番鴨基因多態(tài)性與羽毛相關(guān)性分析

董飚 秦豪榮 徐琪 李曉鳴 紀(jì)榮超 王健

摘要：為探討黑素皮質(zhì)素受體1（melanocortin-1 receptor，簡(jiǎn)稱MC1R）基因?qū)Ψ営鹕挠绊?，采用PCR和直接測(cè)序法對(duì)番鴨[WTBX][STBX]MC1R[WTBZ][STBZ]基因編碼區(qū)進(jìn)行多態(tài)性分析，比較不同羽色番鴨群體遺傳參數(shù)和基因型分布卡方檢驗(yàn)。結(jié)果表明：在番鴨[WTBX][STBX]MC1R[WTBZ][STBZ]基因編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)G274A、G279A、C485A突變，使第92處氨基酸由谷氨酸（E）變?yōu)橘嚢彼幔↘），第162處的氨基酸由蘇氨酸（T）變?yōu)樘於彼幔∟）。通過各個(gè)位點(diǎn)不同羽色番鴨群體基因型、等位基因頻率的比較分析，同時(shí)結(jié)合不同群體間基因型分布卡方檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在第279處的G-A突變中白羽番鴨僅有GG型，而其他3個(gè)攜帶大量黑羽的番鴨群體都以GA、AA型存在；同時(shí)全白番鴨與其他3個(gè)番鴨群體之間卡方值最大，推測(cè)此位點(diǎn)對(duì)番鴨的羽色影響較大。而從其他2個(gè)突變位點(diǎn)的數(shù)據(jù)分析推測(cè)，它們對(duì)番鴨的羽色幾乎沒有影響。研究結(jié)果為開展番鴨羽色研究和育種工作奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：番鴨；[WTBX][STBX]MC1R[WTBZ][STBZ]基因；羽色；多態(tài)性；相關(guān)性分析

中圖分類號(hào)： S834+.892 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）10-0024-03[HS）][HT9.SS]

番鴨是優(yōu)良的肉鴨品種，原產(chǎn)于南美洲和中美洲的熱帶地區(qū)，具有生長(zhǎng)速度快、瘦肉率高等特點(diǎn)。在我國(guó)番鴨已有200多年的養(yǎng)殖歷史，開始以農(nóng)戶散養(yǎng)所占比例較大，現(xiàn)在已逐漸形成規(guī)模化養(yǎng)殖。除了純白羽番鴨外，國(guó)內(nèi)還有很多黑羽番鴨，白羽和黑羽交叉存在，有些有規(guī)律，如有些黑羽番鴨僅在頭或翅膀部位存在白羽，其他部位均為黑羽，有些幾乎全為黑羽。通過常規(guī)的育種手段想選育成全黑羽番鴨是很難的，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，功能基因的作用機(jī)理也逐漸被挖掘。研究表明，禽類羽色是個(gè)多基因控制的性狀，遺傳復(fù)雜，基因間有顯隱性、互作、上位等關(guān)系，要想準(zhǔn)確控制番鴨的羽色是一個(gè)比較大的難題。

黑素皮質(zhì)素受體1（melanocortin-1 receptor，簡(jiǎn)稱MC1R）基因的編碼區(qū)只含有1個(gè)外顯子，不同動(dòng)物可編碼氨基酸的數(shù)量不同，一般長(zhǎng)度為310個(gè)，是最小的G蛋白耦合受體，具有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域[1]。它通過與內(nèi)源配體促黑激素結(jié)合來(lái)促進(jìn)腺苷酸環(huán)化酶的活化，提高環(huán)腺苷酸水平，激發(fā)酪氨酸酶水平的提高，導(dǎo)致黑色素的形成，實(shí)現(xiàn)對(duì)動(dòng)物膚色、毛色或羽色的調(diào)控[2-3]。目前已知一些[WTBX][STBX]MC1R[WTBZ][STBZ]基因變異可引起動(dòng)物黑色素形成的變化以及毛色/羽色的變異，師科榮等通過分析我國(guó)11個(gè)地方豬種和3個(gè)國(guó)外引入豬種的[WTBX][STBX]MC1R[WTBZ][STBZ]基因多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)僅從[WTBX][STBX]MC1R[WTBZ][STBZ]基因上發(fā)生的突變看，我國(guó)地方豬種的毛色與引入豬種毛色分屬截然不同的遺傳體系，我國(guó)地方豬種的毛色屬于顯性黑毛色體系，而且該基因?qū)ξ覈?guó)地方豬種毛色的差異沒有起到關(guān)鍵的影響作用[4]。Deng等發(fā)現(xiàn)[WTBX][STBX]MC1R[WTBZ][STBZ]基因一個(gè)突變位點(diǎn)與我國(guó)地方豬種的黑毛色有關(guān)[5]。唐賀等分析了3個(gè)地方黃牛群體和1個(gè)引進(jìn)品種的[WTBX][STBX]MC1R[WTBZ][STBZ]基因編碼區(qū)的變異情況發(fā)現(xiàn)，該基因E座位對(duì)牛的毛色有重要影響，E+和ED等位基因與黑色表型有關(guān)，而e等位基因與紅色表型有關(guān)，但黃色、棕色和紅色表型還與其他座位基因相關(guān)聯(lián)[6]。楊永升等以絲羽烏骨雞與明星肉雞為親本建立的資源家系群體雞來(lái)檢測(cè)[WTBX][STBX]MC1R[WTBZ][STBZ]基因編碼區(qū)的多態(tài)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些突變位點(diǎn)與雞的膚色、脛色、肉色等性狀有關(guān)，推測(cè)[WTBX][STBX]MC1R[WTBZ][STBZ]基因可能是雞黑色素性狀的主效基因或者與雞控制黑色素性狀的主效基因連鎖[7]。[WTBX][STBX]MC1R[WTBZ][STBZ]基因A356G處的突變是控制他留烏骨雞羽色的一個(gè)關(guān)鍵變異位點(diǎn)[8]。另外，還有很多關(guān)于動(dòng)物[WTBX][STBX]MC1R[WTBZ][STBZ]基因突變的報(bào)道，但是沒有與毛色/羽色進(jìn)行相關(guān)分析，或者有些突變與動(dòng)物毛色/羽色無(wú)關(guān)。

在此基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)擬運(yùn)用PCR和直接測(cè)序技術(shù)檢測(cè)不同羽色番鴨[WTBX][STBX]MC1R[WTBZ][STBZ]基因的突變位點(diǎn)，分析不同羽色番鴨群體[WTBX][STBX]MC1R[WTBZ][STBZ]基因的基因型頻率、等位基因頻率以及遺傳參數(shù)等數(shù)據(jù)，為番鴨羽色研究提供參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物

分別采集全黑（簡(jiǎn)稱QH，指所有羽毛幾乎為黑色，部分會(huì)在翅膀部位出現(xiàn)1～2根白羽）、白翅（簡(jiǎn)稱BC，翅膀一半以上為白色，其他部位幾乎為黑色）、白頭（簡(jiǎn)稱BT，頭部羽毛為白色，夾雜少量黑羽，其他部位均為黑色）和全白（簡(jiǎn)稱QB，全身白羽）番鴨血樣各60個(gè)，用肝素鈉抗凝，離心留取血紅細(xì)胞，用常規(guī)酚/氯仿抽提法提取番鴨基因組DNA，并溶于蒸餾水中，用核酸濃度測(cè)定儀檢測(cè)其濃度和純度，然后稀釋成50～100 ng/μL備用。

1.2引物設(shè)計(jì)[JP+1]

根據(jù)GenBank中公布的鴨[WTBX][STBX]MC1R[WTBZ][STBZ]基因序列（EU877264）設(shè)計(jì)了1對(duì)引物P1，P1上游序列為F：5′-CGACGTGCCCAACGAAC-3′，下游序列為R：5′-CTGGCTCCGGAAGGCATAGAT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為793 bp，退火溫度為58 ℃。[JP]

1.3PCR擴(kuò)增反應(yīng)

PCR反應(yīng)體積為25 μL，10×PCR buffer（Mg2+ 15 mmol/L） 2.5 μL、10 mmol/L dNTPs 2 μL、10 pmol/L上下游引物各1 μL、5 U/μL Taq酶0.2 μL、100 ng/μL DNA模板1 μL，加蒸餾水補(bǔ)足至25 μL。

1.4測(cè)序

擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)符合預(yù)期結(jié)果的PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠純化回收，將純化產(chǎn)物直接送公司測(cè)序，將不同個(gè)體的測(cè)序結(jié)果用DNAMAN軟件進(jìn)行比較，即可獲得[WTBX][STBX]MC1R[WTBZ][STBZ]基因在番鴨群體中存在的差異。

[HTK]1.5數(shù)據(jù)處理[HT]

運(yùn)用遺傳學(xué)統(tǒng)計(jì)公式計(jì)算基因型頻率、等位基因頻率、純合度、雜合度和多態(tài)信息含量，并分析基因型在不同羽色番鴨群體中分布的差異性。

2結(jié)果與分析

2.1測(cè)序和基因型識(shí)別

將不同個(gè)體測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，在擴(kuò)增的片段中存在3個(gè)突變位點(diǎn)，分別為編碼區(qū)第274、279、485處的G-A、G-A和C-A突變（圖1箭頭標(biāo)記處），其中第274處突變導(dǎo)致氨基酸由谷氨酸（E）變?yōu)橘嚢彼幔↘），第485處突變導(dǎo)致氨基酸由蘇氨酸（T）變?yōu)樘於彼幔∟），第279處的突變沒有引起氨基酸序列發(fā)生變化。[FL）]

基因第274處G-A突變形成了GG、GA、AA型，全黑番鴨群體以GA、AA型為主，白翅番鴨以AA型為主，白頭番鴨以GG型為主，全白番鴨3種基因型較為接近。全黑和白翅番鴨群體中以A等位基因?yàn)橹鳎壮岱喨后w中幾乎均為A等位基因，白頭番鴨群體以G等位基因?yàn)橹鳎追喨后w2個(gè)等位基因頻率較為接近。在4個(gè)番鴨群體中，全白番鴨的雜合度和多態(tài)信息含量最高，分別為0.499 4、0.374 7；全黑番鴨群體雜合度為0.383 2，多態(tài)信息含量為0309 8；白翅和白頭番鴨群體雜合度和多態(tài)信息含量較低（表2.3G279A位點(diǎn)遺傳信息分析

基因第279處G-A突變形成了GG、GA、AA型，全白番鴨群體只存在GG型，其他3種番鴨群體均只存在GA型、AA型，白翅、白頭番鴨群體以AA型為主，全黑番鴨群體GA型和AA型較為接近。全黑、白翅和白頭番鴨群體均以A等位基因頻率為主，其中白翅番鴨A等位基因頻率最高。4個(gè)番鴨群體中，全黑的雜合度和多態(tài)信息含量最高，白頭番鴨群體次之（表3）。

由表4可知，4個(gè)番鴨群體之間基因型分布存在極顯著差異，其中以白頭番鴨和白翅番鴨之間差異最小，全白番鴨和其他3個(gè)羽色番鴨的差異最大。

2.4G485A位點(diǎn)遺傳信息分析

基因第485處C-A突變形成了CC、CA、AA型，4個(gè)番鴨群體均以CC型為主，白翅番鴨群體只有CC型，全黑和白頭番鴨群體只有CC型和CA型。所有群體中，均以C等位基因頻率為主。全白番鴨群體雜合度和多態(tài)信息含量最高，分別為0.420 0、0.331 8，白頭番鴨群體次之（表5）。

由表6可知，4個(gè)番鴨群體之間基因型分布存在顯著差異，[JP3]部分群體之間基因型分布存在極顯著差異，其中以白翅番鴨和全黑番鴨之間差異最小，白翅番鴨和全白番鴨之間差異最大。[JP]

識(shí)別位點(diǎn)，該位點(diǎn)為同義突變，通過分析發(fā)現(xiàn)，A399G位點(diǎn)與羽色沒有顯著性相關(guān)，但是番鴨基因型全為AA型，家鴨的基因型全為GG型，半番鴨幾乎均為AG型，從而推斷該位點(diǎn)可以有效鑒定和區(qū)分家鴨、白番鴨和半番鴨3類鴨群體[9-10]。本研究通過PCR、測(cè)序方法檢測(cè)了[WTBX][STBX]MC1R[WTBZ][STBZ]基因在不同羽色番鴨群體中存在單核苷酸突變情況，通過序列比對(duì)，在編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)3處突變，分別位于第274、279、485處的G-A、G-A、C-A 突變，第274處和第485處的突變使得這2處的氨基酸序列發(fā)生了變化，分別為谷氨酸（E）變?yōu)橘嚢彼幔↘）和蘇氨酸（T）變?yōu)樘於彼幔∟），這與夏波報(bào)道的在此區(qū)間發(fā)現(xiàn)的9個(gè)多態(tài)位點(diǎn)[11]相比要少一些，而且部分位點(diǎn)突變還不一樣，這可能與試驗(yàn)所用的番鴨群體不同而存在差異。

為了解這些突變是否與番鴨羽色有關(guān)，本研究還分析了不同羽色番鴨各個(gè)突變位點(diǎn)的基因型頻率和基因型分布卡方檢驗(yàn)。在第274處的G-A突變位點(diǎn)，全黑和白翅番鴨中不存在GG型，而白頭番鴨幾乎都是GG型，全白番鴨3個(gè)基因型頻率差不多。4個(gè)群體不同基因型分布卡方檢驗(yàn)，雖然不同群體之間基因型分布存在極顯著差異，但是白頭番鴨與全黑番鴨、白翅番鴨的卡方檢驗(yàn)值較大，全白番鴨與其他3個(gè)群體的卡方檢驗(yàn)值次之，推測(cè)此位點(diǎn)對(duì)羽色影響不大，這與夏波報(bào)道的結(jié)果不同，他認(rèn)為該位點(diǎn)與番鴨羽毛顏色差異有關(guān)，這可能與試驗(yàn)番鴨群體所用樣品量（2羽白羽番鴨、2羽黑羽番鴨）較少有關(guān)[11]。在第279處的G-A突變位點(diǎn)，3個(gè)攜帶了黑羽的番鴨群體都以GA、AA型存在，而全白番鴨以GG型存在，結(jié)合不同番鴨群體之間基因型分布卡方檢驗(yàn)值，全白番鴨與其他3個(gè)番鴨群體之間卡方值最大，推測(cè)此位點(diǎn)對(duì)番鴨的羽色影響較大。在第485處的C-A突變位點(diǎn)，白翅番鴨以CC型存在，全黑番鴨和白頭番鴨以CC型和CA型存在，全白番鴨3種基因型都存在，所有群體都以CC型頻率最高，結(jié)合不同群體番鴨基因型分布卡方檢驗(yàn)，4個(gè)番鴨群體之間基因型分布卡方檢驗(yàn)值差異與羽色沒有明顯關(guān)系，推測(cè)此位點(diǎn)對(duì)羽色影響不大。由此可以推測(cè)，[WTBX][STBX]MC1R[WTBZ][STBZ]基因的突變位點(diǎn)不一定都會(huì)影響番鴨的羽毛顏色。

純合度、雜合度、多態(tài)性信息含量（polymorphic information content，簡(jiǎn)稱PIC）是群體遺傳參數(shù)分析常用數(shù)據(jù)，其中雜合度和PIC可用來(lái)衡量基因多態(tài)性豐富程度和群體遺傳變異水平的高低。本試驗(yàn)所用4個(gè)群體在不同突變位點(diǎn)其雜合度和PIC差異較大，這與每個(gè)位點(diǎn)的基因型種類和雜合子的比例有關(guān)。如果群體基因型種類單一，雜合子的比例少，則群體的雜合度、PIC就偏低。通過雜合度和PIC分析可知，群體在某個(gè)突變位點(diǎn)的遺傳變異程度，如果雜合度和PIC值都偏大，則說(shuō)明群體保持了良好的遺傳信息，可選擇的范圍廣泛；反之，則遺傳信息小，可選擇的范圍也比較窄。

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