兩種測(cè)定醬油中氨基酸態(tài)氮方法的探討

章銀珠，趙春玲，張書芬

（寧波市食品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，浙江寧波315000）

兩種測(cè)定醬油中氨基酸態(tài)氮方法的探討

章銀珠，趙春玲，張書芬

（寧波市食品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，浙江寧波315000）

該研究探討了醬油中氨基酸態(tài)氮測(cè)定的兩種方法：酸度計(jì)法和比色法。因兩種方法間有無差異尚未有定論，依據(jù)GB5009.235—2016《食品中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定》標(biāo)準(zhǔn)，通過探討影響測(cè)定結(jié)果的關(guān)鍵因素和操作注意事項(xiàng)來保證方法的準(zhǔn)確性，再抽取市售10種醬油，分別用兩種方法測(cè)定其氨基酸態(tài)氮含量，試驗(yàn)結(jié)果顯示，兩種方法檢測(cè)結(jié)果無顯著性差異（P＞0.05）。

醬油；氨基酸態(tài)氮；酸度計(jì)法；比色法

醬油是我國(guó)傳統(tǒng)的調(diào)味品，具有悠久的歷史，其味道鮮美，富含多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，集調(diào)色、調(diào)味于一體。醬油獨(dú)特的美味主要是鮮味，LIOE H N等[1-2]指出，醬油的鮮味主要是一些分子質(zhì)量＜500 u的成分，而游離氨基酸是在鈉鹽存在情況下對(duì)味覺有重要作用的低分子化合物。還有一些肽類物質(zhì)盡管含量極低，但是對(duì)鮮味也有很大的貢獻(xiàn)。因此，氨基酸態(tài)氮含量的高低是衡量醬油質(zhì)量?jī)?yōu)劣的重要指標(biāo)。

氨基酸測(cè)定的方法通常是基于氨基酸的分子結(jié)構(gòu)來定量其中的氨基或者羧基。醬油的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 18186—2000《釀造醬油》規(guī)定了其氨基酸態(tài)氮含量的檢測(cè)方法為甲醛值法，其原理為定量羧基，加入甲醛以固定氨基的堿性，使羧基顯示出酸性，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液定量。該法分析成本低，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，因此應(yīng)用十分廣泛，但是速度較慢，檢測(cè)過程中的影響因素也較多。新實(shí)行的國(guó)標(biāo)GB 5009.235—2016《食品中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定》規(guī)定了醬油氨基酸態(tài)氮的檢測(cè)方法分別為酸度計(jì)法（甲醛值法）和比色法[3]。比色法的原理為定量氨基，操作簡(jiǎn)便、靈敏、快速、取樣量少，適合批量處理，但是該法應(yīng)用不普遍，且與酸度計(jì)法相比，兩者結(jié)果的差異性尚未有定論：胡明友[4]認(rèn)為兩法無顯著性差異（P＞0.05），結(jié)果令人滿意；劉佳寧[5]的檢測(cè)結(jié)果是兩法有顯著性差異（P＜0.05）。本實(shí)驗(yàn)用這兩種方法分別對(duì)市售的多種不同等級(jí)的醬油的氨基酸態(tài)氮含量進(jìn)行多次測(cè)定，進(jìn)行比較，以期得到一個(gè)可靠的結(jié)果，供檢驗(yàn)同行以借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醛溶液（體積分?jǐn)?shù)36%～38%）、氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液（0.05 mol/L）、乙酸-乙酸鈉緩沖溶液（pH4.8）、顯色劑（15mL37%甲醛與7.8mL乙酰丙酮混合，加水稀釋至100mL，劇烈振搖混勻）、氨基酸態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1.0 mg/mL、0.1 mg/mL）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

醬油樣品（15種樣品分別編號(hào)為1#～15#）：市售。

1.2 儀器與設(shè)備

PB-21酸度計(jì)：德國(guó)賽多利斯公司；T6系列紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 酸度計(jì)法[6]

稱取5.0g（精確至0.1mg）試樣（m），用水稀釋至100mL（V4）混勻。吸取10.0 mL（V3）稀釋液于燒杯中，加60 mL水，在磁力攪拌下用濃度（c）為0.05 mol/L的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定至酸度計(jì)指示pH為8.2。加入10.0mL甲醛溶液，混勻，再用0.05mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定至酸度計(jì)指示pH為9.2。記錄加入甲醛溶液后消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液體積（V1）。同時(shí)取70 mL水，做試劑空白試驗(yàn)（V2）。氨基酸態(tài)氮計(jì)算公式如下：

1.3.2 比色法

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：移取氨基酸態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)使用溶液0、0.05 mL、0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL（相當(dāng)于NH3-N0、5.0μg、10.0μg、20.0μg、40.0μg、60.0μg、80.0μg、100.0μg）分別于10 mL比色管中，加入4 mL乙酸-乙酸鈉緩沖溶液及4 mL顯色劑，用水稀釋至刻度混勻。置100℃水浴中加熱15min后取出，冷卻至室溫后移入1 cm比色皿內(nèi)，以零管為參比，于波長(zhǎng)400 nm處測(cè)量吸光度值，繪制氨基酸態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程。

稱取1.00 g（m）試樣于100 mL（V2）容量瓶，用水稀釋至刻度混勻。吸取0.50 mL（V1）稀釋液于10 mL比色管中，加入4 mL乙酸-乙酸鈉緩沖溶液及4 mL顯色劑，用水稀釋至刻度混勻。置100℃水浴中加熱15 min后取出，冷卻至室溫后移入1 cm比色皿內(nèi)，以零管為參比，于波長(zhǎng)400 nm處測(cè)量吸光度值。同時(shí)進(jìn)行樣品空白試驗(yàn)。試樣吸光度值扣除樣品空白吸光度值后，代入線性回歸方程，按如下公式計(jì)算試樣氨基酸態(tài)氮含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 比色法

2.1.1 氨基酸態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以氨基酸態(tài)氮含量（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1。

圖1 氨基酸態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of amino acid nitrogen

由圖1可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.110 3x，在0～100.0 μg線性范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 3，表明二者線性良好。

2.1.2 回收率測(cè)定

對(duì)比色法進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)，結(jié)果見表1。

表1 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of recovery rate tests

由表1可知，加標(biāo)回收率在92.5%～101.3%，表明該法準(zhǔn)確度高，符合相關(guān)實(shí)驗(yàn)要求。

2.1.3 顯色劑放置時(shí)間對(duì)測(cè)定的影響

用放置不同時(shí)間的顯色劑顯色，重新繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)對(duì)同一個(gè)樣品進(jìn)行測(cè)定并測(cè)定其加標(biāo)回收率，結(jié)果見表2。

表2 放置不同時(shí)間的顯色劑對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線單點(diǎn)的測(cè)定結(jié)果Table 2 Determination results of standard curves single point with chromogenic agents placed with different time

由表2可知，隨著顯色劑放置時(shí)間的延長(zhǎng)，氨基酸態(tài)氮含量測(cè)定結(jié)果線性下降，測(cè)定結(jié)果也偏低。

2.1.4 樣品空白對(duì)測(cè)定的影響[7]

醬油本身顏色較深，市售的醬油老抽顏色較深，而生抽則顏色相對(duì)較淺。對(duì)不同的醬油（3種生抽、3種老抽）進(jìn)行樣品空白處理：即試樣稀釋液0.5 mL，加入4 mL緩沖溶液，用水定容至10 mL，于波長(zhǎng)400 nm處測(cè)定吸光度值，樣品空白吸光度值見表3。

表3 不同醬油樣品空白吸光度值Table 3 Blank absorbance value of different soy sauce samples

由表3可知，不同顏色深度的醬油空白吸光度值不同，生抽較小可忽略，而老抽的空白吸光值較大，因此需要扣除樣品空白。

2.2 兩種方法間測(cè)定結(jié)果比較[8-12]

另取市售醬油15個(gè)樣品（1#～15#），分別用酸度計(jì)法和比色法對(duì)其中的氨基酸態(tài)氮含量進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見表4。

表4 兩種方法測(cè)定氨基酸態(tài)氮的結(jié)果比較Table 4 Comparison of two methods for the determination results of amino acid nitrogen

由表4可知，經(jīng)過方差分析（α=0.05），兩種方法測(cè)定結(jié)果無顯著性差異（P＞0.05）。

3 討論[13-15]

GB 18186—2000《釀造醬油》規(guī)定用g/100 mL來表示氨基酸態(tài)氮的含量，但是因醬油的密度較大，同樣1 mL的樣品，質(zhì)量約為1.13～1.21 g，且用移液管或移液器移取液體時(shí)也有誤差，這樣折合成g/100 mL的含量，兩者差異較大。因此，筆者認(rèn)為用g/100g來表示含量更為精確。

4 結(jié)論

依據(jù)GB 5009.235—2016《食品中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定》標(biāo)準(zhǔn)，通過探討影響測(cè)定結(jié)果的關(guān)鍵因素和操作注意事項(xiàng)來保證方法的準(zhǔn)確性，再抽取市售10種醬油，分別用兩種方法測(cè)定其氨基酸態(tài)氮含量，試驗(yàn)結(jié)果顯示，兩種方法檢測(cè)結(jié)果無顯著性差異（P＞0.05）。

[1]LIOE H N,SELAMAT J,YASUDA M.Soy sauce and its umami taste:A Link from the past to current situation[J].J Food Sci,2010,75:71-76.

[2]SYIFAA A S,JINAP S,SANNY M,et al.Chemical profiling of different types of soy sauce and the relationship with its sensory attributes[J].Food Qual,2016,39:714-725.

[3]中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì).GB 5009.235—2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2016.

[4]胡明友.醬油中氨基酸態(tài)氮的比色法測(cè)定可行性驗(yàn)證[J].浙江預(yù)防醫(yī)學(xué)，2005，17（7）：20-21.

[5]劉佳寧.論醬油中氨基酸態(tài)氮檢測(cè)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性相關(guān)影響因素[J].食品工程，2015（4）：58-60.

[6]國(guó)家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局.GB 18186—2000釀造醬油[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2000.

[7]章銀珠，趙春玲，沙晨.影響醬油中氨基酸態(tài)氮含量測(cè)定空白值的因素[J].食品研究與開發(fā)，2014，35（1）：82-83.

[8]NIELSEN S S.Food analysis laboratory manual[M].Kluwer:Kluwer Academic Publisher,2006:20-35.

[9]張文德，尹璐，馬志東，等.用Hantzsch反應(yīng)光度法測(cè)定食品中蛋白質(zhì)的研究[J].衛(wèi)生研究，1997，26（5）：340-342.

[10]姜雪，蘇媛媛，劉小勤.醬油中氨基酸態(tài)氮的來源及不合格研究[J].廣東化工，2017，44（4）：69-70.

[11]郭峰，王斌，陸洋.醬油中總酸和氨基酸態(tài)氮成分的快速檢測(cè)及研究[J].食品科學(xué)，2006，27（12）：699-703.

[12]LIN S Y,LO Y C,CHEN Y K,et al.Nonvolatile taste components and functional compounds of commercial soy sauce products[J].Food Process Pres,2015,39(6):2680-2686.

[13]姚玉靜，陳嘉輝，尹文穎.固形物濃度對(duì)高鹽稀態(tài)醬油滋味物質(zhì)的影響[J].食品工業(yè)科技，2017，38（8）：133-138.

[14]魯長(zhǎng)豪.食品理化檢驗(yàn)學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1992：31-34.

[15]李里特.大豆加工與利用[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2003：216-240.

Two methods for determination of amino acid nitrogen in soy sauce

ZHANG Yinzhu,ZHAO Chunling,ZHANG Shufen
(Ningbo Academy of Food Inspection and Testing,Ningbo 315000,China)

Two methods(pH meter and colorimetric method)for the determination of amino acid nitrogen in soy sauce were discussed.It is not clear whether there is any difference between the two methods.According to the national standard GB 5009.235—2016''The determination of amino acid nitrogen in food'',the key factors influencing the results of determination and operation cautions to ensure the accuracy of the method were discussed, and then the content of amino acid nitrogen in 10 commercial soy sauce samples were determined by the two methods.The results showed that there was no significant difference between test results of two methods(P＞0.05).

soy sauce;amino acid nitrogen;pH meter method;colorimetric method

TS264.2

0254-5071（2017）06-0163-03

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.06.033

2017-03-29

章銀珠（1983-），女，工程師，碩士，主要從事食品理化檢測(cè)工作。