丹酚酸B對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用機(jī)制研究

劉莎莎，張 賽，湯 智，李玉冰，馮 凱，劉 湘*

（1.湘潭市中心醫(yī)院，湖南 湘潭 411100；2.湘潭市中醫(yī)院，湖南 湘潭 411100；3.大連市友誼醫(yī)院，遼寧 大連 116100；4.大連市口腔醫(yī)院，遼寧 大連 116021）

丹酚酸B對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用機(jī)制研究

劉莎莎1，張 賽2，湯 智2，李玉冰3，馮 凱4，劉 湘1*

（1.湘潭市中心醫(yī)院，湖南 湘潭 411100；2.湘潭市中醫(yī)院，湖南 湘潭 411100；3.大連市友誼醫(yī)院，遼寧 大連 116100；4.大連市口腔醫(yī)院，遼寧 大連 116021）

目的 觀察丹酚酸B（Sal B）對(duì)H9c2心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧（hypoxia-reoxygenation，H/R）損傷的保護(hù)作用，并探討其可能的作用機(jī)制。方法 首先構(gòu)建H9c2心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型，采用噻唑藍(lán)（MTT）法研究丹酚酸B與H9c2心肌細(xì)胞活力的量效關(guān)系，確定丹酚酸B的保護(hù)作用，給藥方式為預(yù)給藥。實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組、丹酚酸B組、模型組（H/R組）、H/R+丹酚酸B組，分別檢測(cè)各組乳酸脫氫酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、活性氧簇（ROS）以及半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-3（Caspase-3）的含量變化。Western印跡檢測(cè)添加丹酚酸B對(duì)Akt磷酸化的影響，添加Akt抑制劑LY294002加以比較。結(jié)果 與正常對(duì)照組相比較，模型組LDH、MDA、ROS以及Caspase-3含量水平顯著升高（P<0.05），SOD、GSH-Px以及CAT含量水平顯著降低（P<0.05）；與模型組相比，丹酚酸B能夠顯著提高SOD、GSH-Px以及CAT含量水平（P<0.05），顯著降低LDH、MDA、ROS以及Caspase-3含量水平（P<0.05）。Western印跡結(jié)果顯示與正常對(duì)照組相比較，模型組Akt磷酸化水平顯著降低（P<0.001），相對(duì)于模型組丹酚酸B能夠顯著提高Akt的磷酸化水平（P<0.01），而這種保護(hù)作用能被LY294002所阻斷（P<0.01）。結(jié)論 丹酚酸B對(duì)H9c2心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與磷脂酰肌醇 3-激酶（PI3K/Akt）通路相關(guān)。

丹酚酸B；H9c2心肌細(xì)胞；缺氧復(fù)氧；抗氧化；抗凋亡；磷脂酰肌醇3-激酶

缺血性心臟病（冠心?。┦侨澜绶秶鷥?nèi)發(fā)病率及致死率最高的疾病之一，嚴(yán)重威脅人類的健康[1]。冠心病的治療過(guò)程中常常伴隨著心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI），其中氧自由基的大量生成及其后續(xù)的凋亡是MIRI損傷的重要機(jī)制之一[2-4]。丹參作為一種傳統(tǒng)的活血化瘀中藥，常用于冠心病的治療[5-7]。丹酚酸B（Sal B）作為丹參中含量最多的成分同時(shí)也是最主要的活性成分，具有廣泛的臨床應(yīng)用前景[8]。本研究采用心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧 （hypoxia-reoxygenation，H/R）損傷模型，從抗氧化及抗凋亡等方面探討丹酚酸B對(duì)H/R損傷的作用機(jī)制，旨在為其臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞

大鼠心肌細(xì)胞H9c2，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.2 受試藥物

丹酚酸B，購(gòu)于上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%。以二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解，加DMEM 稀釋至所需濃度。

1.3 主要儀器及試劑

二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司；超凈工作臺(tái)購(gòu)自上海智成分析儀器制造有限公司；超純水儀購(gòu)自美國(guó)Merck Millipore公司；恒溫磁力攪拌器購(gòu)自上海司樂(lè)儀器有限公司；臺(tái)式離心機(jī)購(gòu)自上海安亭科學(xué)化學(xué)儀器廠；低溫冰箱購(gòu)自青島海爾股份有限公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自?shī)W地利Tecan公司；電子天平購(gòu)自梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；厭氧手套箱購(gòu)自美國(guó)COY Laboratory公司；SDS PAGE微型凝膠電泳及轉(zhuǎn)膜設(shè)備購(gòu)自美國(guó)BioRad公司；高糖DMEM培養(yǎng)基、無(wú)糖DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；噻唑藍(lán)（MTT）及活性氧簇（ROS）試劑盒購(gòu)自美國(guó)ENZO公司；胰酶（Trypsin）及DMSO購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；乳酸脫氫酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、過(guò)氧化氫酶（CAT）和考馬斯亮藍(lán)蛋白定量試劑盒購(gòu)自南京建成科技有限公司；半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶3（Caspase-3）活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Biovision公司。哺乳動(dòng)物蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、增強(qiáng)型免疫化學(xué)發(fā)光免疫印跡檢測(cè)試劑盒和兔抗鼠二抗購(gòu)自北京康為世紀(jì)有限公司；抑制劑LY294002(CID:3973)購(gòu)自美國(guó)CA公司；鼠源一抗 p-Akt 1/2/3(B-5)、Akt 1/2/3(H-136)和 β-actin(C-2)購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

2 方法

2.1 心肌細(xì)胞H/R模型的構(gòu)建

H9c2心肌細(xì)胞復(fù)蘇后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，加入含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液，置于37℃含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。H9c2心肌細(xì)胞在含10%血清和1%雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基中鋪板生長(zhǎng)24 h后達(dá)到生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期。缺氧處理前去除培養(yǎng)板中高糖DMEM培養(yǎng)基，加入無(wú)糖DMEM培養(yǎng)基，放入COY厭氧手套箱37℃恒溫培養(yǎng)。復(fù)氧處理時(shí)，從厭氧手套箱中取出細(xì)胞培養(yǎng)板，用新鮮的高糖DMEM培養(yǎng)基替換無(wú)糖培養(yǎng)基，放入正常細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。H9c2心肌細(xì)胞缺氧時(shí)間固定為 6 h， 分別復(fù)氧 0、3、6、9、12、18、24 h，MTT法檢測(cè)復(fù)氧不同時(shí)間對(duì)H9c2心肌細(xì)胞活力的影響，最終確定造模時(shí)間為缺氧6 h和復(fù)氧24 h。

2.2 分組與干預(yù)

實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組、丹酚酸B組、模型組（H/R組）和H/R+丹酚酸B組，其中H/R組和H/R+丹酚酸B組細(xì)胞進(jìn)行H/R損傷處理，對(duì)照組和丹酚酸B組細(xì)胞不做處理。

2.3 指標(biāo)檢測(cè)

2.3.1 MTT法檢測(cè)丹酚酸B預(yù)處理對(duì)H/R誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞的影響 首先在正常條件下1.563、3.125和6.25 μg/mL三個(gè)濃度丹酚酸B預(yù)孵育細(xì)胞24 h，考察藥物的增殖作用和毒性作用，隨后在缺氧6 h和復(fù)氧24 h條件下篩選最佳藥物作用濃度，本部分實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組，H/R組和低、中、高濃度丹酚酸B給藥組。

2.3.2 乳酸脫氫酶（LDH）活性測(cè)定 正常對(duì)照組和丹酚酸B組不做處理，H/R組和H/R+丹酚酸B組細(xì)胞缺氧6 h和復(fù)氧24 h，處理結(jié)束后收集細(xì)胞培養(yǎng)液，參考南京建成試劑盒操作步驟進(jìn)行測(cè)定。

2.3.3 超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、過(guò)氧化氫酶（CAT）含量變化測(cè)定 正常對(duì)照組和丹酚酸B組不做處理，H/R組和H/R+丹酚酸B組細(xì)胞缺氧6 h和復(fù)氧24 h，處理結(jié)束后收集細(xì)胞培養(yǎng)液，按照南京建成試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

2.3.4 活性氧簇（ROS）含量變化測(cè)定 正常對(duì)照組和丹酚酸B組不做處理，H/R組和H/R+丹酚酸B組細(xì)胞缺氧6 h和復(fù)氧24 h，處理結(jié)束后取足量細(xì)胞移至離心管中，按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

2.3.5 半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶3（Caspase-3）的含量變化測(cè)定 正常對(duì)照組和丹酚酸B組不做處理，H/R組和H/R+丹酚酸B組細(xì)胞缺氧6 h和復(fù)氧24 h，處理結(jié)束后取足量細(xì)胞移至離心管中，按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

2.3.6 Western印跡檢測(cè) 采用哺乳動(dòng)物蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞蛋白，BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量，10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，轉(zhuǎn)NC膜。5%脫脂奶粉TBST溶液室溫封閉3 h后，分別加入 p-Akt、Akt和 β-actin 鼠源一抗 （1∶200），4℃孵育過(guò)夜，1×TBST洗3次，加入兔抗鼠二抗（1∶2 000），室溫孵育 2 h，1×TBST 洗 3 次，用 ECL顯色并曝光，凝膠系統(tǒng)拍片，采用Image J軟件進(jìn)行條帶灰度掃描。加入Akt抑制劑LY294002組進(jìn)行驗(yàn)證，給藥前預(yù)處理1 h，濃度為50 mol/L。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法

3 結(jié)果

3.1 心肌細(xì)胞H/R模型的構(gòu)建

結(jié)果顯示隨著復(fù)氧時(shí)間的增加，心肌細(xì)胞活力逐漸下降，表明復(fù)氧在MIRI中發(fā)揮著重要作用。最佳的造模條件為缺氧6 h和復(fù)氧24 h（P<0.01）。結(jié)果見圖1A。

3.2 不同濃度丹酚酸B對(duì)H/R誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞的影響

結(jié)果顯示細(xì)胞的活力沒有發(fā)生變化（圖1B）。排除了丹酚酸B的增殖作用和毒性作用后，尋找最佳的給藥濃度，最終發(fā)現(xiàn)最佳的給藥濃度為6.25 μg/mL。見圖1B-1C。

3.3 丹酚酸B對(duì)H/R誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞LDH的影響

LDH在細(xì)胞膜損傷時(shí)會(huì)從細(xì)胞中漏出，其可作為細(xì)胞死亡的標(biāo)志。圖1D顯示相對(duì)于正常對(duì)照組，H/R組能夠顯著增加LDH的釋放，相對(duì)于H/R組H/R+SalB能夠顯著減少LDH的釋放（P＜0.01）。見圖1D。

圖1心肌細(xì)胞H/R模型構(gòu)建及丹酚酸B對(duì)其影響

3.4 丹酚酸B對(duì)H/R誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞SOD、MDA、GSH-Px和CAT的影響

相對(duì)于對(duì)照組，H/R能夠?qū)9c2心肌細(xì)胞造成氧化應(yīng)激損傷，它能夠降低SOD、CAT和GSH-Px的活力（P＜0.05）并且提高 MDA 的含量（P＜0.01）。丹酚酸B的預(yù)處理能顯著抑制抗氧化物酶活性的降低（P＜0.05）和 MDA 量的增加（P＜0.01）。 見圖2A-2D。

3.5 丹酚酸B對(duì)H/R誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞ROS的影響

ROS的大量生成在細(xì)胞凋亡的過(guò)程中發(fā)揮重要作用[9]。圖2E顯示相對(duì)于正常對(duì)照組，H/R 組的細(xì)胞內(nèi) ROS水平顯著提高（P＜0.001），而丹酚酸B的預(yù)處理能顯著降低細(xì)胞內(nèi)ROS的水平 （P＜0.05）。結(jié)果表明丹酚酸B對(duì)H/R誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用與其抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。

3.6 丹酚酸B對(duì)H/R誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞Caspase-3的影響

Caspase-3活力的升高顯示H/R組的凋亡損傷增加（P＜0.001），相對(duì)于H/R組，丹酚酸B的預(yù)處理可以減輕凋亡損傷（P＜0.05）。見圖2F。

3.7 丹酚酸B對(duì)H/R誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞Akt磷酸化水平的影響

Western印跡結(jié)果顯示與正常對(duì)照組相比較，模型組Akt磷酸化水平顯著降低（P<0.001），相對(duì)于模型組，丹酚酸B能夠顯著提高Akt的磷酸化水平（P<0.01），而這種保護(hù)作用能被LY294002所阻斷（P<0.01）。見圖3。

圖2丹酚酸B對(duì)H/R損傷H9c2心肌細(xì)胞活力指標(biāo)的影響

4 討論

H9c2心肌細(xì)胞株是一種從大鼠胚胎心臟中分離出的永生化的心肌細(xì)胞系，不但具有類似于胚胎大鼠心肌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征，而且具有成年大鼠心肌細(xì)胞電生理學(xué)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面的生理特征，且性質(zhì)穩(wěn)定，因而被廣泛應(yīng)用于心肌細(xì)胞生理和病理方面的實(shí)驗(yàn)研究[10]。本研究利用體外H/R模型誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞凋亡，接近于體內(nèi)心肌組織細(xì)胞MIRI的病理生理本質(zhì)，是探討丹酚酸B對(duì)MIRI過(guò)程中心肌細(xì)胞損傷的影響和機(jī)制研究的合適模型。

圖3 Western blot檢測(cè)丹酚酸B對(duì)H/R損傷H9c2心肌細(xì)胞Akt磷酸化水平的影響

目前研究報(bào)道的MIRI的發(fā)生機(jī)制主要有氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、鈣超載、炎癥反應(yīng)和能量代謝障礙等[11-12]。盡管MIRI發(fā)生的機(jī)制目前仍不完全清楚，但是越來(lái)越多的研究認(rèn)為，氧化應(yīng)激介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡與MIRI的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，可能是其發(fā)病機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)之一。氧化應(yīng)激是指活性氧簇(ROS)的產(chǎn)生超過(guò)了機(jī)體內(nèi)的清除能力導(dǎo)致活性氧自由基及其相關(guān)代謝產(chǎn)物在體內(nèi)過(guò)量積聚造成失衡，從而對(duì)機(jī)體造成多種損害作用的病理狀態(tài)。在機(jī)體正常情況下ROS可以被體內(nèi)的抗氧化酶清除從而使細(xì)胞免受ROS的氧化損傷。當(dāng)機(jī)體處于非正常情況比如組織細(xì)胞缺血缺氧時(shí)，ROS的清除系統(tǒng)功能降低或喪失從而造成細(xì)胞急性或慢性損傷[2,4,13]。氧化應(yīng)激在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程發(fā)揮著重要作用，既可直接損傷細(xì)胞DNA誘導(dǎo)凋亡，還可以通過(guò)激活線粒體途徑等間接方式介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡（Apoptosis）是受一系列基因調(diào)控的、自發(fā)性的程序性死亡，它對(duì)維持機(jī)體細(xì)胞生長(zhǎng)與消亡的平衡起著重要的調(diào)節(jié)作用，細(xì)胞凋亡并不是病理?xiàng)l件下自體損傷的一種現(xiàn)象，而是為更好地適應(yīng)生存環(huán)境而主動(dòng)爭(zhēng)取的一種死亡過(guò)程。大量的研究證實(shí)缺血性心臟病、MIRI損傷、心衰以及神經(jīng)退行性疾病等多種病理生理狀態(tài)的過(guò)程中均伴有細(xì)胞凋亡的發(fā)生[14-18]。因此抗氧化應(yīng)激從而抑制凋亡成為探索這些疾病的發(fā)病機(jī)制及研制相關(guān)藥物的一個(gè)重要的方向。

細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)因子能夠通過(guò)激活蛋白磷酸化依賴的信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)抑制或促進(jìn)凋亡程序。研究表明磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K/Akt）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在MIRI誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)中具有重要的作用[19]。PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路抗細(xì)胞凋亡作用可能與下面幾種機(jī)制有關(guān)：（1）調(diào)節(jié)Bcl-2家族成員的活性[19]；（2）抑制 Caspase 導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡；（3）抑制促凋亡基因的表達(dá)[20]；（4）活化轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，抑制細(xì)胞凋亡；（5）活化的Akt能夠抑制線粒體釋放細(xì)胞色素c從而抑制細(xì)胞凋亡[21]。此外PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路還可以調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)與存活，血管新生，細(xì)胞遷移以及細(xì)胞周期等多種細(xì)胞活動(dòng)與生物學(xué)效應(yīng)[22-23]。

H/R誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞氧化損傷模型被廣泛用于模擬氧化應(yīng)激[24]。在本研究中，H/R誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡表現(xiàn)出了LDH釋放的顯著增加以及細(xì)胞存活率的顯著降低。H/R造模的MTT結(jié)果顯示復(fù)氧的0～24 h過(guò)程中細(xì)胞存活率呈時(shí)間依賴性地降低，說(shuō)明了缺氧能夠使H9c2心肌細(xì)胞的存活率降低，而復(fù)氧能使其進(jìn)一步地降低。最終選擇缺氧6 h加復(fù)氧24 h作為造模條件。

在觀察完丹酚酸B的增殖作用和毒性作用以后，發(fā)現(xiàn)采用6.25 μg/mL丹酚酸B預(yù)處理24 h后能顯著提高H/R損傷后的H9c2心肌細(xì)胞的存活率。丹酚酸B預(yù)處理對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用體現(xiàn)在細(xì)胞存活率的增高和LDH漏出的降低。

大量ROS的存在能夠通過(guò)脂質(zhì)過(guò)氧化作用，蛋白質(zhì)和DNA的氧化損傷多種生物分子，最終導(dǎo)致線粒體功能失常，Caspase-3的激活以及細(xì)胞的凋亡[25]。Caspases（半胱氨酸-天門冬氨酸特異性蛋白酶）家族是一類獨(dú)特的半胱氨酸蛋白酶，它們可特異性水解目標(biāo)蛋白中天門冬氨酸殘基的羧基端。至今在哺乳動(dòng)物中已發(fā)現(xiàn)的Caspase超過(guò)13種，其中起最為關(guān)鍵作用的是Caspases-3，一種凋亡關(guān)鍵效應(yīng)酶。Caspase-3主要作用是對(duì)底物蛋白質(zhì)進(jìn)行酶解從而直接介導(dǎo)凋亡實(shí)施。MIRI導(dǎo)致氧化應(yīng)激等因素可誘導(dǎo)內(nèi)源性和外源性凋亡通路的激活，并最終激活Caspases-3。活化的Caspases-3可以降解多種胞內(nèi)蛋白，使胞膜、細(xì)胞骨架及染色體結(jié)構(gòu)遭到破壞，導(dǎo)致胞體固縮，染色體崩解，凋亡小體形成等。因此許多研究中將Caspase-3作為凋亡損傷的標(biāo)志性指標(biāo)[26]。許多研究表明MIRI能夠引起Caspase-3活性的增高和心肌凋亡細(xì)胞數(shù)量的增加[27]。在本研究中H/R誘導(dǎo)的損傷能夠提高H9c2心肌細(xì)胞胞內(nèi)ROS濃度，并且也能增高氧化應(yīng)激標(biāo)志物比如脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA的含量。丹酚酸B的預(yù)處理能夠降低它們的含量并且能有效地增加SOD、GSH-px和CAT的活力。

PI3K/Akt信號(hào)通路在調(diào)控心肌細(xì)胞的生存和凋亡過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。Western印跡檢測(cè)結(jié)果顯示丹酚酸B的預(yù)處理可以顯著升高H/R損傷造成的Akt磷酸化水平降低，而這種保護(hù)作用可以被LY294002所阻斷。因此我們推測(cè)丹酚酸B預(yù)處理可能通過(guò)激活PI3K/Akt通路抑制H/R誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，丹酚酸B對(duì)H/R誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與PI3K/Akt通路相關(guān)，但其確切的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

[1]Damiani G,Salvatori E,Silvestrini G.et al.Influence of socioeconomic factors on hospital readmissions for heart failure and acute myocardial infarction in patients 65 years and older:evidence from a systematic review[J].ClinintervAging,2015,10:237-245.

[2]Meng X,Sun G,YeJ.etal.NotoginsenosideR1-medi ated neuroprotection involves estrogen receptor-dependentcrosstalk between Akt and ERK1/2 pathways:a novel mechanism of Nrf2/ARE signaling activation[J].Free Radic Res,2014,48(4):445-460.

[3]Ray PD,Huang BW,Tsuji Y.Reactive oxygen species(ROS)homeostasis and redox regulation in cellular signaling[J].Cell Signal,2012,24(5):981-990.

[4]Wilkinson-Berka JL,Rana I,Armani Ret al.Reactive oxygen species,Nox and angiotensin II in angiogenesis:implications for retinopathy[J].Clin Sci(Lond),2013,124(10):597-615.

[5]楊志霞,林 謙,馬 利.丹參對(duì)心血管疾病藥理作用的文獻(xiàn)研究[J].世界中西醫(yī)結(jié)合雜志,2012(2):93-96.

[6]杜冠華,張均田.丹參現(xiàn)代研究概況與進(jìn)展(續(xù)一)[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2004(6):355-360.

[7]張 照,朱偉君,阮鴻剛,等.丹參注射液對(duì)心臟微循環(huán)的影響[J].生理科學(xué),1984(4):36.

[8]羅娟敏,蘇加坤,田耀偉,等.HPLC法同時(shí)測(cè)定丹參藥材中丹酚酸B、丹參酮ⅡA含量[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥,2014(2):25-27.

[9]Sinha K,Das J,Pal PB，et al.Oxidative stress:the mitochondria-dependent and mitochondria-independent pathways of apoptosis[J].Arch Toxicol,2013,87(7):1157-1180.

[10]Hescheler J,Meyer R,Plant S，et al.Morphological,biochemical,and electrophysiological characterization of a clonal cell(H9c2)line from rat heart[J].Circ Res,1991,69(6):1476-1486.

[11]Jennings RB,Sommers HM,Smyth GA,et al.Myocardial necrosis induced by temporary occlusion of a coronary artery in the dog[J].Arch Pathol,1960,70:68-78.

[12]Frohlich GM,Meier P,White SK,et al.Myocardial reperfusion injury:looking beyond primary PCI[J].Eur Heart J,2013,34(23):1714-1722.

[13]Chen XL,Kunsch C.Induction of cytoprotective genes through Nrf2/antioxidant response element pathway:a new therapeutic approach for the treatment of inflammatory diseases[J].Curr Pharm Des,2004,10(8):879-891.

[14]Nicholson DW.From bench to clinic with apoptosis-based therapeutic agents[J].Nature,2000,407(6805):810-816.

[15]Gottlieb RA.Cell death pathways in acute ischemia/reperfusion injury[J].J Cardiovasc Pharmacol Ther,2011,16(3-4):233-238.

[16]Zhao ZQ,Nakamura M,Wang NP,et al.Reperfusion induces myocardial apoptotic cell death[J].Cardiovasc Res,2000,45(3):651-660.

[17]Sun Y,Yi W,Yuan Y,et al.C1q/tumor necrosis factor-related protein-9,a novel adipocyte-derived cytokine, attenuates adverse remodeling in the ischemic mouse heart via protein kinase A activation[J].Circulation,2013,128(11 Suppl 1):S113-120.

[18]Wu N,Zhang X,Jia P,et al.Hypercholesterolemia abrogates the protective effect of ischemic postconditioning by induction of apoptosis and impairment of activation of reperfusion injury salvage kinase pathway[J].Biochem Biophys Res Commun,2015,458(1):148-153.

[19]Deng C,Sun Z,Tong G,et al.alpha-Lipoic acid reduces infarct size and preserves cardiac function in rat myocardial ischemia/reperfusion injury through activation of PI3K/Akt/Nrf2 pathway[J].Plos ONE,2013,8(3):e58371.

[20]Xin M,Deng X.Nicotine inactivation of the proapoptotic function of Bax through phosphorylation[J].J Biol Chem,2005,280(11):10781-10789.

[21]Bartling B,Tostlebe H,Darmer D,et al.Shear stress-dependent expression of apoptosis-regulating genes in endothelial cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2000,278(3):740-746.

[22]Gibson EM,Henson ES,Haney N,et al.Epidermal growth factor protects epithelial-derived cells from tumor necrosis factorrelated apoptosis-inducing ligand-induced apoptosis by inhibiting cytochrome c release[J].Cancer Res,2002,62(2):488-496.

[23]Rommel C,Camps M,Ji H.PI3K delta and PI3K gamma:partners in crime in inflammation in rheumatoid arthritis and beyond?[J].Nat Rev Immunol,2007,7(3):191-201.

[24]Sun L,Zang WJ,Wang H,et al.Acetylcholine promotes ROS det oxification against hypoxia/reoxygenation-induced oxidative stress through FoxO3a/PGC-1alpha dependent superoxide dismutase[J].Cell Physiol Biochem,2014,34(5):1614-1625.

[25]Radak Z,Zhao Z,Goto S,et al.Age-associated neurodegeneration and oxidative damage to lipids,proteins and DNA[J].Mol Aspects Med,2011,32(4-6):305-315.

[26]Smith MA,Schnellmann RG.Calpains,mitochondria,and apoptosis[J].Cardiovasc Res,2012,96(1):32-37.

[27]Bae S,Yalamarti B,Kang PM.Role of caspase-independent apopto sis in cardiovascular diseases[J].Front Biosci,2008（13）:2495-2503.

（本文編輯 楊 瑛）

Protective Effect of Salvianolic Acid B on Hypoxia-Reoxygenation Induced Injury in H9c2 Cardiomyocytes

LIU Shasha1,ZHANG Sai2,TANG Zhi2,LI Yubing3,FENG Kai4,LIU Xiang1*
(1.Xiangtan Central Hospital,Xiangtan,Hunan 411100,China;2.Xiangtan Chinese Medicine Hospital,Xiangtan,Hunan 411100,China;3.Dalian(Municipal)Friendship Hospital,Dalian,Liaoning 116001,China;4.Dalian Stomatological Hospital,Dalian,Liaoning 116021,China)

ObjectiveTo investigate the protective effect of salvianolic acid B (Sal B)on hypoxia-reoxygenation(H/R)induced injury in H9c2 cardiomyocytes.MethodsThe hypoxia-reoxygenation model of H9c2 cardiomyocytes was constructed.The relationship between the activity of Sal B and H9c2 was measured by MTT assay,and the protective effect of Sal B was determined.The following sets of experiments were performed:control group,Sal B group,model group(H/R group),H/R+Sal B group.The contents of lactic dehydrogenase(LDH),superoxide dismutase(SOD),malonaldehyde(MDA),glutathione peroxidase(GSH-Px),catalase(CAT),reactive oxygen species(ROS)and Caspase-3 in all groups were determined.The effect of Sal B on Akt phosphorylation was tested with Western blotting,and LY294002 added as the control.ResultsCompared with the control group,LDH,MDA,ROS,and Caspase-3 levels in H/R group significantly increased(P<0.05)and SOD,GSH-Px,and CAT levels in H/R group significantly decreased (P<0.05).Compared with H/R group,Sal B significantly increased SOD,GSH-Px,and CAT levels and decreased LDH,MDA,ROS,and Caspase-3 levels.Western blotting results showed that:compared with the controlgroup,Aktphosphorylation levelin modelgroup decreased significantly (P<0.01);comparedwith model group,Akt phosphorylation level in Sal B group increased significantly (P<0.01),while this effect could be blocked by LY294002(P<0.01).Conclusion Sal B shows protective effect on H9c2 cadiomyocytes injury induced by H/R,which mechanism may be related with the PI3K/Akt signaling pathway.

salvianolic acid B;H9c2 cadiomyocytes;hypoxia-reoxygenation;antioxidant;anti-apoptosis;PI3K/Akt

R285.5；R541.4

A

doi:10.3969/j.issn.1674－070X.2017.08.005

2016-12-10

劉莎莎，女，碩士，研究方向：心血管藥理。

*劉 湘，女，主任藥師，E-mail：liuxiangtougao@163.com。

本文引用：劉莎莎，張 賽，湯 智，李玉冰，馮 凱，劉 湘.丹酚酸B對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用機(jī)制研究[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，37（8）：832-837.