基于肺臟特性中藥干預(yù)哮喘緩解期家兔的尿液代謝組學(xué)研究

陳馨馨 李友林

·論著·

基于肺臟特性中藥干預(yù)哮喘緩解期家兔的尿液代謝組學(xué)研究

陳馨馨1李友林2※

目的 哮喘(中醫(yī)哮病)緩解期的治療為該病向愈或發(fā)作加重的拐點。本實驗在成功建立哮喘緩解期動物模型的基礎(chǔ)上通過中藥干預(yù)檢測尿液代謝產(chǎn)物的變化，找出與哮喘發(fā)生機(jī)理以及中藥干預(yù)密切相關(guān)的代謝產(chǎn)物。方法 將實驗動物隨機(jī)分為對照組、模型組和中藥組，每組給予相應(yīng)干預(yù)后取尿液進(jìn)行代謝組學(xué)檢測，找出共有代謝產(chǎn)物，通過統(tǒng)計學(xué)分析確定有意義代謝產(chǎn)物。結(jié)果 檢測共有代謝產(chǎn)物31種，發(fā)現(xiàn)有意義代謝產(chǎn)物4種。結(jié)論 這4種代謝產(chǎn)物與支氣管哮喘的發(fā)生機(jī)理及中藥療效密切相關(guān)，為臨床診斷過敏性支氣管哮喘及判斷中藥療效提供參考。

代謝組學(xué) 支氣管哮喘 尿液 代謝產(chǎn)物 中藥干預(yù)

支氣管哮喘是一種常見且比較頑固難治的肺系疾患，甚至可以伴隨終身。我國目前已成為全球哮喘病死率最高的國家之一，如何提高支氣管哮喘的診斷率，其臨床意義重大。本課題組已成功建立支氣管哮喘緩解期模型家兔[1]，利用代謝組學(xué)的研究方法，鑒別出模型家兔血清[2]及支氣管肺泡灌洗液[3]中多項有意義代謝產(chǎn)物，我們現(xiàn)利用同樣代謝組學(xué)方法、方藥及統(tǒng)計學(xué)方法觀察尿液代謝產(chǎn)物的變化，從而為臨床診斷該病提供參考。

1.材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：選取純白色新西蘭家兔21只，由北京海淀興旺實驗動物養(yǎng)殖廠提供。隨機(jī)分為對照組、模型組和中藥組，每組7只。

1.1.2 造模藥物及儀器：① 卵蛋白干粉(ovalbumin,OVA)Ⅲ級，購自美國sigma公司；② 402A型超聲霧化器，由江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備有限公司出品；③ olympus顯微鏡；④ cytosprinⅡ細(xì)胞離心機(jī)(英國珊頓公司)；⑤ 北京普利生醫(yī)學(xué)儀器公司圖像自動分析系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 模型制備[1]：模型組和中藥組予10%卵蛋白溶液腹腔注射，對照組予等劑量生理鹽水腹腔注射。具體方法詳見參考文獻(xiàn)[1]。

1.2.2 法則制定及中藥干預(yù)：追述傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)史，由于宿痰伏肺，導(dǎo)致氣道攣急，而致發(fā)作性痰鳴氣喘的疾患?xì)v代醫(yī)家早有多種命名?！端貑枴り庩杽e論》有“喘鳴”之說；《金匱要略》則稱為“上氣”；直至元代朱丹溪才首創(chuàng)“哮喘”病名，把本病從籠統(tǒng)的“喘鳴”“上氣”中分離出來，后世醫(yī)家為與喘證區(qū)分，故名為“哮病”。

支氣管哮喘(中醫(yī)哮病)的分證論治分為發(fā)作期和緩解期。發(fā)時治標(biāo)，緩時治本。緩解期是指無急性發(fā)作，在相當(dāng)長的一段時間內(nèi)具有不同程度和頻度的“咳嗽、氣急、喘息和胸悶”等一系列癥狀。緩解期病機(jī)特征為虛實夾雜，正虛為主。該期分為肺虛、脾虛、腎虛三種證型。肺氣虛則氣短喘息，衛(wèi)外功能失司，外邪易侵而發(fā)為哮病。脾為肺“母”，子病盜母氣，脾虛水濕不運，母病及子，肺脾兩虛，則氣短喘促。腎為肺“子”，母病及子，腎虛攝納失常，氣不歸元，精氣虧乏，不能充養(yǎng)，因勞累等導(dǎo)致哮病發(fā)作。

中醫(yī)藥治療支氣管哮喘緩解期的患者是從“固本培元”的角度加強(qiáng)人體自身正氣，所謂“正氣存內(nèi)，邪不可干”，通過“固本”令肺脾腎三臟功能健運，以減少、緩解支氣管哮喘的發(fā)作。肺脾腎三臟之中肺為“華蓋之臟”，遇邪首當(dāng)其沖，故治療該病的關(guān)鍵就在于緩解期對肺臟的干預(yù)。西藥治療存在激素依賴、副作用較大等問題，而減少副作用、減少并發(fā)癥成為中醫(yī)藥治療的優(yōu)勢[4]。

肺臟生理特性為：以溫通和降為順，喜溫潤惡燥寒。生理功能為主氣、司呼吸，《素問·五臟生成篇》說:“諸氣者，皆屬于肺”。陳修園《醫(yī)學(xué)實在易》說：“氣通于肺臟，凡臟腑經(jīng)絡(luò)之氣，皆肺氣之所宣”。就氣與五臟的關(guān)系而言，氣關(guān)于脾，出于肺，根于腎。病理特性：肺為華蓋之臟，肺葉嬌嫩，不耐寒熱，容易被寒邪、燥邪等邪氣侵犯。

肺臟用藥性味特點:①《金匱要略·痰飲咳嗽篇》曰：“病痰飲者當(dāng)以溫藥和之”。痰飲得寒則聚，得溫則行，溫藥可以發(fā)越陽氣，溫化寒痰。故藥性宜溫潤，但“溫”又不可太過,太過則易化燥，當(dāng)以“和”為原則，故燥者應(yīng)佐之以“潤”。②《素問·陰陽應(yīng)象大論》曰:“辛生肺”。辛味藥入肺經(jīng),其清揚發(fā)散之性可宣達(dá)肺部,助肺發(fā)揮宣發(fā)肅降之功，還可通過皮毛驅(qū)散表邪。雷豐[5]《時病論》曰：“肺屬辛金，金性剛燥，所以惡寒冷而喜溫潤也”宜施“溫潤辛金法”。

就五行對五臟的角度而論，肺臟屬金。從相生關(guān)系而論，脾臟屬土，為其母臟；腎臟屬水，為其子臟。從相克關(guān)系而論，心臟屬火，火克金，心克肺；肝臟屬木，金克木，肺克肝。綜上所述，治療肺疾當(dāng)考慮五行關(guān)系及相生相克之法:虛證用補(bǔ)法，補(bǔ)其母臟(脾臟)，利用“培土生金”之法治療肺脾氣虛者。再者補(bǔ)其子臟(腎臟)，利用“金水相生”之法治療肺腎陰虛者。實證用瀉法，從相克關(guān)系考慮，利用“木火刑金”之法治療肝火犯肺之證。

綜合肺臟的生理特點、病理特性、用藥性味特點以及與五行相關(guān)的內(nèi)容可知肺病多喘，肺臟用藥宜“溫、潤、辛”。制定“溫潤辛金培本平喘”為基本法則。在該法則指導(dǎo)下擬中藥復(fù)方為基本方藥：五味子9g，酸、甘，溫，歸肺、心、腎經(jīng)；味酸收斂，甘溫而潤，能上斂肺氣，下滋腎陰，為治療久咳虛喘之要藥；量取9克，補(bǔ)益肺腎，斂肺氣而止喘咳，針對肺腎不足之喘咳用為君藥。淫羊藿4.5g，辛、甘，溫；歸腎、肝經(jīng)；補(bǔ)腎壯陽，止咳平喘；量取4.5g，輔五味子補(bǔ)益肺腎用為臣藥。防風(fēng)6g，辛、甘，微溫；歸膀胱、肝、脾經(jīng)；氣味俱升，甘緩微溫不峻烈，質(zhì)松而潤，祛風(fēng)之力較強(qiáng)，為“風(fēng)藥之潤劑”“治風(fēng)之通用藥”，功善祛風(fēng)止痙；量取6g，與五味子協(xié)同，固本而不留邪，共奏扶正祛邪之效用為佐使藥。蜜炙旋覆花(包煎)4.5g，苦、辛、咸，微溫；歸肺、胃經(jīng)；苦降辛開，降氣化痰平喘咳，蜜炙增加潤肺之效；量取4.5g包煎，功主降肺氣，與五味子、淫羊藿補(bǔ)益肺腎相伍亦為佐使藥。將上述方藥采取水煎法提取，95%乙醇濃縮，60℃干燥后制成細(xì)粉，每只實驗家兔每天灌胃藥粉量為0.35g，治療3天后化驗對照組、中藥組與模型組動物的尿液代謝產(chǎn)物。

1.2.3 尿液標(biāo)本采取：尿液是機(jī)體在新陳代謝過程中所產(chǎn)生的終產(chǎn)物，機(jī)體發(fā)生病變時，尿液中可出現(xiàn)一些異常成分?，F(xiàn)將選取造模成功的支氣管哮喘緩解期實驗家兔的尿液代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測分析，找尋出與有意義的代謝產(chǎn)物。把實驗家兔固定于解剖臺上，呈仰臥位，用碘伏將尿道口消毒后左手固定住家兔尿道口，右手持尖端涂有消毒凡士林或液體石蠟的導(dǎo)尿管緩慢地輕輕插入尿道，進(jìn)入約7～13cm。如果導(dǎo)尿管進(jìn)入膀胱腔，即有尿液流出，然后再用膠布將導(dǎo)尿管與家兔固定，用標(biāo)準(zhǔn)離心管接取尿液2ml，用離心機(jī)在室溫、9000rpm的條件下，離心15分鐘，采用氣相色譜——質(zhì)譜聯(lián)用(GC—MS)分析上清液。

1.2.4 檢測步驟：首先將40μL家兔尿樣加入10μL尿素酶，在37℃下培養(yǎng)10分鐘后，加入100μL甲醇混勻，然后再加入15μL核糖醇在70℃下100rmp離心搖勻15分鐘后，再130000rmp離心10分鐘取上清，吹干，加入40μL鹽酸甲氧胺(20mg/ml吡啶)、40μLMSTFA(含1%TMCS)，取上清液進(jìn)樣，分析儀得出圖譜。

2.結(jié)果

2.1 尿液代謝產(chǎn)物圖譜 ①得分圖(圖1)：代謝產(chǎn)物在不同象限中有明顯分開趨勢，說明組間代謝產(chǎn)物具有顯著差異性。

圖1 尿液代謝產(chǎn)物得分圖

②載荷圖(圖2)：越接近原點的變量對組間區(qū)分貢獻(xiàn)越小，反之貢獻(xiàn)則越大。

圖2 尿液代謝產(chǎn)物載荷圖

2.2 分析得出31種代謝產(chǎn)物 具體見表1。

表1 31種代謝產(chǎn)物

表2 對羥基苯乙酸

表3 木糖醇

表4 3，5-二羥基苯甲酸

表5 硬脂酸

注：上述對羥基苯乙酸、木糖醇、3，5-二羥基苯甲酸代謝產(chǎn)物模型組與對照組無差別(P>0.05)，中藥治療組與模型組有差別(P<0.05)，硬脂酸模型組與對照組有差別(P<0.05)，中藥治療組與模型組有差別(P<0.05)。此外的27種產(chǎn)物之間比較無顯著差異(P>0.05)。

3.討論

尿液中硬脂酸在模型組含量降低；對羥基苯乙酸、木糖醇、3，5-二羥基苯甲酸在模型組含量無明顯變化。含量發(fā)生變化的代謝產(chǎn)物由于哮喘的發(fā)生從而改變這些代謝產(chǎn)物的含量。對羥基苯乙酸、木糖醇、3，5-二羥基苯甲酸和硬脂酸在經(jīng)過中藥方劑治療后含量均降低，說明與中藥成分發(fā)揮作用密切相關(guān)。

由此得出硬脂酸可為臨床診斷支氣管哮喘提供參考。經(jīng)中藥方劑治療發(fā)生顯著變化的對羥基苯乙酸、木糖醇、3，5-二羥基苯甲酸和硬脂酸在判斷中藥治療支氣管哮喘是否具有療效方面意義重大。

1 陳馨馨，李友林.卵蛋白致敏新西蘭家兔建立支氣管哮喘模型[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2011，29(3)：473-475.

2 陳馨馨，李友林.仙味保金方治療過敏性支氣管哮喘模型家兔的血清代謝組學(xué)研究[J].中華中醫(yī)藥雜志，2014，29(2)：579-581.

3 陳馨馨，李友林.仙味保金方治療過敏性支氣管哮喘模型家兔的支氣管肺泡灌洗液代謝組學(xué)研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2013，31(10)：2098-2100.

4 周悅，楊繼兵.中醫(yī)藥治療哮喘的優(yōu)勢淺談[J].江西中醫(yī)藥，2009，40(8)：9-10.

5 清·雷豐.時病論[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2012，136.

陳馨馨，主治醫(yī)師，博士研究生。

1.公安邊防部隊總醫(yī)院 518029 2.中日友好醫(yī)院 100029

國家自然科學(xué)基金資助項目(編號:30772796)

10.3969/j.issn.1672-4860.2017.03.002

2017-3-26

※通訊作者：李友林，北京中日友好醫(yī)院國家中醫(yī)藥管理局重點研究室(肺病慢性咳喘)主任，博士研究生，現(xiàn)主要從事呼吸系統(tǒng)疾病的臨床與實驗研究。