pVR-IL15基因佐劑對表達HBsAg重組病毒免疫效果的影響

潘瑞 何兵 陳國敏 畢勝利 曾毅

102206 北京，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所 傳染病預(yù)防控制國家重點實驗室

·論著·

pVR-IL15基因佐劑對表達HBsAg重組病毒免疫效果的影響

潘瑞 何兵 陳國敏 畢勝利 曾毅

102206 北京，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所 傳染病預(yù)防控制國家重點實驗室

目的 探索pVR-IL15基因佐劑在表達HBsAg病毒治療型疫苗的不同免疫策略中對免疫應(yīng)答的影響。方法 采用了攜帶乙肝病毒S基因片段的DNA、重組Ankara痘病毒和重組腺病毒序貫免疫策略免疫BALB/c小鼠，在序貫免疫策略的基礎(chǔ)上聯(lián)合pVR-IL15免疫。用ELISA和IFN-γ ELISPOT方法檢測不同免疫組別中小鼠的細胞免疫和體液免疫反應(yīng)強度。結(jié)果 聯(lián)合pVR-IL15免疫組的體液免疫應(yīng)答水平和細胞免疫應(yīng)答水平均顯著高于無聯(lián)合pVR-IL15免疫組，差異具有統(tǒng)計學意義。結(jié)論 pVR-IL15基因佐劑能夠增強表達HBsAg重組病毒誘導的小鼠免疫應(yīng)答。

據(jù)WHO統(tǒng)計，截至2016年6月約有2.4億人長期感染HBV(HBsAg持續(xù)陽性至少6個月)。治療型疫苗通過誘導機體產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答，可打破慢性乙肝患者的免疫耐受，清除體內(nèi)病毒，從而達到治療的目的。佐劑可增強疫苗抗原特異性免疫應(yīng)答、增強抗體效應(yīng)和增加抗體反應(yīng)的持續(xù)時間。IL15(Interleukin-15)是美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)指導審查的最有前途的腫瘤治療藥物，是自然殺傷細胞(NK)、自然殺傷T細胞(NKT)和CD44hi記憶型CD8T細胞生存的必需因子[1]。重組痘病毒載體疫苗和重組腺病毒載體疫苗雖然具有很強的免疫原性，但其誘導的免疫應(yīng)答不足以對機體產(chǎn)生保護效果。因此，本研究采用重組pVR-S質(zhì)粒、重組痘病毒rMVA-S和重組腺病毒rAdv-S組成不同的聯(lián)合免疫，既彌補了單獨免疫的不足，又可誘導機體產(chǎn)生有保護效應(yīng)的免疫應(yīng)答。

1 材料與方法

1.1 材料 乙型肝炎表面抗體ELISA檢測試劑盒購自北京萬泰生物藥業(yè)有限公司，HRP標記的羊抗小鼠IgG購自北京中山金橋生物科技有限公司，小鼠IFN-γ ELISPOT試劑盒購自Mabtech公司，特異性免疫刺激肽PL-11、WY-8和VL-8由北京朝日和源生物技術(shù)有限公司合成。pVR-S、rAdv-S和rMVA-S由病毒病預(yù)防控制所曾毅院士實驗室構(gòu)建；pVR-IL15由北京工業(yè)大學李莉莉博士惠贈。體重約17.5～21 g的4～6周齡清潔級雌性BALB/c小鼠，購自中國食品藥品檢定研究院，飼養(yǎng)于中國疾病預(yù)防控制中心職業(yè)衛(wèi)生與中毒控制所清潔級動物實驗室。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠免疫：將小鼠隨機分為5組，每組5只。基因?qū)雰x電擊肌注，質(zhì)粒pVR、pVR-S和pVR-IL15的免疫劑量分別為100 μl(1μg/μl)/只。rMVA-S和rAdv-S的免疫方式為皮下注射，rMVA-S的免疫劑量為100 μl/只(1.2×108PFU)，重組腺病毒rAdv-S的免疫劑量為100 μl/只(8×108TCID50/100 μl)。PBS組皮下注射1×PBS，100 μl/只。各組小鼠在末次免疫后一周，摘除眼球取血，分離血清，保存-80 ℃?zhèn)溆谩２捎妙i椎脫臼法處死小鼠，分離脾淋巴細胞。各組別小鼠免疫策略見圖1。

圖1 免疫策略Fig.1 Immunization strategies

1.2.2 免疫小鼠血清中HBsAg抗體檢測：使用乙肝表面抗體ELISA檢測試劑盒，在相應(yīng)孔中分別加入梯度稀釋的待測小鼠血清及對照樣品各100 μl，按照試劑盒說明書操作。臨界值=陰性對照孔均值×2.1。

1.2.3 小鼠特異性細胞免疫應(yīng)答檢測：使用Mabtech公司的ELISPOT試劑盒檢測免疫小鼠的特異性細胞免疫反應(yīng)。實驗方法按照試劑盒說明書操作，陰性對照孔加入與刺激物等體積的1640培養(yǎng)液，每孔終體積為100 μl，空白孔加入100 μl的1640培養(yǎng)液，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)42 h。堿性磷酸酶顯色后，使用AID ELISPOT Reader Systems自動讀取斑點形成數(shù)(Spot forming cell，SFC)，換算成1×106個脾細胞形成的斑點數(shù)(SFC/106)。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SAS9.3及GraphPad prism 5軟件處理實驗數(shù)據(jù)，多組樣本均數(shù)的比較首先采用正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布的采用方差分析，多組間兩兩比較采用Bonferroni法，不符合正態(tài)分布的采用Kruskal-wallis秩和檢驗。小鼠血清中多次免疫及免疫時間效應(yīng)的影響采用重復(fù)測量資料方差分析。

2 結(jié)果

2.1 免疫小鼠血清中HBsAg抗體滴度 ELISA檢測末次免疫后血清抗體滴度，結(jié)果顯示各組間HBsAg抗體滴度分布不符合正態(tài)分布，采用Wilcoxon檢驗各組間的差異有統(tǒng)計學意義(χ2=19.57P=0.0006)。免疫小鼠血清中抗HBsAg抗體檢測結(jié)果顯示，在rAdv-S和rMVA-S聯(lián)合免疫中，兩種重組病毒的免疫順序?qū)φT導小鼠產(chǎn)生抗體的水平無影響。使用pVR-IL15加強免疫組的小鼠血清中HBsAg抗體滴度顯著高于未加強免疫的小鼠組(見圖2)。

圖2 免疫小鼠特異性抗體水平Fig.2 Specific antibody level in immunized mice

2.2 免疫小鼠特異性細胞免疫反應(yīng) 使用IFN-γ ELISPOT檢測不同免疫策略誘導的小鼠特異性細胞免疫應(yīng)答水平。結(jié)果顯示各組間的SFC數(shù)值呈正態(tài)分布且各組方差齊(χ2=1.79P=0.6168)，采用方差分析顯示各組間的差異有統(tǒng)計學意義(F=6.62P=0.0059)。小鼠特異性細胞免疫應(yīng)答檢測結(jié)果顯示，加強pVR-IL15免疫的小鼠組的特異性細胞免疫應(yīng)答水平高于加強pVR免疫組。rAdv-S和rMVA-S的先后免疫順序?qū)φT導的特異性細胞免疫應(yīng)答水平無影響(見圖3)。

圖3 免疫小鼠細胞免疫應(yīng)答Fig.3 Cellular immune response of immunized mice

3 討論

HBV感染控制失敗主要與T細胞功能紊亂有關(guān)。有研究表明IFN-α和IL15聯(lián)合使用不僅能夠誘導抗體免疫應(yīng)答，減少肝臟中HBV載量，而且還可以提高特異性CD8+細胞的免疫力[2]。在病毒感染的不同階段，T細胞功能的可塑性有助于調(diào)整抗病毒免疫。在急性和慢性HBV感染期中，HBV特異性T細胞的多功能分析顯示，HBV特異性T細胞能夠產(chǎn)生中性粒細胞趨化因子CXCL-8，而IL15和IL7是產(chǎn)生CXCL-8 T細胞增殖過程中必須的細胞因子[3]。有學者發(fā)現(xiàn)，加強免疫表達IL15的重組質(zhì)粒，可延長表達HBcAg DNA疫苗誘導的CD8T細胞的壽命[4]。IL15可以顯著增加自體全細胞腫瘤疫苗誘導的細胞免疫和體液免疫，通過促進NK細胞和CD8+T細胞的活化，增強抗腫瘤免疫反應(yīng)[5]。IL15也是一種調(diào)節(jié)固有免疫和適應(yīng)性免疫的多效性細胞因子，這提示IL15可能在HBV免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)中起著重要的作用[6]。本研究結(jié)果表明pVR-IL15基因佐劑能夠增強表達HBsAg重組病毒誘導的小鼠免疫應(yīng)答，與前述文獻結(jié)果相一致。在免疫兩次pVR-S的基礎(chǔ)上，再分別免疫rMVA-S和rAdv-S，所誘導的免疫應(yīng)答水平無統(tǒng)計學差異，表明免疫應(yīng)答水平與免疫rMVA-S和rAdv-S的順序無關(guān)。有研究在聯(lián)合免疫表達HIV-1結(jié)構(gòu)基因?qū)嶒炛邪l(fā)現(xiàn)，所有實驗組3種疫苗聯(lián)合免疫可誘導類似的細胞免疫應(yīng)答水平，與免疫順序沒有關(guān)系[7]。

有研究者發(fā)現(xiàn)，小劑量皮內(nèi)接種乙型肝炎疫苗能夠產(chǎn)生有效的免疫反應(yīng)[8]。在嬰幼兒和學齡前兒童中，皮內(nèi)注射3次低劑量重組乙型肝炎疫苗誘導的抗-HBs反應(yīng)與肌注三次標準劑量疫苗的免疫效果相當[9]。而且皮下有豐富的郎格漢氏細胞，能夠捕捉抗原及變應(yīng)原，形成抗原肽MHCⅡ類復(fù)合物，有利于抗原呈遞。為提高疫苗的免疫原性，本研究中重組病毒的免疫方式為腹股溝皮下注射。

綜上所述，在聯(lián)合免疫重組腺病毒和重組痘病毒中，兩種病毒的免疫順序?qū)λT導的體液免疫和細胞免疫應(yīng)答水平無影響，加強免疫pVR-IL15小鼠組所誘導的體液免疫和細胞免疫應(yīng)答水平均高于未加強免疫的小鼠組。在今后的研究中，可進一步優(yōu)化實驗方案，提高免疫效果。

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(本文編輯：呂新軍)

The influence of pVR-IL15 gene adjuvant on immunization with recombinant viruses expressing HBsAg

Pan Rui, He Bing, Chen Guomin, Bi Shengli, Zeng Yi

State Key Laboratory for Infectious Disease Control and Prevention, Institute for Viral Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China

Chen Guomin, Email: guominch2013@163.com; Zeng Yi, Email: zengyi@sina.com

Objective To explore the influence of pVR-IL15 gene adjuvant on the immune responses of different immunization strategies. Methods The sequential immunization strategies were used in BALB/c mice with a DNA vaccine, recombinant modified vaccinia virus Ankara and recombinant adenovirus expressing HBsAg respectively and combined with a gene adjuvant pVR-IL15. Cellular and humoral immune responses were evaluated by IFN-γ enzyme-linked immunospot assay (ELISPOT) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), respectively. Results The levels of humoral and cellular immune responses in the immune groups combined with pVR-IL15 were significantly higher than those of the non-combined with pVR-IL15. Conclusions The pVR-IL15 gene adjuvant can enhance the immune responses induced by the recombinant viruses expressing HBsAg.

pVR-IL15; Gene adjuvant; Recombinant virus

陳國敏，Email:guominch2013@163.com；曾毅，Email:zengyicdc@sina.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.03.003

pVR-IL15；基因佐劑；重組病毒

2017-01-09)