高溫大曲中產(chǎn)吡嗪芽孢桿菌的分離鑒定及發(fā)酵產(chǎn)物分析

汪文鵬，李永博，吳樹坤，劉梅，鄧杰，衛(wèi)春會，黃治國*

（四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川自貢643000）

高溫大曲中產(chǎn)吡嗪芽孢桿菌的分離鑒定及發(fā)酵產(chǎn)物分析

汪文鵬，李永博，吳樹坤，劉梅，鄧杰，衛(wèi)春會，黃治國*

（四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川自貢643000）

該試驗(yàn)從高溫大曲中篩選產(chǎn)吡嗪芽孢桿菌（Bacillus），通過形態(tài)觀察及磷脂脂肪酸（PLFA）分析對其進(jìn)行鑒定，并采用發(fā)酵試驗(yàn)分析其代謝產(chǎn)物。共篩選出3株芽孢桿菌，即菌株B1、B2、B3。經(jīng)分析鑒定后得出：菌株B1為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）；菌株B2和B3為萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus）。3株菌發(fā)酵產(chǎn)物分析結(jié)果表明，在液態(tài)發(fā)酵條件下3株菌發(fā)酵產(chǎn)吡嗪，其中菌株B2和B3發(fā)酵產(chǎn)物中吡嗪相對含量較高，均＞60%；固態(tài)發(fā)酵條件下生成吡嗪前體物質(zhì)3-羥基-2-丁酮，且發(fā)酵產(chǎn)物中相對含量均＞75%。表明這3株芽孢桿菌對醬香型白酒風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生有著一定的影響。

高溫大曲；芽孢桿菌；吡嗪

吡嗪是含氮的六元環(huán)化合物，其衍生物廣泛存在于天然和發(fā)酵食品中，是白酒中含氮化合物的主要成分，同時(shí)也是白酒香味成分的重要組成物質(zhì)。研究表明，吡嗪類化合物是醬香型白酒的特征風(fēng)味物質(zhì)，在風(fēng)味物質(zhì)中其種類和含量最高，其中四甲基吡嗪也是公認(rèn)的功能因子，具有擴(kuò)張血管、改善血循環(huán)、護(hù)肝等功能[1-2]。吡嗪類化合物與醬香型白酒的感官特征密切相關(guān)，其含量高低影響醬香白酒的品質(zhì)[3-7]。由于食品烘焙過程中羰基化合物（還原糖類）和氨基化合物（氨基酸和蛋白質(zhì)）會發(fā)生非酶促的美拉德反應(yīng)，二羰基化合物與氨基酸經(jīng)Strecker降解反應(yīng)會產(chǎn)生吡嗪類化合物[8]，因此，長期以來一直認(rèn)為中國白酒中的吡嗪主要由美拉德反應(yīng)產(chǎn)生[9-10]。但在醬香型酒的高溫制曲環(huán)節(jié)、高溫堆積環(huán)節(jié)、高溫發(fā)酵環(huán)節(jié)產(chǎn)生的吡嗪類化合物，除了褐變反應(yīng)生成外，有相當(dāng)部分是微生物的代謝產(chǎn)物[11-12]。芽孢桿菌代謝不僅能產(chǎn)生大量胞外酶（如蛋白酶、淀粉酶等），從而在發(fā)酵前期積累各種多肽、氨基酸和還原糖類，還能產(chǎn)生如乙偶姻[13-14]、四甲基吡嗪[15]等物質(zhì)。早在1962年，日本研究者在納豆中分離得到四甲基吡嗪，并且研究發(fā)現(xiàn)，其中的枯草芽孢桿菌具有發(fā)酵產(chǎn)生四甲基吡嗪的能力，證明了發(fā)酵食品納豆中的四甲基吡嗪來自于微生物的代謝反應(yīng)。1972年，又有研究者從發(fā)酵的可可豆中找到了發(fā)酵產(chǎn)四甲基吡嗪的枯草芽孢桿菌，并發(fā)現(xiàn)只有在枯草芽孢桿菌生長時(shí)，體系中才會有四甲基吡嗪產(chǎn)生，這也證明了發(fā)酵可可豆中的四甲基吡嗪是由枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的。因此，本實(shí)驗(yàn)以高溫大曲中產(chǎn)吡嗪芽孢桿菌作為篩選目標(biāo)和研究對象，采用平板分離法，結(jié)合磷脂脂肪酸（phospholipid fattyacid，PLFA）技術(shù)和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）分析技術(shù)對高溫大曲中的產(chǎn)吡嗪芽孢桿菌進(jìn)行研究。以期為從細(xì)菌方面間接提升醬香型白酒酒質(zhì)的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

大曲樣品采自四川某醬香型酒廠生產(chǎn)用高溫大曲。

1.1.2 試劑

體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液、甲醇、葡萄糖、氯化鉀、硝酸鈉、硫酸鎂、結(jié)晶紫、番紅、硫酸亞鐵、硝酸鉀、氫氧化鈉、氯化鈉（均為分析純）：成都市科龍化工試劑廠；瓊脂粉、蛋白胨、牛肉膏（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；正己烷（色譜純）：德國Darmstadt公司；甲基叔丁基醚（色譜純）：德國Tedia公司。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：稱取牛肉膏5 g，瓊脂20 g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，加水至1 000 mL，pH調(diào)至7.0～7.2，121℃滅菌15 min。

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：稱取牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，加水至1 000 mL，pH調(diào)至7.0～7.2，121℃滅菌15 min。

高粱固體培養(yǎng)基：將高粱粉置于紗布上，并加入少許水潤濕，蓋上鍋蓋蒸至有高粱香，將蒸好的高粱按30 g每份分裝至100 mL錐形瓶中，并向每個(gè)錐形瓶中加入10 mL水，121℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A-5978B型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、GC6890型氣相色譜儀：美國安捷倫科技有限公司；HT300A型全自動(dòng)固相微萃?。╯olid phase microextraction，SPME）儀：意大利HTA公司；Sherlock602型微生物鑒定系統(tǒng)：美國MIDI公司；Scan1200型全自動(dòng)菌落分析儀：上海智理科學(xué)儀器有限公司；DM3000型正置生物顯微鏡：德國徠卡公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌株篩選

分離純化：無菌稱取10 g大曲樣品，在無菌操作臺上迅速加入裝有90 mL無菌水的三角瓶中，充分搖勻，振蕩5～10 min。使大曲充分打散，即制成10-1稀釋樣。取1 mL上清液加入9 mL無菌生理鹽水中，配制成10-2菌懸液。依次類推，配制成10-3、10-4……10-7菌懸液。分別吸取0.2mL10-3～10-7稀釋度菌懸液，迅速用涂布棒均勻涂布于牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng)基上，每個(gè)稀釋度做3個(gè)平行樣，于37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h。挑取長勢較好的單菌落在牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng)基上采用4區(qū)劃線法對取得的單菌落進(jìn)行劃線分離純化，將得到的單菌落保藏于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，待菌落長出后，4℃冰箱保藏備用。

產(chǎn)吡嗪驗(yàn)證：從新鮮斜面培養(yǎng)基上挑取一環(huán)菌落至裝液量為20 mL/100 mL的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中于37℃、150 r/min條件下培養(yǎng)3 d。吡嗪的前體物質(zhì)即3-羥基-2-丁酮，因此，通過借助VP試驗(yàn)[14]檢測3-羥基-2-丁酮，篩選產(chǎn)吡嗪菌株。

1.3.2 形態(tài)觀察

將分離純化后的細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色和制片，通過光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察，對細(xì)菌的形狀、大小、芽孢和包囊等狀況進(jìn)行記錄。

1.3.3 菌種鑒定

（1）試劑的配制

皂化試劑：將75 mL水和75 mL甲醇混合，加入22.5 g固體NaOH，邊加邊攪拌，直至固體完全溶解。

甲基化試劑：將32.5mL6mol/L的鹽酸溶液加入27.5mL甲醇中，攪拌混勻。

萃取試劑：將100mL甲基叔丁基醚加入100mL正己烷中，并攪拌均勻。

堿洗滌：將3.6 g NaOH加入300 mL去離子水中，同時(shí)攪拌至完全溶解。

（2）菌株獲取

采用四區(qū)劃線法將篩選菌株接種于牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h。用接種環(huán)挑取第三區(qū)的菌落（約40 mg）于螺旋試管底部，菌量寧多勿少，同時(shí)做好標(biāo)記。注意小心挑種，不要將培養(yǎng)基帶入，以免影響結(jié)果。

（3）皂化與甲基化

取1.0mL的皂化試劑注入試管內(nèi)，將螺旋管旋緊，振蕩5～10 s后95～100℃水浴5 min，取出試管再振蕩5～10 s，95～100℃水浴25 min后取出，冷卻至室溫后，加入2.0 mL的甲基化試劑旋好蓋子，振蕩5～10 s，80℃水浴10 min，取出試管，冷卻至室溫。

（4）萃取與堿洗滌

在螺旋試管中加入1.25 mL萃取試劑，旋好蓋子后，將試管上下顛倒混合10 min，注意來回混合，防止氣泡產(chǎn)生，然后靜置分層。用滅菌滴管吸出下層液體，而保留上層液體。加入3.0 mL的堿洗滌，旋好蓋子，緩慢將試管上下顛倒混合5min，靜置分層。若分層不明顯，加少許飽和的氯化鈉溶液，然后用滅菌的玻璃滴管吸取2/3的上清液，移至GC小管內(nèi)。保存于4℃冰箱中待檢。

（5）MIDI鑒定系統(tǒng)的菌相分析[16]

將待檢樣品用氣相色譜儀進(jìn)行鑒定。利用相關(guān)數(shù)據(jù)庫（TSBA6 6.21，CLIN6 6.20，F(xiàn)UNGI 3.80）和MIDI鑒定系統(tǒng)分析，鑒定樣品中微生物的種類。

色譜條件：19091B-102毛細(xì)管色譜柱（25.0 m×0.2 mm× 0.33 μm）；進(jìn)樣口溫度250℃；分流比30∶1；程序升溫：初始溫度190℃，10℃/min升至280℃，60℃/min升至310℃，保持1min；火焰離子檢測器（flame ionization detector，F(xiàn)ID）溫度300℃；載氣：氫氣30 mL/min；助燃?xì)猓嚎諝? 500 mL/min；尾吹氣：氮?dú)?0 mL/min；進(jìn)樣量：2 μL。

1.3.4 發(fā)酵產(chǎn)物分析

液態(tài)發(fā)酵：將菌株接種至裝液量為50 mL/500 mL的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，于37℃、150r/min搖床中發(fā)酵3～4 d。

固態(tài)發(fā)酵：將菌株接種至高粱固體培養(yǎng)基中，于37℃、150 r/min搖床中發(fā)酵3～4 d。

固相微萃取條件：精確量取4 mL液態(tài)發(fā)酵樣品（或4 g固體發(fā)酵樣品）于頂空瓶中，將頂空瓶放入全自動(dòng)固相微萃取儀中，65℃平衡10 min后，萃取30 min。

色譜條件：DB-WAX毛細(xì)管色譜柱（60.0 m×0.25 mm× 0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度250℃；分流比20∶1；程序升溫：50℃保持2min，10℃/min升至230℃，保持15min；載氣：99.999%氦氣，載氣流速：2 mL/min。

質(zhì)譜條件：電離電壓70 eV；離子源溫度220℃；四極桿溫度為150℃；電離方式為電子電離（electron ionization，EI）源；質(zhì)量掃描范圍為50～500 amu；溶劑延遲3 min。

定性定量分析：質(zhì)譜圖通過與美國Agilent公司提供的標(biāo)準(zhǔn)普庫（NIST05a.L）比對，選擇匹配度均＞800（最大值為1 000）、特征離子進(jìn)行定性分析。并采用面積歸一化法進(jìn)行定量分析，根據(jù)某一物質(zhì)的色譜峰面積與總峰面積的比值求出其相對含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選與鑒定

2.1.1 菌株的分離純化

從高溫大曲樣品中篩選得到18株菌，通過產(chǎn)吡嗪試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)3株菌經(jīng)發(fā)酵能產(chǎn)生吡嗪類物質(zhì)，編號為B1、B2、B3。對分離出的3株細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色和鏡檢試驗(yàn)，結(jié)果見圖1。

圖1 分離菌株的形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of isolated strains

由圖1可知，3株細(xì)菌均為革蘭氏陽性菌。菌株B1菌落呈白色，光滑，濕潤，正面和反面，中心和邊緣顏色一樣，易于挑取，無粘性；菌株B2菌落不透明，略帶米白色，邊緣較光滑，有粘性，不易挑起；菌株B3菌落呈鵝黃色，菌落中間顏色較淺，邊緣顏色較白，較光滑，易于挑取，生長前期較短，后期菌體比前期長，粗細(xì)較均勻。

2.1.2 MIDI微生物鑒定系統(tǒng)鑒定結(jié)果

根據(jù)MIDI操作手冊，當(dāng)鑒定結(jié)果第一選擇的相似指數(shù)（similarity index，SI）＞0.500，且第一選擇和第二選擇的SI差值＞0.100，則可以認(rèn)為鑒定成功，鑒定結(jié)果為第一選擇所列的菌種名。通過皂化、甲基化、萃取、堿洗滌等過程，提取出3菌株的PLFA，運(yùn)用MIDI微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行了菌種鑒定，結(jié)果見表1。由表1可知，分離出的菌株為2種不同的芽孢桿菌，菌株B1為蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus），菌株B2和B3為萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus）。蠟狀芽孢桿菌在醫(yī)藥方面具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，可以用于人類胃腸道疾病的防治、降血脂、抗衰老、防止細(xì)菌移位、抗腫瘤及自身免疫性疾病防治等[17]；萎縮芽孢桿菌是枯草芽孢桿菌的黑色變種，枯草芽孢桿菌是醬香風(fēng)味和芝麻香風(fēng)味的重要生產(chǎn)菌[18]。

表1 MIDI微生物鑒定系統(tǒng)鑒定結(jié)果Table 1 Identification results of MIDI microbial identification system

2.2 發(fā)酵產(chǎn)物分析

2.2.1 液態(tài)發(fā)酵結(jié)果分析

表2 液態(tài)發(fā)酵結(jié)果分析Table 2 Results analysis of liquid fermentation

對3株芽孢桿菌進(jìn)行純培養(yǎng)，并利用固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜分析（SPME-GC-MS）對菌株B1、B2和B3液態(tài)發(fā)酵液中吡嗪類物質(zhì)含量測定，結(jié)果見表2。由表2可知，發(fā)酵液含有不同種類的吡嗪類物質(zhì)。菌株B2、B3發(fā)酵液中含有較多的吡嗪類物質(zhì)，相對含量分別67.459%和80.455%，其中以2,6-二甲基吡嗪為主，相對含量分別達(dá)54.669%和71.127%；菌株B1發(fā)酵液中吡嗪類物質(zhì)相對含量較低，僅為24.455%。結(jié)果表明，作為枯草芽孢桿菌的變種，萎縮芽孢桿菌也有較強(qiáng)的吡嗪生產(chǎn)能力。

2.2.2 固態(tài)發(fā)酵結(jié)果分析

對菌株B1、B2和B3進(jìn)行固態(tài)純培養(yǎng)，利用SPME-GC-MS對樣品中吡嗪類物質(zhì)的含量測定，固態(tài)發(fā)酵結(jié)果成分分析圖見表3。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，3個(gè)發(fā)酵樣品中均含有3-羥基-2-丁酮，研究表明，3-羥基-2-丁酮對白酒風(fēng)味的形成起到非常重要的作用，它是生成吡嗪類化合物的前體物質(zhì)，與其他代謝產(chǎn)物共同作用于白酒特征風(fēng)味物質(zhì)的形成，特別是為醬香型白酒特征風(fēng)味成分的形成奠定了基礎(chǔ)。其中菌株B2樣品中的吡嗪前體物質(zhì)含量最高，達(dá)到85.914%；B1和B3號菌株中吡嗪前體物質(zhì)含量分別達(dá)84.669%和77.344%。

表3 固態(tài)發(fā)酵結(jié)果分析Table 3 Results analysis of solid fermentation

3 結(jié)論

本試驗(yàn)從高溫大曲中篩選出了產(chǎn)吡嗪芽孢桿菌，并對其進(jìn)行形態(tài)學(xué)和PLFA鑒定。結(jié)果表明，共篩選出的3株產(chǎn)吡嗪菌株，菌株B1被鑒定為蠟狀芽孢桿菌（Bacilluscereus），菌株B2和B3被鑒定為萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus）。對三株菌進(jìn)行固態(tài)和液態(tài)發(fā)酵代謝產(chǎn)物分析，發(fā)現(xiàn)在液態(tài)發(fā)酵條件下3株菌發(fā)酵均產(chǎn)吡嗪類化合物，其中菌株B2和B3產(chǎn)吡嗪類化合物相對含量較高，均＞60%；在固態(tài)發(fā)酵條件下，三株菌均產(chǎn)生吡嗪前體物質(zhì)3-羥基-2-丁酮，相對含量均＞75%，表明所篩菌株均有較高的吡嗪物質(zhì)產(chǎn)生能力，能對醬香型白酒風(fēng)味起積極的作用。

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Isolation and identification of pyrazine-producingBacillusfrom high-temperature Daqu and analysis of its fermentation products

WANG Wenpeng,LI Yongbo,WU Shukun,LIU Mei,DENG Jie,WEI Chunhui,HUANG Zhiguo*
(Sichuan Provincial Key Lab of Liquor-marking Biotech＆Application,School of Bioengineering,Sichuan University of Science& Engineering,Zigong 643000,China)

The pyrazine-producingBacilluswas screened from high-temperature Daqu and identified by morphologic observation and phospholipid fatty acid(PLFA)analysis.Its metabolites were analyzed by fermentation tests.Three strains ofBacilluswere screened and named B1,B2and B3, respectively.The strain B1wasBacillus cereus,strains B2and B3wereBacillus atrophaeus.The results of fermentation products analysis of three strains showed that the threeBacilluscould produce pyrazine under the conditions of liquid fermentation,and the pyrazine relative content in strains B2and B3fermentation products were high(more than 60%).The pyrazine precursor substance 3-hydroxy-2-butanone were produced under the conditions of solid fermentation,and relative content were more than 75%in the fermented products,which indicated the three strainsBacillushad a certain effect on flavor substances production in Moutai-flavorBaijiu.

high-temperature Daqu;Bacillus;pyrazine

TS261.1

0254-5071（2017）06-0063-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.06.013

2017-01-05

國家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心開放基金項(xiàng)目（2015K-246）；釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目（NJ2014-16）；四川省科技成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目（2016CC0032）；四川理工學(xué)院人才引進(jìn)項(xiàng)目（2014RC28）

汪文鵬（1993-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程。

*通訊作者：黃治國（1978-），男，教授，博士，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程。