自噬相關基因Beclin 1和微管相關蛋白輕鏈3在胃癌組織中的表達及臨床意義

宋華勇 馬 磊

(河南大學第一附屬醫(yī)院腫瘤科，河南 開封 475000)

自噬相關基因Beclin 1和微管相關蛋白輕鏈3在胃癌組織中的表達及臨床意義

宋華勇 馬 磊

(河南大學第一附屬醫(yī)院腫瘤科，河南 開封 475000)

目的 探究Beclin-1及LC3蛋白在胃癌組織中的表達水平，并分析其臨床病理意義。方法 選取2015年3月—2016年3月我院收治的患者146例，收集其胃癌組織標本及癌旁組織標本，并采集146例健康黏膜組織作為對照組，利用SP方法檢測Beclin-1和LC3的表達，并分析其表達與臨床病理特征的關系。結(jié)果 Beclin-1及LC3在健康黏膜組織的表達最高，在胃癌組織中的表達最低，此外，上述兩組蛋白在不同的性別、年齡及發(fā)病部位無明顯差異，但在T3～T4分期、高、中分化程度及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中表達率顯著降低。結(jié)論 胃癌組織中的Beclin-1及LC3蛋白的表達量顯著低于正常組織及癌旁組織，提示與胃癌的發(fā)生及發(fā)展密切相關，本研究為胃癌的診斷、預防及治療提供了新的思路。

自噬基因；Beclin-1；LC3；胃癌

胃癌危害性大，致死率高，成為威脅人類生命安全的主要疾病之一[1-2]。近年來，自噬系統(tǒng)對癌組織的治療成為臨床治療中較受關注的一種方法，本研究通過免疫組織化法對胃癌患者癌組織及癌旁組織的自噬相關基因Beclin1和微管相關蛋白輕鏈3(LC3)的表達進行檢測，評價其與胃癌臨床特征的關系，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年3月—2016年3月我院收治的患者146例，經(jīng)過影像檢測手段、內(nèi)鏡活檢及組織切片，確診為胃癌患者，且上述患者均為首次診斷出胃癌，在此前并未進行放療及化療等治療，本次研究取得了患者本人的同意及我院倫理委員會的批準。上述患者中，男81例，女65例，年齡31～71歲，平均(53.78±7.21)歲，按照國際抗癌聯(lián)盟(UICC)的2009年第7版TNM臨床分期法[3]：T1～T2期為83例，T3～T4期為63例。病理分期：低分級組織標本79例，高分級標本67例。此外，有76例胃癌組織標本發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。同時選取正常胃黏膜標本146例作為對照組。兩組標本患者在年齡和性別方面無明顯差別，P>0.05。

1.2 研究方法

1.2.1 儀器與試劑 XOSC數(shù)顯恒溫水浴鍋(南京先歐儀器制造有限公司)、奧林巴斯BX40光學顯微鏡。S-P免疫組織試劑盒購自上海躍進醫(yī)療有限公司；兔抗人Beclin-1和LC3多克隆抗體由美國CST中國分公司提供。

1.2.2 檢測方法 ①石蠟標本制作：1.1中胃癌組織、癌旁組織及健康胃黏膜組織的標本手術(shù)切下后立即放入10%福爾馬林中浸泡24 h，之后分別用70%～100%乙醇(2 h)梯度脫水處理，處理后的標本用二甲苯(PX)進行透明處理2 h；最后除雜質(zhì)后，放入純石蠟中，4 ℃保存待用。②制片：將①中的石蠟切成厚度為4 μm切片，放置于載玻片上滴1 ml蒸餾水，在恒溫水浴鍋上烘干。③組織切片在PX中浸泡10 min，依次用無水乙醇—95%乙醇—70%乙醇分別浸泡5 min脫水后，磷酸鹽漂洗3次，每次3 min。④切片放入檸檬酸鹽緩沖液中進行抗原修復處理，隨后PBS沖洗5 min×3，將過氧化氫的甲醇溶液滴在標本上，20～25 ℃下靜置12 min，抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性，消除誤差的影響；④PBS液洗5 min×3后做封閉處理，室溫孵育0.5 h。⑤加入適量兔抗人Beclin-1和LC3多克隆抗體，在4℃下過夜，次日PBS洗3次各5 min。⑥加入相應的二抗后靜置10～15 min，PBS洗5 min×3。⑦DAB顯色：在組織標本上滴加DBA顯色劑并在顯微鏡下觀察染色程度，PBS沖洗10 min；⑧蘇木精復燃4 min后用不同濃度酒精脫水后沖洗10 min；⑨PX處理后，BX40光學顯微鏡下觀察；⑩PBS取代一抗制備的陰性對照。

1.3 觀察指標 為確保實驗的準確度與可靠性，本實驗制備的切片由我院兩位資深的病理醫(yī)師證實診斷。觀察Beclin-1及LC3在細胞內(nèi)的分布情況，細胞質(zhì)出現(xiàn)黃染，為陽性(+)，根據(jù)陽性細胞染色程度及著色細胞百分率進行計分，兩分值相加，0～2為陰性(-)，2～3為陽性(++)，4～6為強陽性(+++)[4]。

1.4 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS19.0來完成，采用χ2檢驗比較Beclin-1及LC3在胃癌組織及正常組織中的表達，并分析其表達與胃癌病理特征之間的關系，P≤0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 Beclin-1及LC3在胃癌組織中的表達 見表1。

表1 Beclin-1及LC3在胃癌組織中的表達[n(%)]

注：與健康胃粘膜組織比較，#P<0.05；與癌旁組織比較，*P<0.05。

2.2 Beclin-1及LC3與胃癌臨床特征間的相關性分析 見表2。

表2 Beclin-1及LC3與胃癌臨床特征間的相關性

3 討 論

隨著近年來人們生活壓力的增大及飲食不規(guī)律等，胃癌的發(fā)病率呈逐年升高的趨勢，成為臨床上消化道的主要惡性腫瘤[5-7]，胃癌早期患者多通過手術(shù)切除癌變部位，抑制癌細胞擴散，從而起到治療的作用。但是目前多數(shù)患者在臨床確診時已為晚期，手術(shù)切除難度大，多采用化療等治療手段，效果不佳，對患者的生活及生命安全帶來巨大威脅，生理上造成極大痛苦。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，自噬基因?qū)Π┌Y的診斷及治療越來越受到關注。

自噬是機體維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要機制，自噬基因的損傷或丟失造成機體內(nèi)環(huán)境紊亂，促進腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。Beclin-1是一種自噬的調(diào)控因子，該因子可以通過調(diào)節(jié)細胞增長，清除誘導細胞非正常凋亡的細胞及組織，抑制腫瘤的擴散[8-10]。本次研究探究Beclin在胃癌組織中表達時發(fā)現(xiàn)，Beclin-1在胃癌組織、癌旁組織及健康組織中的表達率分別為39.73% (58/146)、72.60%(106/146)、94.52%(138/146)，三者之間存在顯著差異。

LC3是自噬系統(tǒng)中不可缺少的蛋白，其表達量與自噬作用息息相關[11]，本次研究結(jié)果顯示：LC3的陽性率分別為43.15%(63/146)、77.40%(113/146)及93.15(136/146)，在胃癌組織中的表達率明顯低于癌旁組織及健康組織。在分析Beclin-1及LC3表達與臨床特征關系時發(fā)現(xiàn)，在年齡、性別及胃癌癌變部位等方面，兩種蛋白的表達無顯著性差異，但Beclin-1在病理分期T3～T4、高分化癌組織及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織中陽性表達率分別為17.46%(11/63)、11.94%(8/67)、17.79%(12/76)，顯著低于T1～T2分期、低分化程度及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織；另外LC3在病理分期T3～T4、高分化癌組織及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織中陽性表達率分別14.29%(9/63)、13.40%(9/67)、13.16%(10/76)，上述結(jié)果說明，Beclin-1及LC3的表達率與腫瘤的分期、分化及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關，該結(jié)果與羅小月文獻中的結(jié)果一致[12]。

綜上所述，胃癌組織中Beclin-1及LC3蛋白的表達量顯著低于正常組織及癌旁組織，提示與胃癌的發(fā)生及發(fā)展密切相關，隨著生物技術(shù)的進一步發(fā)展，Beclin-1及LC3在胃癌中的作用機制進一步明確，該生物標志物將對胃癌的診斷、治療及預后具有重要的臨床價值。

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Expression of autophagy related gene Beclin 1 and microtubule associatedprotein light chain 3 in gastric carcinoma and its clinical significance

SONG Hua-yong MA Lei

(Dept. of Oncology, The First Affiliated Hospital of Henan University,Kaifeng 475000, China)

Objective: To explore the expression of Beclin-1 and LC3 protein in gastric carcinoma tissues, and to analyze its clinical pathological significance. Methods: 146 patients were selected from March 2015 to March 2016 in our hospital, the gastric cancer tissues and paracancerous tissues were collected, and healthy mucosal tissues of 146 cases were collected as the control group, SP method was used in the detection of Beclin-1 and LC3, and the relationship between their expression and clinical pathological features was analyzed. Results: the highest expression of Beclin-1 and LC3 were in healthy tissues, and the lowest expression was in gastric carcinoma tissues, proteins in different gender, age and disease sites had no obvious difference between the two groups, but in the T3～T4 stage, high degree of differentiation and lymph node metastasis in gastric cancer tissue expression rate decreased significantly. Conclusion: The expressions of Beclin-1 in gastric cancer and LC3 protein is significantly lower than that of normal tissue and cancer tissue, suggesting that they are closely related with the occurrence and development of gastric cancer, and the study for the diagnosis of gastric cancer provides new ideas for prevention and treatment.

autophagy gene; Beclin-1; LC3; gastric cancer

宋華勇(1974—)，男，河南駐馬店人，本科，主治醫(yī)師，從事腫瘤內(nèi)科工作。

R735.2

A

1004-7115(2017)07-0731-03

10.3969/j.issn.1004-7115.2017.07.004

2017-04-08)