青娥丸對去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松骨微循環(huán)的作用機制研究

王曉燕 常時新 李冠武 何靜 王樂 宋彥穎 繆宇

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青娥丸對去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松骨微循環(huán)的作用機制研究

王曉燕 常時新 李冠武 何靜 王樂 宋彥穎 繆宇

目的 通過觀察青娥丸對卵巢切除骨質(zhì)疏松大鼠骨髓灌注及血管內(nèi)皮生長因子的影響，探討經(jīng)典方劑青娥丸對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松骨微循環(huán)的作用機制。 方法 將6月齡SD雌性大鼠60只隨機分為4組，即假手術(shù)組(SHAM組)、去勢對照組(OVX組)、青娥丸組(QEW組)和雌激素組(E2組)。建模8周后，分別進行藥物干預3個月，檢測各組大鼠股骨遠端、中端、近端的骨髓灌注參數(shù)以及血管內(nèi)皮標志物血小板-內(nèi)皮細胞黏附分子(platelet endothelial cell adhesion molecule-1，CD31)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelium growth factor，VEGF)表達情況。 結(jié)果 骨髓灌注參數(shù)：(1)股骨遠端：治療后OVX組容積轉(zhuǎn)移常量(Ktrans)、速率常數(shù)(Kep)、滲漏空間(Ve)水平較治療前均有明顯降低(P<0.01)，E2組和QEW組Ktrans、Kep、Ve水平較治療前均有明顯增加(P<0.05)；與OVX組比較，治療后E2組和QEW組Ktrans、Kep、Ve水平均顯著增加(P<0.01)；而QEW組Ktrans水平顯著低于E2組(P<0.01)、兩組Kep、Ve水平無明顯統(tǒng)計學差異。(2)股骨中端：治療后，OVX組Ktrans(P<0.01)及Ve(P<0.05)水平較治療前顯著降低，E2組Ktrans、Kep及Ve水平均明顯增加(P<0.05)；與OVX組比較，E2組Ktrans、Kep(P<0.05)及Ve(P<0.01)水平均顯著增加，QWE組Ktrans(P<0.05)、Ve(P<0.01)水平顯著增加。(3)股骨近端：E2組Ktrans(P<0.01)及Ve(P<0.05)水平較OVX組均顯著增加，而QEW組Ktrans水平無明顯差異。血管內(nèi)皮標志物CD31、VEGF表達情況：E2組和QEW組CD31及VEGF蛋白表達及相對表達量較OVX組均顯著上調(diào)(P<0.05、P<0.01)。結(jié)論 青娥丸治療絕經(jīng)后大鼠骨質(zhì)疏松癥，可能與提高骨髓灌注、改善骨髓微循環(huán)等作用機制相關(guān)。

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥； 青娥丸； 骨髓灌注； 骨髓微循環(huán)

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是以骨量降低和骨結(jié)構(gòu)退化為特點，導致骨脆性和骨折風險增加的一種全身性骨骼疾病[1]，往往易引起脊柱骨和髖骨骨折。骨質(zhì)疏松性骨折的患病率和發(fā)病率持續(xù)增加，已成為許多國家的國民健康問題，原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥主要發(fā)生在老年人群中，中老年女性最為常見，尤其是絕經(jīng)后婦女[2]，導致骨質(zhì)疏松癥的經(jīng)濟負擔加重[3]。

目前，臨床許多藥物均可用于對骨質(zhì)疏松癥的治療，特定化合物的使用選擇應該通過療效和安全性作為指導，新的和潛在的非常有效的藥物目前正在研發(fā)，可能會提供新穎的治療手段。中醫(yī)藥治療本病具有多靶點、不良反應少等優(yōu)勢，是相對較安全的治療途徑。青娥丸是補腎生髓治療骨質(zhì)疏松的古代經(jīng)典方劑，相關(guān)臨床研究發(fā)現(xiàn)[4]，青娥丸能夠改善絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的臨床癥狀。為進一步明確其作用機制，本研究擬通過卵巢切除術(shù)建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型，通過觀察藥物對骨髓灌注和血管內(nèi)皮標志物的研究，探析青娥丸對骨髓微循環(huán)的影響，為中醫(yī)藥治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥提供新的理論支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級雌性SD大鼠60只，體重(350±15) g，購置于上海斯萊克實驗動物有限公司，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院動物實驗中心，合格證號：SYXK(滬)2006-0001。飼養(yǎng)觀察室溫度：(21±2)℃，相對濕度：45%～55%，給予標準光照周期。

1.2 實驗藥品

青娥丸由杜仲(鹽炒)480 g、補骨脂(鹽炒)240 g、核桃仁(炒)150 g、大蒜120 g制成大蜜丸(9 g/丸)，購自上海雷允上封浜制藥有限公司，批號：Z31020467；針劑β-雌二醇(β-Estradiol，≥98%)，購自 Sigma公司，批號：E8875。

1.3 主要試劑與儀器

EDTA(pH 9.0) 抗原修復液(武漢谷歌生物科技有限公司，G1203)、BSA(Solarbio，A8020)、正常兔血清(Boster，AR1010)、二抗：HRP-山羊抗兔二抗(谷歌生物，GB23303)、一抗(VEGF)(abcam，ab1316)、二抗：HRP-山羊抗小鼠二抗(谷歌生物，GB23301)、一抗(CD31)(谷歌生物，GB13063)、二抗：HRP-兔抗山羊二抗(谷歌生物，GB23204)、組化試劑盒DAB顯色劑(DAKO，K5007)、RIPA組織細胞快速裂解液(上?；鶢栴D生物，BYL40825)、BCA蛋白定量試劑盒(thermo，PICPI23223)、SYBRGreen PCR試劑盒(Invitrogen)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen)等。

3.0T磁共振儀器(德國西門子股份公司)、3T老鼠線圈(上海辰光醫(yī)療科技有限公司)、電泳儀BIO-RAD 公司 (mini protean 3 cell)、電轉(zhuǎn)儀(大連競邁科技有限公司，PS-9)、酶標儀(芬蘭雷勃酶標儀，MK3)、Real-time(檢測儀ABI，ABI-7500)、脫水機(武漢俊杰電子有限公司，JJ-12J)、正置熒光顯微鏡(日本尼康，NIKON ECLIPSE TI-SR)、成像系統(tǒng)(日本尼康，NIKON DS-U3)、酶標儀(THERMO SCIENTIFIC MULTISKAN SPECTRUM)等。

1.4 分組及造模

將60只SD雌性大鼠按照隨機數(shù)字法分為4組，即假手術(shù)組(SHAM組)，去勢(摘除卵巢)對照組(OVX組)、青娥丸組(QEW)、雌激素組(E2)，每組15只。因?qū)嶒炦^程中各組均有死亡，故每組均取8只。

采用卵巢切除術(shù)建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型：實驗動物適應環(huán)境1周后，采用戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉，將動物仰臥位固定于手術(shù)臺上，電動剃毛，手術(shù)區(qū)域皮膚消毒，保持無菌操作。正中部位打開腹腔，輸卵管遠端用血管鉗固定、結(jié)扎，將子宮闊韌帶分離，摘除雙側(cè)卵巢，將小腸等腹腔器官組織復位，關(guān)閉腹腔，并對手術(shù)切口進行縫合。假手術(shù)組僅切除卵巢周圍等量脂肪組織即可[5]。

術(shù)后即刻肌注青霉素(40萬U/kg)，連續(xù)5天，每天2次，預防傷口感染。標準鼠籠分籠飼養(yǎng)，自由進食、進水。所有實驗鼠術(shù)前及術(shù)后均稱體重。術(shù)后密切觀察，注意傷口感染征象。

1.5 給藥方法

建模8周后，各組分別進行藥物干預。青娥丸組：青娥丸按照9 g/kg臨床劑量，根據(jù)動物間體表面積折算的等效劑量換算，予0.84 g/500 g，每天灌胃2次；雌激素組：予β-雌二醇0.2 mL/kg藥物干預；正常組、假手術(shù)組及OVX對照組分別給予等量去離子水。根據(jù)每周體重調(diào)整藥物劑量，共給藥12周。

1.6 檢測指標

動物處死前第14天和第13天腹腔注射鹽酸四環(huán)素，處死前第4天、第3天腹腔注射鈣黃綠素，進行骨熒光雙標記。藥物干預結(jié)束后，于次日腹主動脈取血后處死所有動物，剝離脛骨及腰椎，-80℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.1 藥代動力學兩室模型DCE-MRI成像檢測 使用3.0T臨床全身掃描儀，專用大鼠線圈作為射頻信號接收器。分別于基線(0周)、治療前、治療后對各組實驗大鼠行股骨3.0T DCE-MRI掃描，對比劑為釓噴酸葡胺(gadopentetate dimeglumine，Gd-DTPA)，劑量0.1 mL/500 g，尾靜脈注射，速率1 mL/s，注射后常規(guī)1 mL生理鹽水沖管。

掃描結(jié)束后，將數(shù)據(jù)依次導入系統(tǒng)自帶的MR圖像專用后處理工作站(版本號：syngo MR B17_43.1_1.0)[2]，以盲法對DCE-MRI圖像進行后處理：基于改進的“兩室藥物代謝動力學模型”，從采集到的動態(tài)組圖像建立病灶區(qū)感興趣區(qū)內(nèi)的平均信號強度-時間曲線，建立動脈輸入函數(shù)，采用非線性最小二乘擬合法對該曲線進行擬合，計算定量功能灌注參數(shù)[3]，包括：(1)容積轉(zhuǎn)移常量(Ktrans)：對比劑在血管內(nèi)向血管外間隙滲透的速率，單位為min-1；(2)速率常數(shù)(kep)：血管外細胞外間隙的對比劑向血管內(nèi)反滲透的參數(shù)，單位為min-1；(3)血管外細胞外容積比，即滲漏空間(Ve)：成像區(qū)域的血管外間隙容量比例。且Ktrans、kep、Ve三者滿足如下關(guān)系：kep =Ktrans/Ve。

1.6.2 免疫組化檢測骨組織VEGF、CD31表達情況 石蠟切片脫蠟脫水后，將組織切片置于盛滿EDTA抗原修復緩沖液(PH9.0)的修復盒中于微波爐內(nèi)進行抗原修復，低火10 分鐘，切片放入3%過氧化氫溶液，室溫避光孵育25 分鐘，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，用3%BSA室溫封閉30分鐘，加一抗?jié)窈袃?nèi)4°C孵育過夜，加與一抗相應種屬的二抗(HRP標記)覆蓋組織，室溫孵育50分鐘，DAB顯色，Harris蘇木素復染細胞核3分鐘左右，1%的鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來水沖洗，氨水返藍，流水沖洗，脫水封片，顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

結(jié)果判讀及形態(tài)計量學分析：顯微鏡下細胞胞漿著色呈棕黃色為陽性反應。隨機挑選5個高倍視野(400×)進行細胞計數(shù)，后將每個鏡下視野內(nèi)胞漿著色呈棕黃色的陽性細胞計數(shù)，計算陽性細胞數(shù)占所測視野內(nèi)細胞總數(shù)的百分比，以此作為陽性反應細胞的密度[6]。

1.6.3 免疫印跡法檢測骨組織CD31、VEGF表達情況 將組織在液氮中迅速研磨成粉末，轉(zhuǎn)移到含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的裂解液的離心管，4℃，12000 rpm，離心15分鐘，取上清，進行蛋白質(zhì)定量，配置BCA工作液(試劑A∶試劑B=50∶1)，測定吸光度(562 nm)，繪制標準曲線，制備PAGE膠，上樣，電泳，膜上蛋白檢測，膜封閉及抗體孵育，顯色。

數(shù)據(jù)采用儀器自帶軟件ABI Prism 7300 SDS Software進行分析，將得到的Ct導出，利用2-△△Ct法[7]，以GAPDH為內(nèi)參，進行各樣本基因表達的相對定量分析。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 治療前后骨髓灌注參數(shù)比較

股骨遠端：Ktrans水平：治療后OVX組較治療前明顯降低(P<0.01)，E2組和QEW組較治療前均有明顯增加(P<0.05)；與OVX組比較，治療后E2組和QEW組均顯著增加(P<0.01)；而治療后，QEW組Ktrans水平低于E2組，且具有統(tǒng)計學差異(P<0.01)。Kep水平：治療后OVX組較治療前明顯降低(P<0.01)，E2組較治療前顯著增加(P<0.01)，QEW組較治療前也有明顯增加(P<0.05)；與OVX組比較，治療后E2組和QEW組均顯著增加(P<0.01)，而E2組和QEW組無明顯統(tǒng)計學差異。Ve水平：治療后OVX組較治療前明顯降低(P<0.01)，E2組和QEW組較治療前均有明顯增加(P<0.05)；與OVX組比較，治療后E2組和QEW組均顯著增加(P<0.05)，而E2組和QEW組無明顯統(tǒng)計學差異。

股骨中端：Ktrans水平：治療后OVX組較治療前明顯降低(P<0.01)，E2組較治療前明顯增加(P<0.05)；與OVX組比較，E2組顯著增加(P<0.01)，QWE組也明顯增加(P<0.05)。Kep水平：治療后E2組較治療前顯著增加(P<0.05)；與OVX組比較，E2組顯著增加(P<0.05)。Ve水平：治療后OVX組較治療前明顯降低(P<0.05)，E2組較治療前顯著增加(P<0.01)，QWE組也明顯增加(P<0.05)；與OVX組比較，E2組顯著增加(P<0.01)，QEW組也顯著增加(P<0.01)；治療后，QEW組Ve水平低于E2組，且具有統(tǒng)計學差異(P<0.01)。

股骨近端：Ktrans水平：E2組較OVX組顯著增加(P<0.01)，而QEW組Ktrans水平無明顯差異；E2組治療后Ve水平較治療前顯著增加(P<0.05)。具體結(jié)果見表1、圖1。

圖1 DCE-MRI骨髓灌注后處理圖像

表1 治療前后各組實驗鼠骨髓灌注參數(shù)變化±s，n=8)

注： 組內(nèi)比較，aP<0.05，bP<0.01；與OVX組比較，cP<0.05，dP<0.01；與雌激素組比較，eP<0.05，fP<0.01。

2.2 免疫組化驗證骨組織中CD31、VEGF蛋白表達情況

采用Qwin V3圖像分析系統(tǒng)進行計數(shù)。結(jié)果顯示： CD31蛋白和VEGF蛋白在各組實驗鼠中均有表達。(1)與SHAM組比較，OVX組大鼠脛骨CD31蛋白陽性表達密度顯著降低(P<0.01)，而E2組CD31蛋白陽性表達密度明顯降低(P<0.05)，QEW組CD31陽性表達密度有所降低，但并無統(tǒng)計學差異；OVX組大鼠脛骨VEGF蛋白陽性表達密度顯著降低(P<0.01)，QEW組CD31陽性表達密度有所降低，但并無統(tǒng)計學差異。(2)與OVX組比較，E2組和QEW組CD31蛋白陽性表達密度顯著增高(P<0.01)，QEW組VEGF蛋白陽性表達密度顯著增高(P<0.01)，而E2組無明顯變化。結(jié)果見表2、圖2～3。

表2 各組大鼠骨組織CD31、VEGF蛋白表達陽性密度

注： 與SHAM組比較，aP<0.05；與OVX組比較，bP<0.01。

注：A.SHAM組；B.OVX組；C.青娥丸組；D.雌激素組

圖2 骨組織CD31蛋白表達情況(×400)

2.3 免疫印跡測定骨組織中CD31、VEGF表達情況

CD31：與SHAM組比較，OVX組CD31蛋白表達下調(diào)(P<0.05)；與OVX組比較，E2組和QEW組均使CD31蛋白表達上調(diào)(P<0.05)，而E2組和QEW組無明顯統(tǒng)計學差異。

注：A.SHAM組；B.OVX組；C.青娥丸組；D.雌激素組

圖3 骨組織VEGF蛋白表達情況(×400)

VEGF：與SHAM組比較，OVX組VEGF蛋白表達下調(diào)(P<0.05)；與OVX組比較，E2組VEGF蛋白表達上調(diào)(P<0.05)，QEW組VEGF蛋白表達亦上調(diào)(P<0.01)，而E2組和QEW組無明顯統(tǒng)計學差異。結(jié)果見表3、圖4。

表3 各組大鼠骨組織中CD31、VEGF表達水平

注： 與SHAM組比較，aP<0.05；與OVX組比較，bP<0.05，cP<0.01。

圖4 骨組織中CD31、VEGF表達情況

2.4 實時熒光定量PCR測定骨組織中CD31、VEGF表達情況

CD31：與SHAM組比較，OVX組CD31相對表達量下調(diào)(P<0.05)；與OVX組比較，E2組和QEW組均顯著上調(diào)CD31相對表達量(P<0.01)，且E2組和QEW組無明顯統(tǒng)計學差異。

VEGF：與SHAM組比較，OVX組VEGF相對表達量顯著下降(P<0.05)；與OVX組比較，E2組VEGF相對表達量上調(diào)(P<0.05)，QEW組VEGF相對表達量顯著上調(diào)(P<0.01)，且E2組和QEW組無明顯統(tǒng)計學差異。

表4 各組大鼠骨組織中CD31、VEGF表達水平

注： 與SHAM組比較，aP<0.05；與OVX組比較，bP<0.05，cP<0.01。

3 討論

本研究采用的是用于分析灌注過程最常用的藥代動力學模型改良后的Tofts模型，Ktrans表示容量轉(zhuǎn)移常數(shù)，Ve表示血管外細胞外間隙容積比，通過DCE-MRI藥代動力學研究骨髓灌注和骨密度之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)隨著骨礦物質(zhì)含量的丟失，血管壁的性質(zhì)以及骨髓內(nèi)容物也可能不同，由此產(chǎn)生的血流灌注變化反過來也可能影響骨骼的營養(yǎng)供給[8]。Kep表示速率常數(shù)，在骨質(zhì)疏松大鼠的股骨和腰椎，其下降最為顯著，在組織形態(tài)學中也可觀察到稀疏和成熟的血管，尤其是在骨盆，血管密度顯著降低，成熟血管顯著增加。由于毛細血管稀疏和成熟，骨質(zhì)疏松大鼠骨髓微循環(huán)發(fā)生改變[9]。以上結(jié)果提示，在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松發(fā)生發(fā)展過程中，青娥丸對股骨遠端及中端骨髓灌注參數(shù)作用較為明顯，其作用機制可能與骨髓微血管生成有關(guān)。

骨本身具有發(fā)達的血管網(wǎng)絡(luò)，骨微血管在骨的形成、發(fā)展、修復和重建過程中起著重要的作用[10]。血管生成先于新骨形成，新骨形成與骨微血管的改變是成比例的。骨量的減少總是與骨微血管在骨髓腔中的低灌注伴隨發(fā)生，這些現(xiàn)象表明，微循環(huán)障礙與骨形成能力下降密切相關(guān)[11-14]。在骨再生療法血管生成過程中，CD31和VEGF均起到一定的協(xié)調(diào)作用[14]。

綜上，青娥丸對去勢大鼠具有治療作用，其作用機制可能與通過提高骨髓灌注及改善骨髓微循環(huán)有關(guān)。

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(本文編輯： 韓虹娟)

Effect and mechanism ofQing’Eformula on bone microcirculation of osteoporosis rats induced by ovariectomy

WANGXiaoyan,CHANGShixin,LIGuanwu,etal.

Guang’anmenHospital,ChinaAcademyofChineseMedicineSciences,Beijing100053,China

CHANGShixin,E-mail:shixinchang@126.com

Objective To observe the effects ofQing’Eformula on bone marrow perfusion and vascular endothelial grouth factor in Postmenopausal Osteoporosis(PMOP) rats induced by oophorectomy, explore the possible mechanism of classical prescriptionQing’Eformula on bone microcirculation. Methods Sixty female SD rats of 6 month-old infants were randomly divided into SHAM group, OVX group,Qing’Eformula group and E2group, PMOP model was established by oophorectomy, 8 weeks after modeling, rats were medicated once a day for 3 months. Detect the bone marrow perfusion parameters of distal femur, mid femur and proximal femur, as well as vascular endothelial marker expression. Results Bone marrow perfusion parameters: (1) Distal femur: The level of Ktrans, Kep, Ve in OVX group were significantly decreased while those were increased in E2group and QEW group after treatment, and significantly higher than OVX group. The level of Ktrans in QEW group were significantly lower than E2group, the level of Kep and Ve have no significant difference. (2) Mid femur: the level of Ktrans and Ve in OVX group were significantly decreased. The level of Ktrans, Kep and Ve in E2group were significantly increased and Ktrans and Ve increased in QEW group were significantly higher than OVX group. (3) Proximal femur: the level of Ktrans and Ve in E2group were significantly higher than OVX group, but no significant differences between two groups. Vascular endothelial marker CD31, VEGF expression: the protein expression and relative expression of CD31 and VEGF in E2group and QEW group were significantly increased compared with OVX group. ConclusionQing’Eformula can treat PMOP, which may be associated with increasing bone marrow perfusion and improving bone marrow microcirculation.

Postmenopausal osteoporosis;Qing’Eformula; Bone marrow perfusion; Bone marrow microcirculation

國家自然科學基金面上項目(81373856)

100053 北京，中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院腫瘤科(王曉燕)；上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院放射科(常時新、李冠武、何靜、王樂、宋彥穎、繆宇)

王曉燕(1986- )，女，博士，住院醫(yī)師。研究方向：中醫(yī)腫瘤。E-mail：xiaoyansh2010@126.com

常時新(1966- )，博士，主任醫(yī)師，博士生導師。研究方向：中西醫(yī)結(jié)合治療老年病。E-mail：shixinchang@126.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.07.006

2016-10-13)