赤水曬醋一株產(chǎn)氣微生物的分離鑒定

白成松，盧紅梅，楊新，任勰珂，安家靜，陳莉*

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽550025；2.貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽550025）

赤水曬醋一株產(chǎn)氣微生物的分離鑒定

白成松1，盧紅梅2，楊新2，任勰珂2，安家靜2，陳莉1*

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽550025；2.貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽550025）

為了解赤水曬醋產(chǎn)氣原因，采用多種培養(yǎng)基分離和計數(shù)產(chǎn)氣微生物，并檢測其生理生化特征，生長特性以及16S rDNA基因序列分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，從變質(zhì)曬醋中分離到一株產(chǎn)氣微生物，編號為N9，革蘭氏陽性，有芽孢，最適生長溫度為45℃，最適生長pH值為5.5，最適生長鹽度（氯化鈉含量）為1%，繁殖能力強(qiáng)。經(jīng)過16S rDNA基因序列以及系統(tǒng)發(fā)育樹分析可以鑒定該菌為產(chǎn)堿普羅威登斯菌（Providencia alcalifaciens）。

赤水曬醋；產(chǎn)氣微生物；分離鑒定；特性研究

食醋是一種酸味調(diào)味劑，深受人們的喜愛，根據(jù)研究表明食醋具有抗菌殺菌、增強(qiáng)免疫力、預(yù)防骨質(zhì)疏松等功能[1-2]。食醋按生產(chǎn)方法的不同有釀造食醋和人工合成食醋。赤水曬醋作為傳統(tǒng)釀造食醋中的一種，獨(dú)具特色。赤水曬醋采用固態(tài)發(fā)酵繁殖產(chǎn)生天然醋酸菌，醋坯和成品醋均經(jīng)日光暴曬，因此而得名“曬醋”。原料以麩皮為主，百余種名貴中草藥配方制作醋曲；優(yōu)質(zhì)大米、糯米的精選、蒸煮；麥麩、小麥及醋曲與大米粥拌醅；醋醅室內(nèi)發(fā)酵；醋醅裝壇；日光曝曬；醋醅浸淋；產(chǎn)品精釀；滅菌等三十六道工序。整個生產(chǎn)周期要經(jīng)過兩、三年以上才能成形。曬醋具有香、酸、醇、濃等特點(diǎn)，色呈紅棕色，味酸柔和，稍有甜口，不澀口，不霉變，香氣濃郁。雖然赤水曬醋的酸度達(dá)到6°T，不需要添加其他防腐劑，但由于赤水曬醋是傳統(tǒng)釀造食醋，受天時地利、人工操作的影響很大，僅依賴高酸度，其安全性并非絕對能得到保障[3]。

2015年上半年，某曬醋公司的食醋出現(xiàn)嚴(yán)重的產(chǎn)氣現(xiàn)象明顯，導(dǎo)致食醋脹袋、脹瓶，甚至爆瓶，這不僅影響了曬醋在消費(fèi)者中的形象，還給公司帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。近年來，國內(nèi)已有關(guān)于釀造食醋出現(xiàn)產(chǎn)氣現(xiàn)象的相關(guān)的研究，張懷敏等[4]研究了導(dǎo)致山西老陳醋脹袋的原因，其研究結(jié)果顯示，導(dǎo)致老陳醋產(chǎn)氣的主要原因是產(chǎn)氣芽孢桿菌。鄭宇等[5]比較分析了正常食醋和脹氣食醋樣品的理化指標(biāo)和活菌數(shù)的差異，并分析了脹氣食醋樣品中主要的氣體成分，分離鑒定了食醋中潛在的污染微生物。本研究從赤水產(chǎn)氣曬醋中分離一株產(chǎn)氣的微生物，進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，并研究其生長特性，為防治赤水曬醋產(chǎn)氣提供重要的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

赤水食醋樣品：某曬醋公司提供產(chǎn)氣食醋（問題食醋）和正常食醋；碘化鉀、碘（均為分析純）：貴州賽蘭博科學(xué)儀器有限公司；無水乙醇、體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇（均為分析純）：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；氯化鈉（分析純）：成都臨江化工廠；剛果紅：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside，dNTP）、Taq DNA聚合酶、MgCl2：上海生工生物工程公司。

平板計數(shù)瓊脂、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基、改良高氏一號、麥芽浸粉肉湯培養(yǎng)基：北京陸橋技術(shù)股份有限公司；乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基：英國Oxoid公司；LB液體培養(yǎng)基（pH3.5）：按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行配制。

1.2 儀器與設(shè)備

DMS-653廣西生物數(shù)碼顯微鏡：深圳市博宇儀器有限公司；∑IGMA電子掃描顯微鏡：北京普瑞賽司儀器有限公司；SPX-250B智能型生化培養(yǎng)箱、DHG-9140B（101-2B）智能型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上?，槴\實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；YXQ-LS-5DS11立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；NDJ-1旋轉(zhuǎn)粘度計：上海天平儀器廠；SITA-t15動態(tài)表面張力儀：桂寧（上海）實(shí)驗(yàn)器材有限公司；752N紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；5531型PCR擴(kuò)增儀：上海珂淮儀器有限公司；DYY-2C雙穩(wěn)定時電泳儀：上海六一生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 微生物的分離、純化

無菌條件下吸取混勻的問題食醋0.2 mL，分別加入裝有不同培養(yǎng)基（平板計數(shù)瓊脂/馬鈴薯葡萄糖瓊脂/孟加拉紅/改良高氏一號/麥芽浸粉肉湯/乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基）的培養(yǎng)皿中，用無菌涂布棒在培養(yǎng)基表面輕輕涂布均勻，再用無菌膜封培養(yǎng)皿，然后分別倒置于普通恒溫培養(yǎng)箱和厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5d，培養(yǎng)溫度30℃。同時以正常食醋作為對照。食醋中微生物菌落總數(shù)、大腸菌群的測定分別參照國標(biāo)GB 4789.2—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測定》和GB 4789.38—2012《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸埃希氏菌計數(shù)》中的方法執(zhí)行[6-7]。

將分離到的微生物用相應(yīng)的固體培養(yǎng)基進(jìn)行劃線分離純化，傳代3次。并用相應(yīng)的斜面培養(yǎng)基在4℃條件下保存?zhèn)溆?。保存的菌株每個月轉(zhuǎn)接1次。

1.3.2 產(chǎn)氣和黏度檢測實(shí)驗(yàn)

配制LB培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH至3.5，分裝到試管中，并加入杜氏小管，然后進(jìn)行121℃、20min濕熱滅菌。選擇正常的赤水曬醋，分裝到試管中，并加入杜氏小管，然后進(jìn)行121℃、20 min濕熱滅菌。

將分離出的微生物接種到上述培養(yǎng)基和正常的赤水曬醋中，30℃培養(yǎng)3～5 d，觀察小導(dǎo)管中是否有氣泡以及檢測培養(yǎng)基的黏度變化[8-9]。同時，以不接種作為對照。

1.3.3 微生物形態(tài)觀察以及生理生化測定

將分離出來的主要微生物進(jìn)行菌落形態(tài)觀察（形態(tài)、顏色、邊緣、透明度等特征）以及個體形態(tài)觀察（染色顯微鏡觀察）。按文獻(xiàn)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[10]和《常見細(xì)菌鑒定手冊》[11]分別對獲得的微生物進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 16S rDNA基因序列分析

微生物總DNA的提?。豪肊zup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取實(shí)驗(yàn)菌株的DNA，其具體步驟參見試劑盒的說明書。DNA提取產(chǎn)物保存于-20℃冰箱中。

聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增16S rDNA：以提取的基因組DNA為模板，利用通用引物正向引物27F和反向引物1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。通用引物ITS1和ITS4被用于rDNA ITS區(qū)段的PCR擴(kuò)增。它們的序列是：ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG，ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC。PCR反應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系中完成。PCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性50 s，56℃復(fù)性50s，72℃延伸90s，30個循環(huán)；最后于72℃延伸10min。采用1%的瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測。

DNA測序：純化后的目的基因送上海生工公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果用Chromas軟件參照正反序列圖譜進(jìn)行人工校正。

系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建：用BLAST將測序結(jié)果在美國國家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）中與已知細(xì)菌的16S rDNA基因序列進(jìn)行同源性分析，并用MEGA5.10軟件的鄰接法（neighborjoining，N-J）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，具體確定菌株的種屬。

1.3.5 微生物生長特性研究[12-15]

活化菌種：將分離的主要的菌株接種在裝液量為100mL/ 250mLLB液體培養(yǎng)基中，在30℃條件下培養(yǎng)24 h。

培養(yǎng)溫度的影響：接入10%活化菌株于裝液量為100mL/ 250mLLB液體培養(yǎng)基中，分別置于30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃條件下，靜置培養(yǎng)24 h，搖勻后測定各菌液的OD600nm值，并繪制溫度對菌株生長影響的曲線。

鹽度對微生物生長的影響：分別配制含有0、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%NaCl的LB液體培養(yǎng)基，然后進(jìn)行121℃、20min濕熱滅菌。再接入10%的活化菌種，靜置培養(yǎng)24 h，搖勻后測定各菌液的OD600nm值，并繪制鹽度對菌株生長影響的曲線。

pH對微生物生長的影響：配制LB培養(yǎng)基，分裝于250mL的三角瓶中，并調(diào)節(jié)pH值至2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5、10.5，然后進(jìn)行121℃、20 min濕熱滅菌，以滅菌后實(shí)際測得的pH為準(zhǔn)。然后接入10%活化菌種，靜置培養(yǎng)24 h，搖勻后測定各菌液的OD600nm值，并繪制pH對菌株生長影響的曲線。

微生物生長曲線繪制：將活化的菌種接種到LB培養(yǎng)基最適生長鹽度、最適生長pH中，置于其最適生長溫度下，靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)前的16 h，每隔4 h測量1次OD600nm值，培養(yǎng)16 h后，每隔8 h測1次OD600nm值，連續(xù)測5 d。

2 結(jié)果與分析

2.1 問題食醋中產(chǎn)氣微生物形態(tài)學(xué)觀察

采用不同培養(yǎng)基（平板計數(shù)瓊脂、馬鈴薯葡萄糖瓊脂、孟加拉紅、改良高氏一號、麥芽浸粉肉湯、乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基）在好氧和厭氧條件下培養(yǎng)變質(zhì)食醋。研究發(fā)現(xiàn)，只有用平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基在厭氧條件下才長出微生物，并且數(shù)量不多，其他的培養(yǎng)基無論是在好氧還是厭氧條件下都不能長出微生物。分離出的微生物經(jīng)過產(chǎn)氣和黏稠增加實(shí)驗(yàn)，得到主要的1株微生物，編號為N9，其在LB液體培養(yǎng)基中產(chǎn)氣明顯，在正常的赤水曬醋中產(chǎn)氣緩慢，菌株N9菌落形態(tài)及電鏡圖見圖1。

由圖1（A）可知，菌株N9菌落呈黃色，表面濕潤光滑，邊緣整齊，易挑起，透明；菌株N11菌落呈淺黃色，表面濕潤光滑，邊緣不整齊，易挑起，不透明。由圖1（B）可知，該株菌為桿狀，長約1.423 6 μm，直徑約0.694 4 μm。

2.2 菌株N9生理生化測定結(jié)果

按文獻(xiàn)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》和《常見細(xì)菌鑒定手冊》對菌株N9進(jìn)行生理生化測定，測定結(jié)果見表1。

2.3 菌株N9分子生物學(xué)鑒定

采用16S rDNA測序方法對菌株N9進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，對DNA進(jìn)行序列擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將所得測序結(jié)果輸入NCBI進(jìn)行BLAST對比，采用N-J法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖2。

圖2 菌株N9基于16S rDNA基因序列建立的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain N9 based on 16S rDNA sequence

由圖2可知，菌株N9的16S rDNA基因序列比對結(jié)果與為產(chǎn)堿普羅威登斯菌（Providencia alcalifaciens）相似度為98%，與Providencia alcalifaciens最為接近。結(jié)合菌株N9的細(xì)胞形態(tài)、菌落形態(tài)、生理生化特征，可以鑒定菌株N9為產(chǎn)堿普羅威登斯菌（Providencia alcalifaciens）。

2.4 菌株N9生長特性的研究

2.4.1 培養(yǎng)溫度對菌株N9生長的影響

圖3 培養(yǎng)溫度對菌株N9生長的影響Fig.3 Effects of culture temperature on the growth of strain N9

由圖3可知，菌株N9在培養(yǎng)溫度30～40℃范圍內(nèi)，OD600nm值上升比較緩慢；在培養(yǎng)溫度40～45℃范圍內(nèi)，OD600nm值上升較快；在培養(yǎng)溫度45℃時，OD600nm值達(dá)到最大值；培養(yǎng)溫度＞45℃之后，OD600nm值先快速下降，再緩慢下降，最后OD600nm值接近為0。因此，菌株N9的最適生長溫度為45℃。2.4.2 pH對菌株N9生長的影響

由圖4可知，菌株N9在pH 2.5～5.5，OD600nm值逐漸增加；菌株N9在pH值為5.5時，OD600nm值達(dá)到最大值；菌株N9在pH＞5.5之后，OD600nm值快速的下降。因此，菌株N9最適生長pH值為5.5。

圖4pH對菌株N9生長的影響Fig.4 Effects of pH on the growth of strain N9

2.4.3 鹽度對菌株N9生長的影響

圖5 鹽度對菌株N9生長的影響Fig.5 Effects of salinity on the growth of strain N9

由圖5可知，菌株N9在鹽度為0～1%時，OD600nm值逐漸增加；菌株N9在鹽度為1%時，OD600nm值達(dá)到最大值；菌株N9在鹽度＞1%之后，OD600nm值逐漸下降。因此，菌株N9的最適生長鹽度為1%。

2.4.4 菌株N9生長曲線

圖6 菌株N9的生長曲線Fig.6 Growth curves of strain N9

由圖6可知，在0～16 h之間，菌株N9處于對數(shù)生長期，菌體快速繁殖，OD600nm值變化最大，隨后由于營養(yǎng)物質(zhì)的大量消耗，在16～24 h之間，菌株N9生長開始變緩，24～64 h之間菌株N9進(jìn)入穩(wěn)定期，細(xì)菌數(shù)目和代謝產(chǎn)物達(dá)到最高水平，菌體OD600nm值較穩(wěn)定，64 h后菌株N9進(jìn)入衰亡期，菌體開始死亡，OD600nm值開始下降，從OD600nm值變化趨勢來看，菌株N9具有較快的生長速度，對數(shù)期開始比較早。

3 結(jié)論

通過用不同培養(yǎng)基在好氧和厭氧條件下培養(yǎng)變質(zhì)食醋，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只有用平板計數(shù)瓊脂在厭氧條件下才長出微生物，并且數(shù)量不多，其他的培養(yǎng)基無論是在好氧還是厭氧條件下微生物都不生長。分離出的微生物經(jīng)過產(chǎn)氣驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到主要的一株產(chǎn)氣微生物。通過檢測其生理生化特征，以及16S rDNA基因序列分析，鑒定出該菌為產(chǎn)堿普羅威登斯菌（Providencia alcalifaciens）。通過對該株菌做生長特性實(shí)驗(yàn)得知，該株菌的最適生長溫度為45℃，最適生長pH為5.5，最適生長鹽度為1%，具有較快的生長速度，對數(shù)期開始比較早。充分了解菌株N9的生長特性，為防治曬醋產(chǎn)氣提供一定的理論基礎(chǔ)。

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Isolation and identification of a gas-producing bacterium from Chishui sun vinegar

BAI Chengsong1,LU Hongmei2,YANG Xin2,REN Xieke2,AN Jiajing2,CHEN Li1*
(1.School of Liquor and Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China; 2.Guizhou Province Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biopharmacy,Guiyang 550025,China)

In order to figure out the aerogenesis reason of Chishui sun vinegar,using a variety of culture mediums to isolate and count gas-producing microorganism,and the physiological-biochemical characteristics of strains were detected and 16S rDNA gene sequence were analyzed.The results showed that one gram-positive bacterium with spore,coded as N9,was isolated from the samples of Chishui sun vinegar.The optimum growth temperature of the strain was 45℃,pH was 5.5 and the optimum growth salinity(NaCl content)was 1%.The strain had strong reproduction ability. Through the analysis of 16S rDNA gene sequences and phylogenetic tree analysis,the strain N9 was identified asProvidencia alcalifaciens.

Chishui sun vinegar;gas-producing microorganisms;isolation and identification;characteristic research

TS264.2

0254-5071（2017）06-0072-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.06.015

2017-04-07

貴州大學(xué)研究生創(chuàng)新基金（2016055）

白成松（1991-），男，碩士研究生，研究方向發(fā)酵工程。

*通訊作者：陳莉（1981-），女，副教授，碩士，研究方向應(yīng)用微生物。