MicroRNA-143/145對(duì)大鼠子宮內(nèi)膜異位癥的治療作用

梁宗文，趙淵，項(xiàng)軍淼，張安琪，余丹揚(yáng)，段萍

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 婦產(chǎn)科，浙江 溫州 325027）

MicroRNA-143/145對(duì)大鼠子宮內(nèi)膜異位癥的治療作用

梁宗文，趙淵，項(xiàng)軍淼，張安琪，余丹揚(yáng)，段萍

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 婦產(chǎn)科，浙江 溫州 325027）

目的：研究microRNA（miRNA）-143/145對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥（內(nèi)異癥）SD大鼠模型異位囊腫的治療作用。方法：采用自體移植的方法建立大鼠內(nèi)異癥模型，并在病理組織學(xué)水平進(jìn)行鑒定，選取18只建模成功的SD大鼠隨機(jī)分為空白組（n=6）、陰性對(duì)照組（n=6）、miR-143/145類似物組（n=6），分別予以相應(yīng)的處理，最后剖腹探查，用游標(biāo)卡尺測(cè)量SD大鼠內(nèi)異癥模型異位囊腫的大小，比較3組間異位囊腫體積的差異，并比較3組間組織病理學(xué)的變化。結(jié)果：SD大鼠內(nèi)異癥建模成功率為84%；異位囊腫體積差異：治療后空白組囊腫體積大小為（16.38±4.19）mm3，陰性對(duì)照組為（21.14±0.51）mm3，miR-143/145類似物組為（5.91±1.91）mm3，空白組與陰性對(duì)照組比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而miR-143/145類似物組與陰性對(duì)照組比囊腫體積明顯減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。病理組織學(xué)變化：空白組與陰性對(duì)照組異位病灶病理組織學(xué)形態(tài)相似，而陰性對(duì)照組與miR-143/145類似物組相比，腺體數(shù)量減少，腺體萎縮，間質(zhì)細(xì)胞排列雜亂。結(jié)論：miR-143/145可以使內(nèi)異癥的異位病灶萎縮而達(dá)到治療效果。

子宮內(nèi)膜異位癥；miR-143/145；大鼠；治療

子宮內(nèi)膜異位癥（簡(jiǎn)稱內(nèi)異癥），是子宮內(nèi)膜組織生長(zhǎng)在子宮腔以外的部位，以卵巢最多見(jiàn)。臨床癥狀以月經(jīng)不調(diào)、慢性盆腔痛和不孕為主，大大降低了患者的生活質(zhì)量，目前治療手段以手術(shù)為主，但術(shù)后復(fù)發(fā)率高[1-2]，且無(wú)針對(duì)內(nèi)異癥的特效藥。微小RNA（microRNA，miRNA）是包含18～25個(gè)核苷酸的非編碼RNA，通過(guò)結(jié)合于下游靶mRNA的3’非編碼區(qū)而調(diào)控基因的表達(dá)，使其表達(dá)下調(diào)或沉默[3-4]。miR-143和miR-145在染色體上基因位點(diǎn)非常接近，組成一個(gè)基因簇。研究表明miR-143/145在內(nèi)異癥中異常表達(dá)[5-6]。本課題組前期研究結(jié)果表明miR-143/145在內(nèi)異癥子宮內(nèi)膜組織中表達(dá)高于非內(nèi)異癥[7]。ADAMMEK等[8]報(bào)道m(xù)iR-145抑制內(nèi)異癥細(xì)胞的增殖侵襲和干細(xì)胞表型，表明miR-145可以在一定程度上影響內(nèi)異癥的發(fā)生發(fā)展，但是目前還缺乏miR-143/145基因簇影響內(nèi)異癥發(fā)生發(fā)展的在體實(shí)驗(yàn)，所以本研究通過(guò)建立SD大鼠內(nèi)異癥模型，將miR-143/ 145對(duì)內(nèi)異癥的作用進(jìn)行在體實(shí)驗(yàn)，探究miR-143/ 145是否可以作為治療內(nèi)異癥的一種新型藥物。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 性成熟雌性SD大鼠25只，6～8周齡，體質(zhì)量180～200 g，購(gòu)自溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（浙）2015-0001，給予標(biāo)準(zhǔn)光照（12 h光照，12 h黑夜），室內(nèi)溫度18～22 ℃，濕度40%～50%，標(biāo)準(zhǔn)飼料和水。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，所有大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉麻醉后頸椎脫臼安樂(lè)死。

1.2 實(shí)驗(yàn)器械及主要試劑 普通手術(shù)器械及眼科剪；miR-143、miR-145類似物（miR-143/145 mimic）及其陰性對(duì)照藥品（mimic NC）（廣州銳博生物科技有限公司）；動(dòng)物體內(nèi)轉(zhuǎn)染試劑（英格恩生物科技有限公司）；HE染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 SD大鼠內(nèi)異癥模型的建立[9]：造模前1 d每只大鼠肌注雌二醇0.1 mg/kg，使動(dòng)物統(tǒng)一處于動(dòng)情期。10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔麻醉，將大鼠固定后腹部備皮，常規(guī)消毒鋪洞巾，尿道口上方約1 cm處正中開(kāi)腹，行縱切口約3 cm，鈍鑷找到并分離出大鼠右側(cè)子宮，在近端離子宮角約1 cm處結(jié)扎子宮，遠(yuǎn)端離卵巢約2 cm處結(jié)扎子宮，迅速剪下子宮，置入磷酸鹽緩沖液中，剔凈系膜，縱向切開(kāi)子宮，盡可能剝除漿膜層，將內(nèi)膜組織剪成5 mm×5 mm大小的片段，部分用4%多聚甲醛進(jìn)行固定，做病理切片以證實(shí)是子宮內(nèi)膜組織，部分以內(nèi)膜面貼向腹壁，用4/0的縫合線分別在4個(gè)角各縫1針固定，腹腔注射氨芐青霉素16萬(wàn)IU/kg，然后逐層縫合腹壁和皮膚（見(jiàn)圖1）。術(shù)后第1天腹腔注射氨芐青霉素16萬(wàn)IU/kg，每天1次，連續(xù)5 d。術(shù)后第2天肌注雌激素0.1 mg/kg，4天1次，共3次。常規(guī)飼養(yǎng)。

1.3.2 異位囊腫體積的測(cè)量：建模4周后，10%水合氯醛腹腔注射，將大鼠麻醉后再次開(kāi)腹，建模成功的內(nèi)異癥大鼠中，移植的子宮內(nèi)膜內(nèi)充滿清亮液體，形成異位囊腫，肉眼大體觀察異位囊腫的形態(tài)及大小，用游標(biāo)卡尺測(cè)量異位病灶的長(zhǎng)、寬和高，計(jì)算異位囊腫體積=0.5×長(zhǎng)×寬×高。

1.3.3 標(biāo)本取材及HE染色：取左側(cè)未進(jìn)行手術(shù)的子宮及異位病灶，4%多聚甲醛固定48 h，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，HE染色進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。鏡下出現(xiàn)子宮內(nèi)膜、間質(zhì)、腺體或腺體樣結(jié)構(gòu)和出血中的2種便可以確認(rèn)造模成功。

1.4 藥物制備及動(dòng)物給藥

1.4.1 藥物制備：將核酸miR-143、miR-145類似物及陰性對(duì)照mimic NC用除菌雙蒸水稀釋至1 μg/μL，按說(shuō)明書將核酸及體內(nèi)轉(zhuǎn)染試劑按一定比例進(jìn)行混合：核酸（μg）/轉(zhuǎn)染試劑（μL）=2∶1，混合后常溫下靜置15 min。每個(gè)異位囊腫注射30 μL的轉(zhuǎn)染混合物（15 μL核酸+7.5 μL體內(nèi)轉(zhuǎn)染試劑+7.5 μL滅菌雙蒸水）。

1.4.2 動(dòng)物給藥：第1次術(shù)后4周，將SD大鼠隨機(jī)分為3組：空白組、陰性對(duì)照組、miR-143/145類似物組，每組分別注射30 μL 0.9%氯化鈉溶液、30 μL mimic NC混合物、30 μL miR-143/145 mimic混合物，基于英格恩體內(nèi)轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書，每隔3 d給藥1次，共4次，最后1次給藥48 h后處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，觀察記錄各組異位病灶形態(tài)及大小變化，并取異位病灶組織進(jìn)行石蠟包埋，病理生理學(xué)水平觀察各組間異位病灶的改變。

圖1 SD大鼠內(nèi)異癥模型的建立

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。結(jié)果以±s表示，計(jì)量資料用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠內(nèi)異癥模型的建立 用25只SD大鼠建立內(nèi)異癥模型，其中1只因麻醉過(guò)度死亡，1只因術(shù)后腹腔感染引起腸粘連及腸梗阻而死亡，建模4周后剖腹探查，有2只大鼠建模未成功，建模成功率為84%?？梢?jiàn)異位病灶呈囊性增大，圓形或橢圓形，內(nèi)含淡黃色或淡血性清亮囊液，異位囊腫表面及其周圍有血管形成，部分囊腫周圍也有少許結(jié)締組織包被（見(jiàn)圖1e）。輕輕取下完整的異位子宮內(nèi)膜病灶，及其對(duì)應(yīng)大鼠的在位子宮，與大鼠正常子宮作對(duì)比，組織病理學(xué)觀察可見(jiàn)，異位囊腫含有子宮內(nèi)膜腺體及其間質(zhì)細(xì)胞，光鏡下觀察固有層及固有層腺體樣結(jié)構(gòu)及其間質(zhì)細(xì)胞與在位內(nèi)膜和正常大鼠子宮內(nèi)膜相似，但異位組織腺體數(shù)量減少，有不同程度的纖維化，且異位內(nèi)膜上皮細(xì)胞呈低柱狀或鋸齒狀生長(zhǎng)，間質(zhì)層變薄，結(jié)締組織較多，在位內(nèi)膜及大鼠正常內(nèi)膜內(nèi)可見(jiàn)豐富的腺體結(jié)構(gòu)，腺上皮細(xì)胞呈柱狀或高柱狀生長(zhǎng)（見(jiàn)圖2）。

2.2 3組異位病灶的體積比較 選取建模良好的18只內(nèi)異癥大鼠，隨機(jī)分成空白組、陰性對(duì)照組和miR-143/145類似物組，3組的異位囊腫體積分別為：（19.88±1.15）mm3、 （20.66±0.91）mm3和（20.45± 0.52）mm3，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。給藥后空白組異位囊腫體積為（16.38±4.19）mm3，陰性對(duì)照組為（21.14±0.51）mm3，miR-143/145類似物組為（5.91±1.91）mm3，空白組和陰性對(duì)照組的異位囊腫體積大小差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但miR-143/145類似物組與陰性對(duì)照組比，異位囊腫體積明顯減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖3。

2.3 3組異位病灶的病理組織學(xué)比較 分別將空白組、陰性對(duì)照組及miR-143/145類似物組異位病灶固定切片后HE染色，光鏡下觀察，移植的子宮內(nèi)膜組織成活，形成的囊壁由內(nèi)向外分別為腺上皮細(xì)胞層、間質(zhì)細(xì)胞層及少量纖維結(jié)締組織，囊內(nèi)為少量白細(xì)胞及黏液。陰性對(duì)照組異位內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞呈低柱狀或立方形，排列在囊泡內(nèi)腔面，細(xì)胞間連接較緊密，細(xì)胞核大，呈橢圓形，胞漿豐富，內(nèi)膜間質(zhì)豐富?？瞻捉M與陰性對(duì)照組病理組織學(xué)結(jié)果相似，而miR-143/145類似物組子宮內(nèi)膜腺體萎縮，腺上皮層變薄，細(xì)胞呈立方或扁平狀，形態(tài)欠規(guī)則，間質(zhì)細(xì)胞排列紊亂，胞漿嗜堿性細(xì)胞增加。見(jiàn)圖4。

圖2 建模成功后子宮內(nèi)膜的病理組織學(xué)變化（HE，×200）

圖3 給藥后3組內(nèi)異癥病灶的體積

3 討論

內(nèi)異癥發(fā)生發(fā)展的機(jī)制尚不明確，但SAMPSON的“經(jīng)血逆流”是目前公認(rèn)的主要機(jī)制[10-12]。當(dāng)前內(nèi)異癥的治療以手術(shù)為主，但術(shù)后5年復(fù)發(fā)率仍有40%左右[13]，嚴(yán)重影響了廣大女性患者的生活質(zhì)量及治療積極性，目前內(nèi)異癥缺乏特別有效的治療方式及手段。

本課題組前期研究結(jié)果表明miR-143及miR-145在內(nèi)異癥異位病灶及在位內(nèi)膜的表達(dá)均高于非內(nèi)異癥的正常子宮內(nèi)膜[7]，亦有研究報(bào)道m(xù)iR-143/145在內(nèi)異癥中的高表達(dá)，一定程度上是抑制內(nèi)異癥的發(fā)生發(fā)展，但目前尚缺乏miR-143/145的活體實(shí)驗(yàn)。

圖4 給藥后各組異位病灶的病理組織學(xué)變化（HE，×200）

本研究采用自體移植的方法建立內(nèi)異癥大鼠模型，將建模成功的大鼠分為空白組、陰性對(duì)照組和miR-143/145類似物組，并進(jìn)行相應(yīng)的處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白組和陰性對(duì)照組相比miR-143/145類似物組子宮內(nèi)異癥異位病灶明顯縮小，在病理組織學(xué)水平，與空白組和陰性對(duì)照組相比miR-143/145類似物組子宮內(nèi)膜腺體數(shù)目減少，腺體萎縮，組織結(jié)構(gòu)排列紊亂，說(shuō)明miR-143/145可以使異位子宮內(nèi)膜萎縮，腺體分泌減少，從而使異位囊腫逐漸萎縮，進(jìn)而達(dá)到治療內(nèi)異癥的效果。

綜上所述，miR-143/145在內(nèi)異癥中表達(dá)失調(diào)，且在SD大鼠內(nèi)異癥模型中，miR-143/145有一定的治療效果，所以miR-143/145有可能成為內(nèi)異癥治療的新型藥物。但是在內(nèi)異癥中特異表達(dá)的miRNA數(shù)量眾多[14]，其調(diào)控機(jī)制復(fù)雜[15]，因此，尚需進(jìn)一步研究。

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（本文編輯：趙翠翠）

Effect of microRNA-143/145 on endometriosis in SD-rat models

LIANG Zongwen, ZHAO Yuan, XIANG Junmiao, ZHANG Anqi, YU Danyang, DUAN Ping. Department of Obstetrics and Gynecology, the Second Affi liated Hospital & Yuying Children’s Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027

Objective:To investigate the therapeutic effect of miR-143/145 on endometriosis cysts in SD rat models.Methods:The model of endometriosis in SD rats was established by autologous transplantation, and was identified at the histopathological level. Eighteen SD rats were randomly divided into blank control group (n=6), negative control group (n=6) and miR-143/145 mimic group (n=6), were given the corresponding treatment, respectively. Finally laparotomy, and the size of ectopic cysts were measured by vernier caliper, and the volume of ectopic cysts were compared among the three groups. The histopathological changes of the three groups were also compared.Results:The successful rate of modeling of endometriosis in SD rats was 84%. After treatment, the difference in the volume of ectopic cysts in each group： the volume of ectopic cysts in control group was (16.38±4.19) mm3, negative control group was (21.14±0.51) mm3, miR-143/145 mimic group was (5.91±1.91) mm3. There was no signifi cant difference between the blank control group and the negative control group (P＞0.05), however, the volume of ectopic cysts in the miR-143/145 mimic group was signifi cantly reduced compared with negative control group (P＜0.01). The histopathological changes： the histopathological morphology of ectopic cyst in blank control group and negative control group was similar, but in miR-143/145 mimic group the number of glands was decreased, the glandular atrophy, and the arrangement of stromal cell were messy compared with the mimic NC group.Conclusion:MiR-143/145 can atrophy ectopic cysts of endometriosis and achieve therapeutic effect.

endometriosis; miR-143/145; rats; treatment

R711.71

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.06.002

2016-11-08

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（8140060904）；浙江省衛(wèi)生廳平臺(tái)重點(diǎn)資助項(xiàng)目（2013RCA035）；溫州市科技局科研基金資助項(xiàng)目（Y20100175）；浙江省科技廳公益項(xiàng)目（2014C37003）。

梁宗文（1990-），女，甘肅白銀人，碩士生。

段萍，主任醫(yī)師，Email：dppddpp@126.com。