母牛卵泡期和黃體期子宮頸6種β-防御素的變化

王 皓，王 雪，王 晨，張貴學(xué)

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

?

實(shí)驗(yàn)研究

母牛卵泡期和黃體期子宮頸6種β-防御素的變化

王 皓，王 雪，王 晨，張貴學(xué)*

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

為了解母牛生殖道β-防御素的表達(dá)及與發(fā)情周期的關(guān)系，實(shí)驗(yàn)采用熒光定量PCR檢測卵泡期和黃體期母牛子宮頸6種β-防御素的變化。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在子宮頸中卵泡期和黃體期BNBD-4、BNBD-5的表達(dá)量無差異(P>0.05)，而卵泡期TAP、LAP1、BNBD-1、BNBD-10的表達(dá)量高于黃體期(P<0.05)。母牛子宮頸中6種β-防御素均有表達(dá)，其中TAP、LAP1、BNBD-1、BNBD-10的表達(dá)量呈周期變化，可能與發(fā)情周期中子宮頸口開張程度有關(guān)。

母牛；子宮頸；β-防御素

防御素是機(jī)體抵御環(huán)境微生物侵襲的重要屏障，可參與機(jī)體的適應(yīng)性免疫和先天性免疫[1]。1991年Diamond[2]在牛的氣管黏膜內(nèi)發(fā)現(xiàn)了第一種β-防御素，即氣管上皮抗菌肽(TAP)，后來相繼在牛舌的鱗狀上皮細(xì)胞、呼吸道、胃腸道、結(jié)膜和泌尿生殖道以及腦和胎盤中發(fā)現(xiàn)舌抗微生物肽(LAP)[3, 4]，在牛的嗜中性粒細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了13種β-防御素即BNBD-1～13[5]。有研究證實(shí)，LAP、TAP、BNBD-4在牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中表達(dá)[6]，雌性牦牛卵巢、輸卵管、子宮、陰道等組織均可表達(dá)LAP基因[7]。王桂榮等[8]從乳牛子宮內(nèi)膜中擴(kuò)增出防御素BNBD-5基因，證實(shí)乳牛子宮內(nèi)膜中有防御素基因的表達(dá)。牛發(fā)情周期由卵泡期和黃體期組成，防御素的變化是否與發(fā)情周期變化有關(guān)在牛還未見報道。很有必要對牛生殖道β-防御素發(fā)情周期中的變化進(jìn)行研究，為提高母牛繁殖率提供理論和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與樣品采集

實(shí)驗(yàn)動物選取成年健康中國荷斯坦母牛，來自哈爾濱市道外區(qū)屠宰場。屠宰后立刻選取4頭正常火山口型黃體(黃體期)和4頭卵巢上有明顯卵泡(卵泡期)的母牛的生殖器官，取子宮頸，將樣品橫切成約1 cm×1 cm小塊，冰冷的生理鹽水漂洗除去附著物，放入EP管，液氮中冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器與試劑

1.2.1 試劑與藥品

FastStart Universal SYBR Green Master (Rox)，購自德國羅氏公司；Trizol試劑，購自哈爾濱英俊生物技術(shù)有限公司；oligo dT引物、PrimeSTAR HS (Premix)、Easy Taq酶、dNTP、DNA Marker、RNase Inhibitor和各種內(nèi)切酶，購自寶生物工程(大連)有限公司；2×Taq PCR MasterMix，購自北京天根公司；瓊脂糖(Agarose)購自北京原平皓生物技術(shù)公司；ImProm-II reverse transcriptase，購自Promega公司；其他常規(guī)化學(xué)試劑源自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)設(shè)備處。

1.2.2 引物設(shè)計與合成

6種牛β-防御素cDNA序列通過GenBank查找，引物用Primer Premier 5.0和oligo 6設(shè)計得到。內(nèi)參基因?yàn)镚APDH2基因，用GAPDH1基因檢測反轉(zhuǎn)錄結(jié)果，引物序列見表1。引物合成自北京華大基因生物技術(shù)有限公司。

表1 基因特異性引物信息Table 1 List of gene specific primers

1.3 方法

1.3.1 提取子宮頸總RNA

本實(shí)驗(yàn)通過Trizol法提取母牛子宮頸總RNA，用DEPC水溶解RNA沉淀,后放置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 子宮頸總RNA反轉(zhuǎn)錄

子宮頸總RNA經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳(120 V，30 min)，分析合格后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄過程按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA放置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 實(shí)時熒光定量PCR檢測

以1.3.2步驟得到的 cDNA 稀釋液為模板，對實(shí)驗(yàn)?zāi)康幕蚝蛢?nèi)參基因(GAPDH2)進(jìn)行熒光定量PCR檢測，采用羅氏FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)試劑盒和ABI Prism 7500 sequence detection system，10 μl體系，在冰上配制，反應(yīng)體系及反應(yīng)條件參考于娜[9]。

1.3.4 2-ΔΔCt的計算方法

ΔCt=目的基因的Ct值—內(nèi)參基因的Ct值。

ΔΔCt=(實(shí)驗(yàn)組目的基因Ct值—實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參基因Ct值)—(對照組目的基因Ct值—對照組內(nèi)參基因Ct值)。

目的基因相對表達(dá)量=2-ΔΔCt。

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

數(shù)據(jù)表示為平均值(Means)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，統(tǒng)計分析使用SPSS 13.0軟件T檢驗(yàn)單因素方差分析(LSD)法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，P<0.05表示兩組數(shù)有統(tǒng)計學(xué)意義的顯著性差異。試驗(yàn)重復(fù)4×3次。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 總RNA提取結(jié)果

用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取子宮頸的總RNA(圖1)，實(shí)驗(yàn)得到清晰且無拖尾的三條帶，說明母牛子宮頸樣品 RNA是完整的。

圖1 總RNA提取結(jié)果M.DL-2000 Marker；1.RNA產(chǎn)物；2.RNA產(chǎn)物

2.2 內(nèi)參電泳結(jié)果

以樣品反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，進(jìn)行內(nèi)參基因表達(dá)的鑒定。凝膠電泳得到樣品反轉(zhuǎn)錄的清晰、單一條帶(圖2)，即全部樣品的內(nèi)參均在子宮頸中有所表達(dá)。

圖2 組織樣品內(nèi)參電泳結(jié)果M.DL-2000 Marker；1. PCR產(chǎn)物；2. PCR產(chǎn)物

2.3 β-防御素基因表達(dá)

由圖3可知：在子宮頸中，卵泡期和黃體期BNBD-4、BNBD-5的表達(dá)量無差異(P>0.05)，而卵泡期TAP、LAP1、BNBD-1、BNBD-10的表達(dá)量高于黃體期(P<0.05)。

圖3 發(fā)情周期子宮頸β-防御素表達(dá)

3 討論與分析

Quayle AJ 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，雌性生殖道防御素受雌激素的影響，在不同生理周期呈現(xiàn)不同的表達(dá)量。本實(shí)驗(yàn)表明，TAP、LAP1、BNBD-1、BNBD-4、BNBD-5、BNBD-10這6種β-防御素在母牛子宮頸中均有表達(dá)，且TAP、LAP1、BNBD-1、BNBD-10的表達(dá)量呈周期變化。

另外，6種防御素中BNBD-10明顯高于其他，推測BNBD-10可能在子宮頸防御機(jī)制中起主要作用。卵泡期雌二醇升高，子宮頸舒張有利于精子進(jìn)入[11，12]。此時期子宮受外界環(huán)境影響較大,可能導(dǎo)致各種防御素相較黃體期表達(dá)較高。

4 結(jié)論

母牛子宮頸中TAP、LAP1、BNBD-1、BNBD-4、BNBD-5、BNBD-10這6種β-防御素均有表達(dá)，BNBD-10在其中發(fā)揮主要作用。其中TAP、LAP1、BNBD-1、BNBD-10的表達(dá)量呈周期變化，可能與發(fā)情周期中子宮頸口開張程度有關(guān)。

[1] Ganz T. Lehrer Author information Defensins[J]. Pharmacol Ther. 1995,66(2):191-205.

[2] Cornet B, Bonmatin J M, Hertru C, et al. Refined three-dimensional solution structure of insect defensin A[J]. Structure, 1995, 3 (5): 435-448.

[3] Valore E V, Ganz T. Posttranslational processing of defensins in immature human myeloid cells[J]. Blood , 1992, 79: 1538-1544.

[4] Valore E V, Park C H, Quayle A J, et al. Human β defensin-1: an antimicrobial peptide of urogenital tisses[J]. J Clin Invest, 1998, 101: 1633-1642.

[5] Leonova L, Kokryakov VN, Aleshina G,et al. Circular minidefensins and posttranslational generation of molecular diversity[J]. J Leukoc Biol, 2001, 70:461-464.

[6] Davies D,Meade K G,Herath S,et al.Toll-like receptor and antimicrobial peptide expression in the bovine endometrium[J].Reprod Biol Endocrinol,2008,18(6):53.

[7] 欒紅雨,姚學(xué)萍,曹隨忠,等. 牦牛舌抗菌肽基因cDNA的克隆及其在生殖系統(tǒng)中的表達(dá)[J].中國獸醫(yī)科學(xué),2010,40(01):83-88.

[8] 王桂榮,嚴(yán)作廷,王東升,等.乳牛子宮內(nèi)膜抗菌肽BNBD5基因的克隆及其原核表達(dá)[J].中國獸醫(yī)科學(xué),2009,39(6):538-542.

[9] Yu N，Yang Z，Lin X，et al. Bovine Sertoli Cells defensive response after transfection pEGFP-N3-HNP-1 Plasmid [D].Harbin: The Northeast Agricultural University，2014，36-37.[10]Quayle A J, Porter E M, Nussbaum A A, et al. Gene expression, immunolocalization, and secretion of human defensin-5 in human female reproductive tract[J]. The American journal of pathology, 1998, 152(5): 1247.

[11]Falchi L, Scaramuzzi RJ. The expression of ERα, OTR, cPLA(2), COX-2, and PPARγ in the cervix of the ewe during the estrous cycle[J]. Theriogenology. 2013, 79(1):40-47.

2017-04-14

國家國際科技合作項(xiàng)目子課題(項(xiàng)目號：2011DFA30760-2-1)。

王皓(1993-)，男，碩士研究生。

*通信作者：張貴學(xué)，男，博士，教授。 Email：Gxzhang@neau.edu.cn

S823.3

A

1005-2739(2017)04-0003-04