新型擬除蟲菊酯降解酶的分子改造及降解特性

劉孝龍，劉玉煥，范新炯

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，安徽 合肥 230032；2. 中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275 )

新型擬除蟲菊酯降解酶的分子改造及降解特性

劉孝龍1,2，劉玉煥2，范新炯1,2

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，安徽 合肥 230032；2. 中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275 )

為了獲得穩(wěn)定性和酶活性提高的擬除蟲菊酯類降解酶，利用易錯(cuò)PCR技術(shù)對來源于海底泥宏基因組文庫的新型酯酶基因(est825)進(jìn)行體外定向進(jìn)化，獲得了一個(gè)酶活性和熱穩(wěn)定性均提高的突變酶(EstM46)。與野生型相比其酶活力提高1.5倍；最適反應(yīng)溫度提高了5 ℃，同時(shí)熱穩(wěn)定性明顯增強(qiáng)。此外，EstM46對氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊酯的降解率分別提升至92.21%、99.75%、93.21%和89.48%。這對降低酶的生產(chǎn)成本、促進(jìn)工業(yè)化發(fā)展和環(huán)境保護(hù)有重要意義。

擬除蟲菊酯；農(nóng)藥降解酶；定向進(jìn)化；生物降解

擬除蟲菊酯作為高效、低毒，環(huán)境友好型農(nóng)藥，在世界范圍內(nèi)得到了廣泛的應(yīng)用，但其對生態(tài)環(huán)境和人類健康帶來的危害也逐漸顯現(xiàn)出來。因而，菊酯類農(nóng)藥的殘留問題越來越受到人們的重視。生物法尤其是生物酶類，在處理擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的殘留時(shí)，具有操作簡單、安全高效、應(yīng)用范圍廣且無二次污染等優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為菊酯類農(nóng)藥殘留生物修復(fù)的研究熱點(diǎn)。國內(nèi)外的科學(xué)研究者們利用基因工程手段從環(huán)境中篩選到各種菊酯類農(nóng)藥降解酶基因，并構(gòu)建了異源表達(dá)工程菌，獲得具有降解譜廣、降解能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)的降解酶，為微生物降解農(nóng)藥開辟了新的途徑[1-5]。但這些已開發(fā)的工程酶一般存在穩(wěn)定性差和非天然底物或環(huán)境下的催化能力低等限制條件，不能滿足工業(yè)生產(chǎn)需求。定向進(jìn)化技術(shù)無需對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系、催化機(jī)制等因素進(jìn)行研究，直接對酶基因進(jìn)行突變，再結(jié)合高通量篩選方法獲得新功能酶，成為天然酶突破自身因素限制的重要工具[6-8]。為獲得穩(wěn)定、高度專一性以及對非天然底物催化能力強(qiáng)的新功能酶指明了新的方向。

當(dāng)前，在核酸分子水平利用分子定向改造手段對宏基因組學(xué)技術(shù)來源的新型菊酯類降解酶基因進(jìn)行改造的研究報(bào)道還很少見。因而，本研究利用易錯(cuò)PCR技術(shù)對本實(shí)驗(yàn)室從海底泥宏基因組文庫中篩選到的酯酶基因est825進(jìn)行體外定向進(jìn)化，結(jié)合高通量的篩選方法，以期獲得穩(wěn)定性好、酶活性高的突變酶，為生產(chǎn)低成本、高質(zhì)量的菊酯類農(nóng)藥降解酶制劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒用卡 宿主菌E.coliBL21(DE3), (Novagen)；載體pET-28a(+), (Novagen)和含酯酶基因的質(zhì)粒pUC118-est825由本實(shí)驗(yàn)室保存；

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，用蒸餾水定容至1 L，121 ℃滅菌20 min。固體培養(yǎng)基即加入w=1.5%～2%的瓊脂粉；

SOC培養(yǎng)基：胰蛋白胨2 g，酵母提取物0.5 g，氯化鈉0.05 g，氯化鉀0.018 6 g，氯化鎂0.095 g，蒸餾水溶解并定容至80 mL，葡萄糖0.36 g，蒸餾水溶解并定容至20 mL，115 ℃滅菌25 min，將兩種溶液混合，按900 μL/管分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 酶和試劑 胰蛋白胨、酵母提取物購于OXOID公司(英國)，硫酸卡那霉素(Kana)、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)、5-溴-4-氯-3-吲哚辛酯(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl caprylate, X-caprylate)均為進(jìn)口分裝，購于北京普博欣生物科技有限公司；引物合成和基因測序由上海英駿生物技術(shù)有限公司廣州實(shí)驗(yàn)室完成；氣相色譜法測定殘留農(nóng)藥降解率由東莞市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究中心完成。各種限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、低相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)購于寶生物(大連)工程有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒，核酸定量標(biāo)準(zhǔn)購于廣州東盛生物科技有限公司；蛋白純化試劑盒(His·Bind?Purification Kit)購于Novagen公司(德國)；易錯(cuò)PCR突變試劑盒(GeneMorh?II Random Mutagenesis Kit)購于Stratagene公司(美國)；凝膠回收試劑盒和連接產(chǎn)物回收試劑盒購于Omega公司(美國)。

1.2 方法

1.2.1 易錯(cuò)PCR 擴(kuò)增與突變文庫的構(gòu)建 根據(jù)est825基因序列設(shè)計(jì)引物Mut-F：5′- GCCATGGCTGATATCGGATCC ATGAGTGAGCTGACATCAATCTCCG -3′ (下劃線部分為BamHⅠ酶切位點(diǎn))；Mut-R：

5′-TTCAAGTTCAGACT CAAGCTTTCAGGGGGCCAGCAACTC -3′ (下劃線部分為HindⅢ酶切位點(diǎn))。以含pUC18-est825質(zhì)粒為模板，用GeneMorh?Ⅱ Random Mutagenesis Kit進(jìn)行易錯(cuò)PCR 擴(kuò)增。每100 μL 反應(yīng)體系為：10 μL 10×易錯(cuò)PCR 緩沖液；2 μL 10 × dNTP 混合物(40 mmol/L)；引物Mut-F和Mut-R各5 ng；500 ng(以目的基因計(jì))質(zhì)粒DNA模板；2 μL Mutazyme Ⅱ DNA Polymerase (2.5 U/μL)，再加入滅菌的超純水至總體積為100 μL。PCR 程序?yàn)椋?5 ℃ 2 min；95 ℃ 1 min，65 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

將PCR 產(chǎn)物以w=1.0%的瓊脂糖凝膠電泳，用PCR 純化回收試劑盒進(jìn)行純化回收。純化后的易錯(cuò)PCR 產(chǎn)物酶切后與經(jīng)同樣酶切處理的pET-28a 載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)超級感受態(tài)細(xì)胞，涂布固體LB(含50 μg/mL 的Kana)平板，挑選具有插入片段的克隆，組成突變體庫。

1.2.2 陽性克隆的篩選和鑒定 首先將所有轉(zhuǎn)化子點(diǎn)種于種子板(含Kana 50 μg/mL)和誘導(dǎo)板(含50 μg/mL Kana、24 μg/mL IPTG)中，37 ℃培養(yǎng)48 h，取出誘導(dǎo)板，在菌落周圍滴加底物X-caprylate測試液進(jìn)行初篩，酯酶可將該測試液從無色水解為藍(lán)色化合物，若變藍(lán)則為陽性克隆子，酶活性越高，顏色越深；然后將初篩時(shí)顯色深的突變克隆子，接種于LB液體培養(yǎng)基(含50 μg/mL Kana、1 mmol/L IPTG)中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，收集菌體并超聲波破碎，獲得粗酶液；用ρNPE法[9]檢測其酶活性，同時(shí)做野生型酯酶對照，將酶活性提高的突變子送交測序，對測序結(jié)果與原序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

1.2.3 蛋白質(zhì)含量測定及突變酶的酶學(xué)性質(zhì)研究 誘導(dǎo)的菌體經(jīng)破碎后用蛋白純化試劑盒進(jìn)行純化。純化后的蛋白質(zhì)含量采用Bradford 法[10]進(jìn)行測定并用于酶學(xué)性質(zhì)的測定。

1.2.4 突變酶的結(jié)構(gòu)預(yù)測和突變位點(diǎn)分析 將突變酯酶和野生型酯酶的氨基酸序列提交至SWISS-MODEL在線分析服務(wù)器(https:∥www.swissmodel.expasy.org/interactive)，將反饋的模擬結(jié)果用DeepWIEW軟件分析結(jié)構(gòu)，推測氨基酸突變在酶蛋白空間結(jié)構(gòu)中的位置以及對酶蛋白功能可能造成的影響。

1.2.5 擬除蟲菊酯農(nóng)藥的降解能力測定 選取農(nóng)產(chǎn)品中易超標(biāo)的氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊酯為降解對象，用GC-2010氣相色譜儀(日本島津公司)進(jìn)行定量分析，測定突變酶EstM46對擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的降解能力。具體方法：吸取1 mL標(biāo)準(zhǔn)農(nóng)藥(4 mg/mL)溶液，加入3 mL酯酶酶液，每種農(nóng)藥做5個(gè)平行，以滅活酶液為空白對照；37 ℃水浴反應(yīng)60 min，按1∶2(V/V)的比例在待測樣品中加入正己烷，并加入4 g無水硫酸鈉，在恒溫?fù)u床上振蕩20 min (200 r/min)，8 000 r/min離心5 min，準(zhǔn)確吸取1 μL用GC-2010氣相色譜儀(日本島津公司)進(jìn)行定量分析。檢測條件：GC-2010氣相色譜儀：ECD檢測器，RestekRTX-5色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。分流進(jìn)樣，分流比60∶1；進(jìn)樣量1.0 μL；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；柱流量：2.0 mL/ min；恒壓方式，柱前壓為50 kPa；載氣為高純氮?dú)?純度>99.999%)，流速40 mL/ min；柱箱程序升溫：150 ℃，保持1 min，以30 ℃/ min的速度上升至270 ℃，保持10 min；ECD檢測器溫度300 ℃，電流1 nA；尾吹流量30 mL/ min。農(nóng)藥降解率計(jì)算：

式中，A0為對照組中農(nóng)藥濃度；A1為實(shí)驗(yàn)組中農(nóng)藥濃度。

2 結(jié) 果

2.1 突變酯酶基因的易錯(cuò)PCR產(chǎn)物檢測

利用突變引物Mut-F和Mut-R擴(kuò)增得到突變酯酶基因片段，w=1%的瓊脂糖凝膠電泳分析其大小約825 bp (見圖1)。

圖1 酯酶基因est825易錯(cuò)PCR產(chǎn)物電泳分析Fig.1 The electrophoresis analysis of ep-PCR products of esterase gene est825M: DNA maker DL2000; Lane 1: est825的易錯(cuò)PCR產(chǎn)物

2.2 隨機(jī)突變文庫的構(gòu)建

經(jīng)轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)，生長出約10 000個(gè)轉(zhuǎn)化子。隨機(jī)挑取16株陽性突變株，提取質(zhì)粒并用HindⅢ和BamHⅠ雙酶切，凝膠電泳分析如圖2，93.75%的轉(zhuǎn)化子都插入了隨機(jī)突變的酯酶基因。

圖2 質(zhì)粒酶切驗(yàn)證隨機(jī)突變庫陽性轉(zhuǎn)化子Fig.2 The identification to recombinant plasmid from random mutation libraries by restriction digestionM1: DL 15 000; M2:DL 2 000; Line 1-16: 陽性克隆子質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物

圖3 易錯(cuò)PCR文庫轉(zhuǎn)化子的初篩Fig.3 The primary screening for transformants from EP-PCR

2.3 隨機(jī)突變子的篩選

2.3.1 初篩 插入隨機(jī)突變酯酶基因片段的陽性克隆子，經(jīng)誘導(dǎo)后滴加X-caprylate測試液，結(jié)果見圖3。經(jīng)統(tǒng)計(jì) (見圖4)，只有約5%的突變子產(chǎn)生正突變，其余突變子表現(xiàn)為酶活性未發(fā)生變化(20%)、酶活性降低(25%)和無酶活性(50%)。

圖4 陽性轉(zhuǎn)化子突變結(jié)果統(tǒng)計(jì)Fig.4 Statistics profile of the mutants from EP-PCR+++: 酶活性較高; ++: 酶活性正常; +:酶活性較低; -: 無酶活性

2.3.2 隨機(jī)突變子的復(fù)篩 挑取初篩得到的酯酶活性提高的突變子，誘導(dǎo)培養(yǎng)后超聲波破碎獲得粗酶液，用ρNPE法檢測其酯酶活性，同時(shí)以野生酯酶為對照。最終篩選得到一株酶活性提高的1.5倍突變子M46，經(jīng)SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳分析，該突變子所表達(dá)的酯酶蛋白相對分子質(zhì)量和表達(dá)量分別與野生型酶相同和相當(dāng)(見圖5)。

圖5 SDS-PAGE電泳分析突變酶和野生酯酶Fig.5 SDS-PAGE of wild type and mutant esteraseM：低相對分子質(zhì)量蛋白標(biāo)準(zhǔn) (TaKaRa); Lane 1：無插入片段載體對照; Lane 2：野生型酯酶Est825蛋白; Lane 3：突變酶EstM46蛋白

2.4 突變酶的誘導(dǎo)表達(dá)和分離純化

重組菌株經(jīng)30 ℃，1.0 mmol/LIPTG誘導(dǎo)8 h，離心收集菌體，用緩沖液洗滌菌體并超聲波破碎細(xì)胞，收集上清液即為粗酶液。用His·Bind?Purification Kit (Novagen)純化粗酶液，所得產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳檢測，結(jié)果見圖6，其相對分子質(zhì)量約為34 100(其中包含4 000的融合標(biāo)簽)。用Bradford法定量顯示其最高表達(dá)量可達(dá)200 mg/L。使用Quantity One軟件(Bio-Rad公司，美國)對蛋白電泳結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果表明重組蛋白含量占細(xì)胞內(nèi)全部可溶性蛋白的45%。

圖6 重組酯酶EstM46的SDS-PAGE電泳圖Fig.6 SDS-PAGE analysis of recombinant estase EstM46 M：低相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白(TaKaRa); Lane 1：純化前的重組蛋白EstM46; Lane 2：純化后的重組蛋白EstM46

2.5 突變酶的酶學(xué)性質(zhì)分析

2.5.1 突變酯酶EstM46的最適反應(yīng)溫度 在不同溫度下對突變酶EstM6的酶活性進(jìn)行測定，以酶活性最高為100%，計(jì)算相對酶活，結(jié)果如圖7所示，突變酶的最適反應(yīng)溫度為45 ℃，與野生酶的酶活性比較，提高5 ℃，且突變酶溫度>45 ℃時(shí)具有較好的水解能力。

圖7 溫度對野生酯酶(■)和突變酯酶(○)酶活性的影響Fig.7 Effect of pH on the activity of wild type and mutated esterases

2.5.2 突變酯酶EstM46的溫度穩(wěn)定性 將突變酶EstM46置于不同溫度下保溫5 h，每隔1 h取樣，45 ℃下測定殘余酶活性，結(jié)果如圖8所示，該酶在60 ℃保溫5 h后剩余75%以上的酶活性，且在70 ℃保溫2 h后仍剩余約80%左右的酶活性。因此，突變酶的熱穩(wěn)定性明顯提高。

圖8 溫度對野生酯酶和突變酯酶穩(wěn)定性的影響Fig.8 Effect of temperature on the stability of wild type and mutated esterases■：野生酶, 45 ℃; □：野生酶, 60 ℃; ○：野生酶, 70 ℃;●：突變酶, 60 ℃; ▽：突變酶, 45 ℃; ▲：突變酶, 70 ℃

2.5.3 突變酯酶EstM46的最適反應(yīng)pH值及pH穩(wěn)定性 取等量的突變酶EstM6置于不同緩沖體系中，45 ℃反應(yīng)4 min，以對硝基苯酚乙酸酯為底物，酶活性最高為100%，測定突變酶的最適反應(yīng)pH值。如圖9所示，突變酶和野生酶相比，在pH值介于7.0～8.5之間時(shí)具有較好的催化活力。

圖9 pH對野生酯酶(□)和突變酯酶(▲)酶活性的影響Fig.9 Effect of pH on the activity of wild type and mutant esterases

取等量突變酶置于不同pH值的緩沖液體系中，室溫下放置2 h，用對硝基苯酚乙酸酯為底物，45 ℃反應(yīng)4 min，以酶活性最高為100%，測定其pH穩(wěn)定性。圖10所示，與野生酶相比，突變酶的pH穩(wěn)定性無明顯變化。

圖10 pH對野生酯酶(●)和突變酯酶(□)穩(wěn)定性的影響Fig.10 Effect of pH on the stability of wild type and mutant esterases

2.5.4 突變酯酶EstM46擬除蟲菊酯農(nóng)藥的降解能力測定 將3 mL突變酶EstM46與1 mL 4 mg/L的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)液混合，37 ℃反應(yīng)60 min，用正己烷提取剩余農(nóng)藥，取1 μL測定氣相色譜分析，根據(jù)測定色譜峰(圖11)計(jì)算回收率和降解率(如表1)，每組5個(gè)平行。結(jié)果表明突變酶EstM46對4種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的降解率均有不同程度的提高，分別達(dá)到92.21%、99.75%、93.21%和89.48%。

圖11 氣相色譜分析突變酯酶EstM46對降解擬除蟲菊酯的降解能力Fig.11 Pyrethroids degradation ability analysis of mutant esterase EstM46 by gas chromatography

2.6 突變子M46的生物信息學(xué)分析

2.6.1 突變子M46堿基序列突變分析 NCBI的Blast軟件(http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)將M46測序結(jié)果和野生酶的堿基序列進(jìn)行同源性比對，結(jié)果顯示在estm46基因825 bp的堿基序列內(nèi)部共發(fā)生2個(gè)堿基突變(T105A, C232G)，符合低突變率的要求。

2.6.2 突變酯酶EstM46的氨基酸序列分析、結(jié)構(gòu)預(yù)測和突變位點(diǎn)分析 利用Clustal X軟件將得到的突變酶EstM46的氨基酸序列與Est825的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對，結(jié)果如圖12所示，突變酯酶和野生型酯酶相比，只在78位上發(fā)生了一個(gè)氨基酸突變(由P變?yōu)锳，▲所示)，并未發(fā)生在Est825中保守的GXSXG五聯(lián)體(方框中)氨基酸殘基中。

表1 突變酯酶EstM46對擬除蟲菊酯的降解率Table 1 Pyrethroids degradation rate of EstM46 mg·L-1

圖12 突變酯酶EstM46氨基酸序列分析Fig.12 The amino acid sequence analysis of mutant esterase EstM46

圖13 野生酶與突變酶蛋白的三維結(jié)構(gòu)計(jì)算機(jī)模擬圖Fig.13 Ribbon representation of wild and mutanted esterase 3D structure modeled by computer modeling, with the mutated residue highlighted in red

2.6.3 突變酯酶EstM46蛋白結(jié)構(gòu)的預(yù)測 采用DeepVIEW軟件分析服務(wù)器反饋結(jié)果，突變酶EstM46(圖13b)以單亞基蛋白的形式存在，其突變位點(diǎn)發(fā)生于表面的無規(guī)則卷曲中(箭頭所示)，與其活性中心(方框內(nèi))相距較遠(yuǎn)，且突變后的EstM46蛋白與Est825(圖13a)蛋白的三維結(jié)構(gòu)基本一致，主要原因可能是突變的位點(diǎn)并非發(fā)生在構(gòu)成蛋白骨架的關(guān)鍵氨基酸殘基上，另外，Gly是唯一不含手性碳原子的氨基酸，不具有旋光性，在蛋白質(zhì)中提供的空間位阻最小，容易形成靈活的轉(zhuǎn)角，而Pro的R基的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不易轉(zhuǎn)動，產(chǎn)生轉(zhuǎn)角方式的靈活性較差。因此，我們推測由Pro突變成Ala賦予了蛋白更加靈活的構(gòu)象變化能力，進(jìn)而導(dǎo)致氫鍵、疏水性、底物親和力等一系列的變化，使得酶活性及熱穩(wěn)定性的提高。

3 討 論

3.1 易錯(cuò)PCR

易錯(cuò)PCR技術(shù)以其相對簡單、快速、廉價(jià)等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于小片段基因的定向進(jìn)化中，其通過不斷積累小的有益突變，達(dá)到較大的突變效益，在提高酶活性，改善酶學(xué)性質(zhì)和研究酶分子結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系中，發(fā)揮重要作用[11]。本研究利用變異并缺乏修復(fù)功能的Taq酶，有效地減少突變中的熱點(diǎn)變異，只需控制模板中酯酶基因est825量為500 ng，經(jīng)過30個(gè)循環(huán)，得到的突變堿基個(gè)數(shù)介于2～4之間，并得到一個(gè)酶活性提高1.5倍的突變酶，其發(fā)生2個(gè)堿基突變，并導(dǎo)致一個(gè)氨基酸殘基的變化，是一種行之有效的隨機(jī)突變方法。

3.2 氨基酸突變對酶分子的影響機(jī)制

Morley等[12]認(rèn)為隨機(jī)突變中大多數(shù)酶學(xué)性質(zhì)如立體選擇性、底物特異性和新催化活性的變化與發(fā)生突變的氨基酸位點(diǎn)關(guān)系密切，突變位點(diǎn)與活性中心距離的遠(yuǎn)近，在酶活性、熱穩(wěn)定性和有機(jī)溶劑耐受性的變化中，具有同等作用。Voigt等[13]認(rèn)為，低突變率的隨機(jī)突變較易發(fā)生蛋白表面和環(huán)狀區(qū)域上，本研究中獲得酶活性提高1.5倍的突變酶，其堿基序列中發(fā)生了兩個(gè)堿基轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致第78位氨基酸突變，對突變酶EstM46的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬，突變發(fā)生在蛋白表面的環(huán)狀區(qū)域中，遠(yuǎn)離活性中心位點(diǎn)，該突變位點(diǎn)并未影響酶的空間結(jié)構(gòu)，這可能是由于該位點(diǎn)并不參與維持酶蛋白空間骨架結(jié)構(gòu)。此外，突變酶的最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性均得到提高，可能是由于突變導(dǎo)致酶分子表面的氫鍵或疏水性改變，使其在高溫下保持良好的催化能力[14]。另外，本研究中采用平板顯色法，在滴加X-caprylate測試液后，只需通過肉眼觀察顏色變化，即可簡單快速地完成對突變文庫的高通量初篩；復(fù)篩時(shí)采用標(biāo)準(zhǔn)誘導(dǎo)培養(yǎng)和酶活性檢測方法，提高了篩選結(jié)果的可信性。該方法不僅快速、簡單、準(zhǔn)確的完成對突變文庫篩選，還減少篩選的工作量和工作強(qiáng)度，可以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模篩選。

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Molecular modification and degradation characteristics of a novel marine mud-derived pyrethroid hydrolase

LIU Xiaolong1,2, LIU Yuhuan2, FAN Xinjiong1,2

(1. School of Basic Medical Sciences, Anhui Medical University, Hefei 230032, China; 2. School of Life Sciences, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275, China)

In order to enhance the activity of pyrethroid degrading enzyme, error prone PCR technology was used to modify a novel esterase gene (est825) which was derived from marine sediment metagenomic library. A mutant enzyme EstM46 was cloned and characterized. The activity of EstM46 was 1.5-fold higher than wild type (Est825), and the optimum temperature was 5 degrees higher than that of Est825. Furthermore, the mutant enzyme stayed stable up to 70 ℃, remaining 80% (50% with Est825) of its activity after incubated at 70 ℃ for 2 h. The hydrolysis rates of cyhalothrin, cypermethrin, sumicidin and deltamethrin were 92.21%, 99.75%, 93.21% and 89.48%, respectively. A broad-spectrum pyrethroid-degrading enzyme with higher hydrolytic activity and more thermostability will play a better role in practical biodegradation.

pyrethroids； pesticide degradation enzyme； directed evolution； biological degradation

10.13471/j.cnki.acta.snus.2017.04.018

2016-09-05 基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(31400680)；安徽醫(yī)科大學(xué)博士啟動基金(XJ201322)；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2012B010300021, 2013B010404044)；廣東省教育項(xiàng)目(2013KJCX0107)

劉孝龍(1985年生)，男；研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)；E-mail：liuxiaolong85@126.com

范新炯(1985年生)，女；研究方向：微生物學(xué)；E-mail：fanxinjiong@126.com

Q556+.1

A

0529-6579(2017)04-0111-07