性急性胃腸炎疫情進行病原學分子分型鑒定和遺傳進化分析，為以后此類疾病監(jiān)測和疫情處置提供客觀的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標本收集 取自2015年12月沈陽市某高校腹瀉疫情中的15個胃腸炎患者，均為肛拭子(糞便)標本，其中在校學生10份，食堂從業(yè)人員5份。

1.2 標本前處理 取腹瀉標本約0.1 g，加入分裝好0.9 ml PBS的1.5 ml Eppendorf管中。振蕩混勻，制備10%的便懸液， 5 000 rpm離心5 min，使用澄清的上清液進行RNA提取。

1.3 核酸提取 取便懸液上清200 μl，采用德國Qiagen公司RNeasy Mini Kit試劑(Cat:74104)在QIA Cube核酸提取儀上對標本進行RNA的提取，最終RNA體積為50 μl。

1.4 熒光定量RT-PCR(Real-Time RT-PCR)檢測 采用NoV通用核酸熒光定量檢測試劑盒和GI/GII雙通道熒光定量檢測試劑盒(江蘇碩世生物科技有限公司)，在ABI 7500熒光定量PCR儀上進行檢測，反應體系、擴增條件和結果判讀均按照試劑盒說明書進行。

1.5 Capsid與RdRp區(qū)的擴增和序列測定 采用傳統(tǒng)RT-PCR方法，將1.4鑒定為陽性的核酸毒株進行擴增，選用德國Qiagen公司的One step RT-PCR Kit試劑(Cat:210212)，在ABI公司的veriti PCR儀上進行擴增，反應體系、擴增參數(shù)和引物序列參見文獻[4]，擴增陽性產(chǎn)物送TaKaRa公司進行純化后雙向測序。

1.6 序列拼接和進化分析 應用Lasergene7.1軟件對序列進行拼接，從GenBank下載相關NoV的核酸序列片段，利用MEGA6.0軟件與本研究完成測序的序列進行比對，應用Neighbor-Joining(N-J)法構建進化樹。

2 結果

2.1 疫情概況和特征 疫情所在高校共有2萬余學生，共報告病例58例。男性23人，女性35人；學生為35人，食堂從業(yè)人員為23人，其中學生分散在不同班級和宿舍，呈散在分布無明顯的聚集性，但發(fā)病前具有同一暴露源就餐地點。發(fā)病日期集中，首發(fā)病例為2015年11月28日，末例病例為12月3日，發(fā)病高峰為12月2日。臨床癥狀基本相似，癥狀輕、病程短，主要以惡心(89.7%)、嘔吐(75.9%)和腹瀉(65.5%)為主，多數(shù)成水樣便和稀便，實驗室血常規(guī)檢測顯示90%以上患者白細胞數(shù)和中性粒細胞分屬為正常范圍內(nèi)。

2.2 Real-Time RT-PCR檢測 共檢測15份標本(學生10份、食堂從業(yè)人員5份)，檢出NoV核酸通用陽性12份，進一步鑒定均為NoV GII型，陽性率為80%(12/15)，其中在校學生陽性9份(SY-1～SY-4、SY-6～SY-10)，食堂從業(yè)人員3份(SY-11～SY-13)。

2.3 RT-PCR擴增和序列測定 Real-Time RT-PCR檢出的陽性標本核酸，用傳統(tǒng)RT-PCR方法對RdRp區(qū)和capsid區(qū)進行擴增，12份樣本在兩區(qū)域均成功擴增，PCR產(chǎn)物與預計片段大小相符。

2.4 NoV RdRp區(qū)序列測定及系統(tǒng)進化分析 RdRp區(qū)系統(tǒng)進化樹顯示，本研究測得的12株NoV毒株均分布在GII-17亞型分支上，其RdRp區(qū)同源性為100%。與2014年廣州株KR020503、2014年香港株KP998539同屬一個進化分支，親源性較近，同源性分別為99.7%、97.8%。而與2013年日本株LC043167雖然同屬于GII-17亞型分支，但親源性較遠，同源性僅為77.1%。

◆: 表示學生；◇: 表示食堂員工圖1 NoV的RdRp區(qū)核苷酸序列進化分析◆: represents student；◇: represents kitchen staffFig.1 Phylogenetic tree based on partial RdRp gene sequences from genotype GII NoV strains in Shenyang

2.5 NoV capsid區(qū)序列測定及系統(tǒng)進化分析 capsid區(qū)系統(tǒng)進化樹顯示，本研究測得的12株NoV毒株均分布在GII-17亞型分支上，其capsid區(qū)同源性均為100%。與2014年廣州株KR020503、2015年日本株LC037415同屬一個GII.17亞型進化分支，親源較近，同源性分別為99.6%、99.2%；與2009年瑞士株GQ266697，雖然同為GII.17型，但親源性較遠，同源性僅為81.9%。

◆: 表示學生；◇: 表示食堂員工圖2 NoV的capsid區(qū)核苷酸序列進化分析◆: represents student；◇: represents kitchen staffFig.2 Phylogenetic tree based on partial capsid gene sequence from genotype GII NoV strains in Shenyang

3 討論

以往十幾年監(jiān)測顯示，全球約有20%的急性胃腸炎是由NoV感染引起的，由于高度傳染性、感染劑量低和變異性強等特點，導致該病毒能在相對封閉的環(huán)境中迅速傳播，帶來巨大的疾病負擔和社會恐慌。NoV通過突變和同源重組兩個分子機制發(fā)生變異，使其基因型和抗原性具有豐富的動態(tài)多樣性，導致不同時間和空間上的優(yōu)勢流行株存在著較大差異。近些年我國監(jiān)測結果顯示，其暴發(fā)和流行多以GII.4/2006b相似株為主，還有報道GII.2型和GII.3型引起的暴發(fā)疫情[5-6]，而GII.17型報道較少。本研究在2015年12月，沈陽市某高校暴發(fā)疫情中檢測出NoV基因型為GII.17型，是東北地區(qū)首次在急性胃腸炎暴發(fā)疫情中檢測到該基因型毒株。

流行病學調(diào)查顯示，該事件發(fā)病時間分布符合同源暴露的點源暴發(fā)疫情，所有患病學生和食堂從業(yè)人員均在一個最長潛伏期內(nèi)，發(fā)病前具有同一暴露源就餐地點，相關部門采取控制措施停止供餐后，病例消失。采集患者標本，應用Real-Time RT-PCR方法，實驗室檢測出NoV核酸陽性，并進一步判斷為GII.17基因型，且同源性為100%，證實為諾如病毒感染引起的急性胃腸炎疫情，通過對病例臨床癥狀和流行病學資料綜合分析，確認該起為傳播途徑明確的食源性感染性腹瀉突發(fā)公共衛(wèi)生事件，對該起暴發(fā)事件的定性和處置提供了科學的依據(jù)。

GII.17型NoV為1978年首次在美國發(fā)現(xiàn)，之后消失數(shù)年，直到2005年在東非地區(qū)的肯尼亞地表水中再次檢測到該型別毒株，通過進化分析確定為GII.17亞型；2014年前后在東亞和東南亞地區(qū)相繼發(fā)現(xiàn)新的GII.17型變異株。從圖2的Capsid區(qū)系統(tǒng)進化樹大致可以看出，NoV的GII.17型在Capsid區(qū)通過累積突變和基因重組使其一直處于不斷變異過程中，由于抗原的變化使得毒株針對宿主造成免疫逃逸，出現(xiàn)新的流行株。特別是2002年后，大概每隔2～3年就會出現(xiàn)較大變異，其Capsid區(qū)的氨基酸有2.0%左右的差異，我國在2014年先后在江蘇南京市和廣東廣州市兩起暴發(fā)疫情中檢測到GII.17型毒株，監(jiān)測數(shù)據(jù)表明2014—2015年GII.17型變異株遍及我國11個省市[7]，已具有取代GII.4/2006b變異株成為新流行優(yōu)勢株的趨勢。本次暴發(fā)疫情發(fā)現(xiàn)的毒株與2014年廣州株KR020503相比，其RdRp區(qū)和Capsid區(qū)的核苷酸同源性分別為99.7%和99.6%，毒株間親緣性很近，表明該毒株由南向北已有進一步蔓延流行的趨勢。

本研究表明GII.17型NoV毒株已經(jīng)在東北地區(qū)出現(xiàn)，以往該地區(qū)人群普遍缺乏對其免疫力，并未構成有效的免疫屏障，所以應作為監(jiān)測的重點毒株引起相關醫(yī)療機構和行政部門的重視。但由于東北地區(qū)以往對該毒株未引起足夠重視，進而缺少相關的監(jiān)測資料，還需盡快建立常規(guī)諾如病毒監(jiān)測系統(tǒng)加以動態(tài)觀察。因此加強對NoV感染情況的監(jiān)測和分子病原學研究已迫在眉睫，盡快健全我國諾如病毒監(jiān)測網(wǎng)絡體系的建設具有十分重要的戰(zhàn)略意義。

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[6] 史永林, 孔翔羽, 靳淼, 等. 安徽省諾如病毒胃腸炎暴發(fā)的分子病原學特征研究[J]. 中華實驗和臨床病毒學雜志, 2015, 29:310-312. doi: 10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2015.04.007.

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(本文編輯：呂新軍)

The molecularly etiological study on the GII.17 norovirus causing an acute gastroenteritis outbreak in Shenyang

Wang Bing, Zhang Chunqing, Wang Ping, Zhang Meimei, Lian Zhiyong.

Shenyang Center for Disease Control and Prevention, Shenyang 110031,China(Wang B, Zhang CQ, Wang P, Lian ZY); Liaoning Center for Disease Control and Prevention, Shenyang 110005, China(Zhang MM)

Wang Bing, Email: cdcwangbing@hotmail.com

Objective To define the etiology and genetics of the pathogen causing an acute gastroenteritis outbreak in a college of Shenyang. Methods A total of 15 anal swab samples were collected from students or kitchen staffs of the college where outbroke the epidemic of acute gastroenteritis in December 2015 in Shenyang, Liaoning province. Real-time PCR was performed to identify the infection of Norovirus(NoV). The NoV genes were amplified and sequenced for those positive samples, followed to perform phylogenetic analysis. Results Of the 15 specimens, 12 were NoV positive by Real-time PCR,phylogenetic analysis showed that the infected virus of the outbreak was belonged to NoV genotype GII.17. The homology between the present virus and new mutated GII.17 strain of KR020503 identified in 2014—2015 epidemic outbreak in China was over 99%. Conclusions The new mutated NoV GII.17 caused the acute gastroenteritis outbreak in a college of Shenyang in 2015,NoV GII.17 was detected firstly in Northeast China.

Norovirus; Acute gastroenteritis; Outbreak; GII.17 genotype

王冰，Email: cdcwangbing@hotmail.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.03.006

諾如病毒；急性胃腸炎；暴發(fā)；GII.17型

國家科技重大專項(2012ZX10004209)

2017-03-03)