鐵調(diào)素在慢性牙周炎性牙槽骨吸收中的作用

朱 萱，李 濤，馮云枝*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；2.長沙市口腔醫(yī)院，湖南 長沙 410000；3.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院，湖南 長沙 410011）

鐵調(diào)素在慢性牙周炎性牙槽骨吸收中的作用

朱 萱1，李 濤2，馮云枝3*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；2.長沙市口腔醫(yī)院，湖南 長沙 410000；3.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院，湖南 長沙 410011）

目的 探討鐵調(diào)素（Hepcidin）在慢性牙周炎性牙槽骨吸收過程中的作用，闡明鐵離子及其相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白在牙槽骨吸收中的重要生物學(xué)意義，以期為探索出有效地防治牙槽骨吸收的方法提供理論基礎(chǔ)。方法 檢測慢性牙周炎患者齦溝液（GCF）中鐵離子、核因子KB受體活化因子配體（RANKL）、骨保護素（OPG）的表達水平，分析鐵離子的含量與RANKL和OPG表達的相關(guān)性以及鐵離子的含量與牙周炎性牙槽骨吸收的關(guān)系。結(jié)果 20例慢性牙周炎組受檢牙GCF中鐵離子、Hepcidin和RANKL的濃度高于健康對照組（P<0.05），OPG的濃度低于健康對照組（P<0.01）。慢性牙周炎組GCF中RANKL和OPG的濃度與該受檢牙 4項臨床指標(biāo)：牙周探診深度（PD）、附著喪失（AL）、菌斑指數(shù)（PLI）、齦溝出血指數(shù)（SBI）無相關(guān)（P>0.05），鐵離子濃度與Hepcidin濃度呈正相關(guān)（P<0.01），與RANKL濃度呈正相關(guān)（P<0.05），與OPG濃度無相關(guān)（P>0.05）。結(jié)論 慢性牙周炎導(dǎo)致的牙槽骨吸收與局部Hepcidin升高和發(fā)生鐵過載有關(guān)。

慢性牙周炎；鐵調(diào)素；二價鐵離子；骨質(zhì)吸收

慢性牙周炎（chronic periodontitis,CP）是口腔科的常見病之一。鐵是人體重要的微量元素，它參與人體紅細胞合成、氧化應(yīng)激反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)等重要生理過程。最新的研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)體內(nèi)鐵離子過多時（鐵過載）反而會引起體內(nèi)一系列病理變化，其中骨骼系統(tǒng)是鐵過載損傷的重要靶點[1]。高濃度的鐵離子能抑制成骨細胞增殖、分化以及鈣鹽的沉積，促進破骨細胞的分化成熟，增強骨吸收，在遺傳性血色病、海洋性貧血（反復(fù)輸血）、鐮刀細胞性貧血、非洲鐵沉積癥等鐵過載引起的疾病中，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率也很高[2]。鐵調(diào)素(Hepcidin)是一種具有抗菌活性的25氨基酸肽，對人體鐵的吸收和分配起到重要的調(diào)節(jié)作用，其表達受機體信號因子以及炎癥、低氧等疾病狀態(tài)的影響。口腔內(nèi)長期存在大量微生物，當(dāng)伴發(fā)牙周炎、種植體周圍炎及咬合創(chuàng)傷時，多種復(fù)雜的因素可能直接或間接的影響局部微環(huán)境中鐵調(diào)素和鐵離子的水平。目前關(guān)于鐵離子水平及其調(diào)節(jié)蛋白在口腔疾病中的作用及機制尚未見報道。中西醫(yī)結(jié)合辨證論治治療慢性疾病的方法取得了明顯的進展，在改善消除局部病損的同時，又調(diào)節(jié)全身狀況，成為慢性疾病新的治療方案[3]。因此本研究擬從鐵代謝與牙槽骨吸收的關(guān)系入手，旨在闡明鐵離子及其相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白在牙槽骨吸收中的重要生物學(xué)意義，以期為探索出有效防治牙槽骨吸收的方法提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 實驗對象

選取2014年4月至2014年11月期間在中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院口腔科就診的20例慢性牙周炎患者，其中男 11 人，女 9 人，年齡 35～60 歲，平均（43.2±1.2）歲。對照組選取20例年齡、性別基本匹配無牙周炎的正常人群，其中男8人，女12人，年齡30～60歲，平均（42.9±1.3）歲。 兩組的年齡、性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。此研究經(jīng)中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院倫理委員會同意，所有患者簽署了知情同意書。

納入標(biāo)準(zhǔn)：從20例患者口腔中選取受試牙，滿足炎癥累及牙周深層組織、牙周袋≥3 mm，X線示牙槽骨吸收，但無牙髓及根尖周病變（根據(jù)臨床癥狀、檢查及X線診斷）、無咬合創(chuàng)傷（根據(jù)功能性咬合動度和牙周膜寬度診斷）等局部刺激因素等標(biāo)準(zhǔn)。對照組選取受試牙滿足齦溝出血指數(shù)（SBI)≤1，牙周探診深度（PD)＜3 mm，無附著喪失(AL)，無松動，無牙槽骨的吸收，所選牙齒社區(qū)牙周治療需要量指數(shù)（CPITN）=0等標(biāo)準(zhǔn)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：患者合并其它系統(tǒng)性疾?。粚嶒炃?個月內(nèi)服用過抗生素；半年內(nèi)進行過牙周治療；孕產(chǎn)婦。

1.2 試劑與儀器

人核因子 KB受體活化因子配體（RANKL）ELISA試劑盒（上海麗臣生物科技有限公司）；人骨保護素（OPG）ELISA試劑盒（上海麗臣生物科技有限公司）；人鐵調(diào)素ELISA試劑盒（上海麗臣生物科技有限公司）；Fe檢測試劑盒（上海豐匯醫(yī)學(xué)科技有限公司）；PBS 緩沖液（0.01 mmol/L，pH 7.2）；ELx800 吸光度全自動定量繪圖酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）；Milli-Q超純水機（美國Millipore公司）。

1.3 方法

1.3.1 受檢牙臨床資料的收集 所有受檢牙均進行視診、探診和拍攝牙片，并分別記錄：（1）牙周探診深度（probing depth，PD）是指齦緣至牙周袋底或者齦溝底的距離，以mm為單位記錄。（2）附著喪失（attachment loss，AL）是指袋（溝）底至釉牙骨質(zhì)界的距離，以mm為單位記錄。（3）菌斑指數(shù)（plaque index，PLI）用探針輕劃牙面，根據(jù)菌斑的量和厚度記分。（4）齦溝出血指數(shù)（sulcular bleeding index，SBI）使用鈍頭牙周探針輕探齦溝，觀察出血情況并計分。

1.3.2 齦溝液標(biāo)本的采集 采用吸潮紙尖法。對照組受試牙均在該牙唇（頰）側(cè)近中齦溝處收集齦溝液（gingival crevicular fluid,GCF）標(biāo)本。慢性牙周炎組受試牙均在牙周探診最深位點處收集齦溝液標(biāo)本。取完稱質(zhì)量后放入加入了PBS緩沖液的離心管中，-80℃冷凍保存。

1.3.3 齦溝液中鐵離子含量的測定 采用亞鐵嗪微板法，按Fe檢測試劑盒說明書，選用經(jīng)稀鹽酸處理及去離子水清潔的96孔板，將待測齦溝液和配置好的標(biāo)準(zhǔn)鐵溶液加入到96孔板中，再加入顯色液混勻，室溫靜置，酶標(biāo)儀562 nm處檢測，以空白孔調(diào)零，再依次讀取各孔吸光度。利用測得的標(biāo)準(zhǔn)鐵試劑的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出待測齦溝液中鐵的濃度。

1.3.4 齦 溝 液 中 Hepcidin、RANKL、OPG的 表 達采用酶聯(lián)免疫吸附法，所有操作均按照鐵調(diào)素、RANKL、OPG ELISA試劑盒的說明書操作。

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法 采用統(tǒng)計軟件SPSS 23.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，均值間差異比較采用t檢驗，計量資料以“±s”表示。Spearman 法分析相關(guān)性。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組受檢牙臨床指標(biāo)的比較

分別測量CP組和對照組受檢牙的臨床指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)20例CP組受檢牙和20例健康對照組受檢牙在PD、AL、PLI和 SBI四個指標(biāo)中均有明顯差異（P<0.01）。CP組的受檢牙符合牙周病的診斷。見表1。

表1兩組受檢牙臨床檢測指標(biāo)的比較

2.2 兩組GCF中鐵離子（Fe2+）和Hepcidin濃度的比較

20例CP組受檢牙和20例健康對照組受檢牙GCF中Fe2+和Hepcidin濃度有差別，慢性牙周炎患者GCF中Fe2+和Hepcidin濃度高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表 2。

表 2 兩組 GCF中Fe2+和 Hepcidin濃度的比較 （n=20，±s）

表 2 兩組 GCF中Fe2+和 Hepcidin濃度的比較 （n=20，±s）

注：與對照組相比，*P<0.05。

項目對照組CP組ZP Fe2+/μmol·L-118.71±10.35 34.47±17.88*2.192 0.028 Hepcidin/ng·mL-112.28±5.50 18.51±8.38*2.272 0.023

2.3 兩組GCF中RANKL和OPG的濃度及其比值的比較

20例CP組受檢牙和20例健康對照組受檢牙GCF中RANKL和OPG的表達濃度有差別，慢性牙周炎患者GCF中RANKL濃度高于健康對照組，OPG濃度低于健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），見表3。

表3兩組GCF中RANKL和OPG的濃度及其比值的比較 (±s)

表3兩組GCF中RANKL和OPG的濃度及其比值的比較 (±s)

注：與對照組相比，**P<0.01。

項目對照組CP組t/z P RANKL/pg·μL-127.20±11.47 54.53±14.43**4.599 0.000 OPG/pg·μL-1110.08±47.37 49.86±24.98**5.030 0.000 RANKL/OPG 0.32±0.26 1.49±1.06**4.734 0.000

2.4 慢性牙周炎組受試牙GCF中RANKL和OPG的濃度及RANKL/OPG的比值與牙周臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析

分析20例CP組受檢牙GCF中RANKL和OPG的濃度與該受檢牙臨床指標(biāo) PD、AL、PLI、SBI的相關(guān)性可知，各組之間均無相關(guān)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表 4。

表4 CP組受試牙GCF中RANKL和OPG的濃度及RANKL/OPG的比值與牙周臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析

2.5 慢性牙周炎患者GCF中鐵離子的濃度與Hepcidin、RANKL和OPG濃度的相關(guān)性分析

分析20例CP組受檢牙GCF中鐵離子的濃度與Hepcidin、RANKL和OPG濃度的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)鐵離子濃度與鐵調(diào)素濃度呈正相關(guān)r=0.586，P=0.007，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；鐵離子濃度與RANKL濃度呈正相關(guān)r=0.403，P=0.04，有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；鐵離子濃度與 OPG 濃度無相關(guān)性（P>0.05），見表5。

表5 CP患者GCF中 Fe2+的濃度與Hepcidin、RANKL和OPG濃度的相關(guān)性分析

3 討論

牙周病，中醫(yī)學(xué)稱之為牙宣、齒衄，主要表現(xiàn)為牙齦的炎癥、牙周袋的形成、牙槽骨的吸收和牙齒的松動移位，慢性牙周炎性牙槽骨吸收是導(dǎo)致牙喪失的主要原因。中醫(yī)認(rèn)為腎主骨，齒為骨之余，足陽明胃經(jīng)經(jīng)鼻外入上齒齦，手陽明大腸經(jīng)經(jīng)頸部至面頰入下齒齦;牙齒與骨一樣由腎氣充養(yǎng)，牙齦則與胃、脾、腎、大腸等臟腑關(guān)系密切。過食辛辣炙博、酗酒過度或房勞太過等可致胃火上蒸，消齒灼齦；或腎陰虧虛，虛火上炎，灼傷牙齦而發(fā)為牙宣；或久病致氣血不足，則齒失濡養(yǎng)，齒失潤澤而見牙齒松動、牙齦萎縮等癥。

鐵調(diào)素是近些年來新發(fā)現(xiàn)的一種調(diào)節(jié)細胞鐵代謝的活性物質(zhì)，在機體鐵代謝平衡的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。最早在2000年由Krause和Park等[4-5]分別從人血清和尿中提純得到鐵調(diào)素。當(dāng)機體鐵過載時，鐵調(diào)素基因表達增強，使肝臟合成分泌鐵調(diào)素增多，從而加速小腸上皮細胞表面膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白1（FPN1）的降解，關(guān)閉鐵向血液中轉(zhuǎn)運的源頭，進而減少小腸上皮細胞和巨噬細胞向血液中輸送鐵，當(dāng)機體鐵缺乏時，以上過程發(fā)生相反的改變，從而維持鐵的穩(wěn)態(tài)[6-8]。

人體在生理狀態(tài)下缺少排泄鐵的機制，因此在遺傳和各種環(huán)境因素異常的條件下，機體的局部和整體很容易發(fā)生鐵過載，從而導(dǎo)致一系列病理變化，這其中也包括對成骨細胞和破骨細胞的影響。有研究證實，高濃度的鐵離子能在體外抑制成骨細胞增殖、分化以及鈣鹽沉積，同時促進破骨細胞的分化成熟，增強骨吸收[9-12]。絕經(jīng)期婦女發(fā)生的骨質(zhì)疏松也可能與體內(nèi)存在鐵過載有關(guān)[12]。本實驗對不同程度的牙周病患者GCF中鐵離子濃度進行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著CP嚴(yán)重程度的加深，齦溝液中鐵離子和Hepcidin的濃度增加，鐵離子和Hepcidin有著明顯的相關(guān)關(guān)系，這些都提示局部鐵過載的發(fā)生與CP的發(fā)生和發(fā)展有著密切的聯(lián)系，局部Hepcidin的異常引起的鐵代謝異?？赡苁荂P發(fā)生的重要機制。

在正常的生理條件下，成年人的骨骼中破骨細胞的骨吸收與成骨細胞的骨形成處于一個動態(tài)平衡的過程，使骨組織不斷更新，以維持骨骼的硬度與彈性。破骨細胞的分化成熟受多種信號途徑調(diào)控，RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)是破骨細胞分化成熟的主要信號途徑，它們不但在牙周骨吸收中起重要作用，而且在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和骨質(zhì)疏松等其它病理性骨吸收中也發(fā)揮著重要作用。成骨細胞及骨髓基質(zhì)細胞表達RANKL，與破骨細胞前體細胞或破骨細胞表面上的核因子KB受體活化因子（RANK）結(jié)合后，可促進破骨細胞的分化及骨吸收活性。成骨細胞及骨髓基質(zhì)細胞分泌表達OPG與RANKL競爭性結(jié)合，可阻止RANKL與RANK之間的結(jié)合。RANKL/OPG的比值決定著破骨細胞的分化與功能[1,13-14]。口腔局部鐵代謝失衡與牙槽骨吸收有密切的關(guān)系。作為牙周病主要致病菌的卟啉單胞菌可通過特異性外膜受體結(jié)合含鐵蛋白中的鐵/亞鐵血紅素,并將其轉(zhuǎn)運至細胞內(nèi)，引起感染局部鐵離子水平上升[15]。有研究表明在牙周炎、種植體周圍炎者GCF中存在大 量如 IL-6、IL-1、TNF、PGE2 等炎 性 因 子 及TGF-β、BMP、HIF等細胞因子，以及牙周袋內(nèi)相對缺氧的環(huán)境及咀嚼壓力的刺激均可能對局部Hepcidin的表達水平產(chǎn)生影響，導(dǎo)致齦溝液中鐵離子濃度的升高，最終導(dǎo)致牙槽骨的吸收[16]。在本實驗中發(fā)現(xiàn)，慢性牙周炎患者GCF中RANKL的表達較正常對照組升高，而OPG的表達較正常對照組降低，而且Hepcidin和鐵離子的表達與RNAKL明顯相關(guān)，提示鐵離子和Hepcidin濃度的升高通過影響增加RNAKL的表達，抑制OPG的表達，最終導(dǎo)致破骨細胞活性升高，引起牙槽骨的吸收。

通過本次實驗結(jié)果可以認(rèn)為慢性牙周炎導(dǎo)致的牙槽骨吸收與局部GCF中發(fā)生鐵過載有關(guān)。局部Hepcidin水平的升高與鐵離子濃度明顯相關(guān)，是導(dǎo)致局部鐵過載的重要機制。鐵離子濃度的升高通過促進RNAKL表達和抑制OPG的表達，引起牙槽骨的吸收。中醫(yī)治療牙周病主張辨證施治[17]，采用疏風(fēng)清熱、清胃瀉火、補益氣血、滋陰補腎等方法，注重扶正與祛邪并用，強調(diào)宏觀調(diào)節(jié)顧護人體正氣。利用鐵離子濃度的改變來調(diào)節(jié)氣血，顧護人體正氣，提高免疫力，對防止慢性牙周炎中牙槽骨吸收，維持牙根的穩(wěn)固有重要的意義。本實驗在理論上初步揭示Hepcidin異常導(dǎo)致的鐵過載與牙槽骨吸收的作用及機制，有助于進一步加深對慢性牙周炎、種植體周圍炎發(fā)病機制的認(rèn)識，開拓中西醫(yī)結(jié)合辨證論治治療牙周炎的新方法，在改善消除局部病損的同時，又調(diào)節(jié)全身狀況、標(biāo)本兼治，為今后防治牙周炎、種植體周圍炎引起的骨吸收提供一定的理論依據(jù)。

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（本文編輯 李 杰）

Impact of Hepcidin in Alveolar Bone Absorption of Chronic Periodontitis

ZHU Xuan1,LI Tao2,FENG Yunzhi3*
(1.Hunan University of Chinese Medcine,Changsha,Hunan 410208,China;2.Changsha Stomatological Hospital,Changsha,Hunan 410000,China;3.The Second Xiangya Hospital of Central South University,Changsha,Hunan 410011,China)

ObjectiveTo explore the role of hepcidin in the process of alveolar bone absorption in chronic periodontitis,and the important biological significance of iron ion and related regulatory proteins in alveolar bone absorption,in order to build theoretical basis of effective prevention of alveolar bone absorption.MethodsThe expression of iron ions,RANKL and OPG in gingival crevicular fluid (GCF)of chronic periodontitis patients was detected.The correlation between iron ion and RANKL/OPG,and the relationship between iron ion and alveolar bone absorption were correlated.ResultsThe concentration of Iron ion,hepcidin,RANKL levels in GCF of 20 chronic periodontitis patients was higher than that in healthy control group(P<0.01).RANKL and OPG level in GCF of chronic periodontitis patients were not correlated to four clinical indicators:probing depth(PD),attachment loss(AL),plaque index(PLI)and sulcus bleeding index(SBI)(P>0.05).Iron iron level was positive correlated with hepcidin(P<0.01)and RANKL level(P<0.05),but not correlated with OPG level(P>0.05).ConclusionAlveolar bone absorption caused by chronic periodontitis may be related with upregulation of hepcidin and overload iron.

periodontitis;hepcidin;ferrous iron;bone absorption

R781.4

B

doi:10.3969/j.issn.1674－070X.2017.08.022

2016-12-13

湖南省教育廳科學(xué)研究項目（14C0848）。

朱 萱，女，碩士，研究方向：口腔醫(yī)學(xué)。

* 馮云枝，女，教授，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：724986095@qq.com。

本文引用：朱 萱，李 濤，馮云枝.鐵調(diào)素在慢性牙周炎性牙槽骨吸收中的作用[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2017，37（8）：905-909.