醋酸菌的分子分類學研究和在食醋生產(chǎn)中的應用

秦興，盧紅梅*，陳莉

（貴州大學釀酒與食品工程學院貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州貴陽550003）

醋酸菌的分子分類學研究和在食醋生產(chǎn)中的應用

秦興，盧紅梅*，陳莉

（貴州大學釀酒與食品工程學院貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州貴陽550003）

醋酸菌是革蘭氏陰性，專性好氧，能將乙醇或糖類氧化為醋酸的細菌的總稱。醋酸菌廣泛分布于自然界中，它們能通過代謝酒精產(chǎn)生醋酸的特點在食品生產(chǎn)中已得到普遍應用。醋酸菌分類學的研究在很久以前就已經(jīng)開始，但是直到近幾十年隨著各種生物分子技術的發(fā)展才對其有更加深入地認識。該文綜述了醋酸菌的分子分類學研究發(fā)展和在食醋工業(yè)中的應用，主要介紹了各種分子分類學方法和食醋生產(chǎn)中使用的醋酸菌種類。

醋酸菌；分子分類學；食醋；應用

醋酸菌（acetic acid bacteria，AAB）是革蘭氏染色陰性或不定，好氧代謝，細胞從橢圓到桿狀，單生、成對或成鏈的菌株。其生化反應特性為過氧化氫酶試驗陽性；氧化酶試驗陰性。食醋的生產(chǎn)是利用醋酸菌能將醋醅中的酒精轉(zhuǎn)化為醋酸的能力，通過醋酸菌中與膜結合的吡咯喹啉醌-乙醇脫氫酶（pyrroloquinoline quinone-dependent alcohol dehydrogenase，PQQ-ADH）和乙醛脫氫酶（aldehyde dehydrogenase，ALDH）來完成的[1]，這兩種酶的結構和特性決定了該菌種的適應能力和轉(zhuǎn)化能力[2]。醋酸是食醋中的主要成分，它可以抑制雜菌生長從而防止食品受到污染變質(zhì)。但在某些飲料生產(chǎn)中醋酸菌也會造成一定的危害，如葡萄酒生產(chǎn)中，醋酸含量達到1.2～1.4 g/L時即可被認作為受到了污染[3]。除了醋酸以外，某些醋酸菌還可以生產(chǎn)其他高價值的代謝產(chǎn)物，如維生素C、細菌纖維素等[4]。

對于醋酸菌的研究在很久以前就已經(jīng)開始，可是有的醋酸菌從富含醋酸的環(huán)境中被分離出來時，其很難在普通的培養(yǎng)基中存活，因此使用常規(guī)的生物學方法對醋酸菌進行分離、培養(yǎng)和保存較為困難[5]。直到近幾十年隨著許多生物分子分類學技術的發(fā)展和應用，對醋酸菌才開始有清晰的認識。因此，本文將對醋酸菌分類發(fā)展進行綜述，重點討論了各種用于醋酸菌分類的生物分子分類學技術及其在醋酸生產(chǎn)中的應用，旨在了解現(xiàn)代醋酸菌分類研究的發(fā)展。

1 醋酸菌的分類研究發(fā)展

1868年，LOUIS PASTEUR第一次系統(tǒng)地發(fā)布了關于醋酸菌的研究，將眾多可以代謝生產(chǎn)醋酸的微生物統(tǒng)稱為“醋母”[6]。在早期，醋酸菌的分類主要是以表型特征為依據(jù)，BUCHANAN R E等[7]在1898年使用了“Acetobacter”命名該屬類的微生物。1935年，LEIFSON[6]根據(jù)周生鞭毛的特征提出將醋酸菌分為具有周生鞭毛的醋酸菌（Acetobacter）屬和具有極生鞭毛的醋酸菌屬（Acetomonas）。同年，ASAI T[8]也提出了自己的分類方法，根據(jù)醋酸菌氧化酒精和葡萄糖的能力，將醋酸菌分為醋桿菌屬（Acetobacter）和葡糖桿菌屬（Gluconobacter）。醋桿菌屬（Acetobacter）只有周生鞭毛，能正常利用酒精進行代謝，少量或幾乎不能利用葡萄糖，因此有兩個亞屬，能少量利用葡萄糖代謝的乙酰萄糖酸桿菌亞屬（Acetogluconobacter）和完全不能利用葡萄糖的“Euacetobacter”亞屬；葡糖桿菌屬（Gluconobacter）只有極生鞭毛，能利用葡萄糖正常代謝，少量或幾乎不能利用酒精，其也可以分為能少量利用酒精的葡糖醋桿菌亞屬（Gluconoacetobacter）和完全不能利用酒精的“Eugluconobacter”亞屬[9]。1939年出版的《伯杰氏鑒定細菌學手冊》中將葡糖桿菌屬（Gluconobacter）歸為假單胞菌科（Pseudomonadaceae），而由于醋桿菌屬（Acetobacter）與當時已知的細菌科類沒有聯(lián)系，因此建立醋酸菌科（Acetobacteraceae）。

1953年，沃森等[10]發(fā)現(xiàn)了DNA的雙螺旋結構，基于這一結構發(fā)展的技術和工具為細菌的分類提供了更加精準的依據(jù)。1970年，COLWELL R R[11-12]首次應用“多相分類（polyphasictaxonomy）”的概念對菌種進行研究并發(fā)表相關論文，使表型特征和基因特點成為了“系統(tǒng)分類學”的核心。GILLIS M等[13]在1980年應用脫氧核糖核酸-核糖體核糖核酸（eoxyribonucleic acid-ribosomal ribonucleic acid，DNA-rRNA）雜交技術重新分類了Acetobacter屬和Gluconobacter屬中的一些種類，如傳統(tǒng)Gluconobacter屬中的液化葡糖桿菌（liquefaciens）NCIB9505和IAM1834以及生黑葡萄糖酸桿菌（Gluconobactermelanogenus）IAM1835和IAM1836根據(jù)基因?qū)W可以分類到Acetobacter屬，而橙黃醋桿菌（Acetobacter aurantius）IFO3246屬于Gluconobacter屬，橙黃醋桿菌（Acetobacteraurantius）IFO3249，3247，13330和13333則根本不屬于醋酸菌[13]。同年，SWINGSJ等[14]對Kondo和Ameyama早期分類為醋桿菌屬的Acetobacter aurantius進行了研究，并根據(jù)DNA-rRNA雜交技術得到的結果將其提升為新的屬——弗拉托菌屬（Frateuria），以橙黃弗拉托菌（Frateuria aurantius）為典型菌株，后《伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊》在2005年將其歸入了γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）。1984年，YAMADA Y等[15-16]根據(jù)輔酶Q系統(tǒng)把Acetobacter屬分為兩個亞屬：以輔酶Q-9為特征的Acetobacter亞屬和以輔酶Q-10為特征的Gluconacetobacter亞屬。隨后，YAMADAY等[17]在1997年根據(jù)16SrRNA序列的測試結果，將Gluconacetobacter亞屬提升為Gluconacetobacter屬。隨著DNA技術的發(fā)展，16SrRNA、聚合酶鏈反應（polymerasechainreaction，PCR）等技術相繼被應用，分類鑒定手段越加成熟，越來越多的屬類被建立，并且不斷地完善，如酸單胞菌屬（Acidomonas）[18]、朝井桿菌屬（Asaia）[19]、新朝井桿菌屬（Neoasaia）[20]、糖桿菌屬（Saccharibacter）[21]、斯瓦米納坦氏菌屬（Swaminathania）[22]、公崎桿菌屬（Kozakia）[18]等。

目前，醋酸菌科（Acetobacteraceae）被歸為變形菌門（Proteobacteria）、α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）、紅螺菌目（Rhodospirillales）。按照YAMADA Y等的分類，醋酸菌科共有32個屬，但分為了兩個類別，一類是嗜酸細菌類（acidophilic group），另一類是醋酸菌類（acetous group），即通常所認識的醋酸菌（AAB）[23]。醋酸菌類包含16個屬，共78個種，分別為醋桿菌屬（Acetobacter）、葡糖桿菌屬（Gluconobacter）、酸單胞菌屬（Acidomonas）、葡糖醋桿菌屬（Gluconacetobacter）、朝井桿菌屬（Asaia）、公崎桿菌屬（Kozakia）、斯瓦米納坦氏菌屬（Swaminathania）、糖桿菌屬（Saccharibacter）、新朝井桿菌屬（Neoasaia）、顆粒桿菌屬（Granulibacter）[24]、塔堤查仁桿菌屬（Tanticharoenia）[25]、雨山桿菌屬（Ameyamaea）[26]、新駒形桿菌屬（Neokomagataea）[27]、阮桿菌屬（Nguyenibacter）[28]、駒形桿菌屬（Komagataeibacter）[29]、Endobacter[30]，其屬種關系如表1所示[19，27]。

表1 醋酸菌的16個屬類及其種類Table 1 16 genus and species of acetic acid bacteria

續(xù)表

2 醋酸菌的分子分類學方法

一直以來，使用表型方法和化學分類法是醋酸菌的鑒定分型中的重要方法，利用形態(tài)和生理生化特征或依據(jù)生物細胞中某些特定化學物質(zhì)的特征對醋酸菌進行分類，但這些方法的可靠性較低，實驗耗時較長，而且所得結果的重現(xiàn)性和分辨率都較差。隨著分子生物學的發(fā)展，現(xiàn)在很多基于DNA分子的技術都被應用于醋酸菌的鑒定分型。

2.1 16S rRNA和16S～23S轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)

16S rRNA在原核生物中廣泛存在，大小約為1 550 bp，其中包含了高度保守的區(qū)域和相對可變的區(qū)域。所攜帶的信息既能反應生物界的進化關系，又較容易進行操作，適用于各級分類單元，因此在生物分類學和生態(tài)學中有著重要的應用意義。16S rRNA作為一種快速、經(jīng)濟、精準的檢測方法常被用于一些未知菌種的鑒定。16S～23S轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internallytranscribedspacer，ITS）因為其序列和長度有更多的變異性，被認為是比16SrRNA有更高鑒別能力的片段[32]。

菌種DNA使用特定引物擴增和純化DNA片段，經(jīng)測序以后利用分析軟件與16S rRNA基因序列數(shù)據(jù)庫里面已存的序列進行對比即可得到結果，一些常用的數(shù)據(jù)庫如GenBank、Ribosomal Database Project（RDP-Ⅱ）、the Ribosomal Database Project European Molecular Biology Laboratory、Smart Gene IDNS和Ribosomal Differentiation of Medical Microorganisms（RIDOM）等[33]。

分別對醋酸菌的種間菌株做16S rRNA測序和16S～23S ITS測序，從而檢驗16S～23S ITS測序在區(qū)分醋酸菌種間菌種的效果。CLARRIDGE J E[34-35]試驗顯示，在對野生醋酸菌菌株進行分類時，使用16S～23S ITS測序得到的相似性百分比在總體上都要比16SrRNA低，甚至使用16SrRNA無法分辨的三株菌株在16S～23S ITS測序中都能得到很好的區(qū)分，證明使用16S～23S ITS測序要比僅使用16S rRNA測序有更好的區(qū)分能力。STACKEBRANDT E等[36]試驗也證明，即使兩株菌株的16S rRNA測序結果的相似性大于97%也不能斷定是同一菌種，還需要更多的基因檢測才能得出準確的結果。如A.cerevisiae和A.malorum在16SrDNA區(qū)域只有兩個堿基對的差異，使用16S～23S ITS則能更準確地將兩者區(qū)分開來。

2.2 DNA指紋圖譜技術

PCR技術指多聚酶鏈式反應，是一種用于篩選和擴增特定的基因片段的分子生物技術，通過使用PCR技術與其他技術的結合已經(jīng)成為醋酸菌鑒定分型的新手段，如限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應（PCR-restriction fragment length polymorphisms，PCR-RFLP）技術、細菌基因組重復序列PCR（repetitive extragenic palindromic sequence-based PCR，Rep-PCR）技術、聚合酶鏈反應變性梯度凝膠電泳（PCR-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技術等。

RFLP是指限制性酶長度多態(tài)性。細胞中的DNA經(jīng)過PCR篩選擴增出特定的基因片段，然后使用限制性內(nèi)切酶將其酶解，將限制性酶切產(chǎn)物電泳，在紫外燈下拍攝得到的譜帶，最后通過譜帶的對比就可以實現(xiàn)菌落的區(qū)分。PCR-RFLP技術的分辨效果部分取決于所選擇的基因片段，在醋酸菌中，因為16S～23S ITS區(qū)域和16S rDNA區(qū)域要比其他功能區(qū)域有更高的識別率，所以這兩個區(qū)域可以得到分類效果，甚至可以實現(xiàn)種間的分類[32]。

HIDALGO C等[37]在對傳統(tǒng)發(fā)酵的柿子醋中的醋酸菌分離鑒定時就使用了PCR-RFLP技術，對篩選得到的270個菌落做16SrDNA的PCR-RFLP，將這些菌株分類至7個醋酸菌種，然后使用16S rRNA測序做鑒定分析。VALERA M J等[39]在研究Canary島上葡萄中的醋酸菌生態(tài)分布時，使用PCR-RFLP技術將396株菌落分類至6個種，但是認為雖然PCR-RFLP在菌種分類中是可行的技術，可是應用于一些同源性較近的菌株至少需要兩種酶來做酶解，而這會帶來很大的時間損耗。

Rep-PCR即基因組短重復序列PCR分析技術，在細菌基因組中，短重復序列廣泛存在，約占細菌基因組的5%，可用于分析細菌的多態(tài)性。目前，在研究中使用較多的重復序列有（GTG）5序列、細菌基因重復（repetitive extragenic palindromic，REP）序列（35～40 bp）、腸桿菌基因間重復共有（enterobaeterial repetitive intergenic consensus，ERIC）序列（124～127 bp）和BOX序列（154 bp）[38]。這些重復序列分布在細菌基因組上的不同位點以不同的距離分隔，存在菌株和種屬水平上的差異。以細菌的DNA為模板，針對這些重復序列設計引物進行PCR，因為重復序列是特定的，所以可以對細菌進行鑒定和多樣性研究。

WU J J等[40]在研究山西陳醋中的酵母菌、乳酸菌和醋酸的生態(tài)分布試驗中，利用ERIC-PCR對篩選出的醋酸菌進行基因多樣性研究，從79個菌落中挑選出了24個具有唯一圖譜的菌落做16S rRNA測序分析。試驗中，即使有的菌落具有相同的代謝特點，可是其基因圖譜卻顯示它們之間的差異，從而證明ERIC-PCR是一種可靠的分類方法。

YETIMAN A E等[41]研究使用不同的方法鑒定食醋和醋母中的醋酸菌，在分類使用培養(yǎng)基篩選出來的菌落時便利用了（GTG）5-rep-PCR指紋圖譜的技術，將87個菌落分為了8個種，進而做16S rRNA、ITS片段和tuf片段的測序。

變性梯度凝膠電泳技術是指在一般聚丙烯酰胺凝膠電泳的基礎上添加了呈梯度分布的變性劑使雙鏈DNA分子遷移到一定的變性劑濃度并達到其解鏈溫度時，讓DNA分子開始部分解鏈。而部分解鏈的DNA分子其遷移率隨解鏈程度增大而減小，從而使序列不同大小相近DNA片段滯留于凝膠的不同位置，形成相互分開的譜帶。PCR-DGGE的主要特點是不依賴培養(yǎng)基培養(yǎng)篩菌，而是提取環(huán)境樣品中總的DNA，包括了樣品中的可培養(yǎng)微生物和不可培養(yǎng)微生物的全部遺傳物質(zhì)，可以真實地反映微生物的生態(tài)分布狀況。

LI P等[42]研究大曲中微生物分布與中國傳統(tǒng)食醋的混濁污染之間的關系時使用了PCR-DGGE技術直接分析了封瓶醋樣中微生物的16S rRNA基因片段，通過測序的結果可以得出造成食醋污染的微生物主要是Lactobacillusspp.。

在YETIMAN A E等[41]的研究中，也使用了PCR-DGGE的方法直接分析了食醋和醋母中的醋酸菌，并將PCR-DGGE和（GTG）5-rep-PCR的鑒定結果進行對比，認為PCR-DGGE的分辨效果受限于醋酸菌的16S rDNA同源性，因此在使用非依靠型培養(yǎng)基技術（如PCR-DGGE）分類時，其他一些依靠型培養(yǎng)基技術如（GTG）5-rep-PCR也應該作為一種補充技術進行鑒定。

除此之外，隨機擴增多態(tài)性DNA（random amplification of polymorphic DNA，RAPD）分析技術、脈沖場凝膠電泳（pulsed-fieldgelelectrophoresis，PFGE）技術、時相溫度梯度電泳（temporaltemperaturegradientgelelectrophresis，TTGE）技術、熒光原位雜交（fluorescenceinsituhybridization，F(xiàn)ISH）技術及實時定量熒光PCR（real time-quantitative PCR，RT-qPCR）等技術也都被應用于醋酸菌的分類。RAPD-PCR被成功地應用于檢測受污染的瓶裝葡萄酒中的醋酸菌；FERNANDEZ-PEREZ R等[43]使用PFGE技術分析了從蘋果醋中分離出來的77個菌落，利用限制性核酸內(nèi)切酶SpeI進行酶解，大約生成了14條堿基對含量在25～600 kbp譜帶以適合分析，而且使用PFGE技術的重復性可以達到85%，高于使用ERIC-PCR技術達到的重復性；ILABACA C等[44]使用TTGE技術評估了食醋發(fā)酵過程中醋酸菌的生態(tài)分布。與PCR-DGGE和PCR-TTGE不同，雖然FISH和RT-PCR也是非培養(yǎng)基依賴型分類技術，但是它們不僅能夠檢測微生物的分布，還能得出微生物的量化結果[45]。

2.3 DNA堿基組成

檢測DNA堿基是最早使用的基因技術，時至今日，DNA中的G+C含量依然是細菌的特征描述內(nèi)容之一。G+C含量的檢測常使用TAMAOKA J等[46]開發(fā)的方法，其利用反相HPLC測定細菌DNA中的核苷酸總量，再通過每種核苷酸在色譜柱上產(chǎn)生的峰計算G+C含量。醋酸菌的G+C含量在51～69 mol%之間，醋酸菌中各種屬的G+C含量如表1所示。

2.4 全基因組DNA-DNA雜交

全基因組DNA-DNA雜交是指利用DNA分子解鏈的可逆性和堿基配對的專一性，通過檢測兩個菌種的DNA雜交百分率來判斷兩者之間的親緣關系遠近。根據(jù)現(xiàn)代細菌學的概念，全基因組DNA-DNA雜交百分率在菌種描述中有著重要的作用。常用的DNA-DNA雜交方法有：微量細胞培養(yǎng)法、膜法、SI核酸酶法等，基于以上方法得出的分類結果也是大致相同的。

簡單地使用這一種方法對菌種進行劃分也是不可靠的，需要結合更多其他的方法才能得到正確的結果。如DELLAGLIO F等[47]在關于駒形桿菌屬（Komagataeibacter）的研究中，使用了微量細胞培養(yǎng)法，且雜交溫度都在48～50℃，分別對溫馴駒形桿菌（K.oboediens）和中間駒形桿菌（K.intermedius）的親緣性進行研究，但所得到的結果卻分別是63%和85%，從而得出了不同的分類結論。

2.5 其他分型方法

除了以上一些常用的基因分型方法，還有一些新的分型方法如使用寡核苷酸探針（種-種探針、屬-種探針）、nifD和nifHPCR技術（僅針對于固氮醋酸菌）、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）、指紋識別（fingerprinting identification）等技術也在不斷地發(fā)展，并應用于醋酸菌鑒定分型中。

TRCEK J[5]基于adhA序列設計了用于種-種PCR的探針，adhA是編碼吡咯喹啉醌-乙醇脫氫酶（PQQ-ADH）亞基Ⅰ的一段基因片段。利用此探針檢測種間相似度得到的結果是69.9%～94.7%，低于16S rRNA測序得到的結果，高于16S～23S ITS區(qū)域測序得到的結果，從而證明利用該探針可以實現(xiàn)比16S rRNA更高的分類效果；針對部分能夠固氮的醋酸菌，如固重氮葡糖醋桿菌（Ga.diazotrophicus）、固氮葡糖醋桿菌（Ga.azotocaptans）、約翰娜葡糖醋桿菌（Ga.johannae）、耐鹽斯瓦米納坦桿菌（Sw.salitolerans）、過氧化醋酸桿菌（A.peroxydans）和固氮醋酸桿菌（A. nitrogenifigens）等，其細胞內(nèi)都含有nifD和nifH基因片段，因此可以設計特定的引物，利用PCR擴增這些基因片段以分類出這些菌種[48-49]；ANDRéS-BARRAOC等[50]利用MALDITOF MS檢測食醋生產(chǎn)中的菌種，然后使用16S rRNA測序檢驗檢測結果，雖然兩者的結果有較小的差異，但是MALDI-TOF MS可以從混合的培養(yǎng)基中區(qū)分出醋酸菌種，證明MALDI-TOF MS在鑒別醋酸菌方面是一種快速、可靠的技術。

3 分子分類技術在食醋生產(chǎn)中的應用

食醋是生活中一種常見的調(diào)味品，同時也由于其具有酸度高的特點可以用于食品的保藏。在工業(yè)上，食醋的生產(chǎn)主要有傳統(tǒng)發(fā)酵制醋工藝（固態(tài)發(fā)酵、液態(tài)發(fā)酵）和液態(tài)深層發(fā)酵制醋工藝兩種。在生產(chǎn)中利用表型方式去鑒定醋酸菌種是較為困難，不僅是其操作時間長，而且醋酸菌在長時間發(fā)酵中會因為基因突變等原因?qū)е卤硇托誀畹母淖?。利用分子分類學則可以很好地解決以上問題，基于16S rDNA或16S～23S ITS區(qū)域的分子分類技術可以排除其他基因片段改變造成的干擾，高效快速地分類鑒定食醋生產(chǎn)中的醋酸菌菌種，部分分子分類技術在食醋生產(chǎn)中的應用見表2。

表2 分子分類技術在食醋生產(chǎn)中的應用Table 2 Application of molecular taxonomy technologies in vinegar production

3.1 傳統(tǒng)發(fā)酵制醋工藝

傳統(tǒng)發(fā)酵制醋工藝可以使用大米、葡萄、麥芽、柿子、菠蘿、蘋果等蔬果作為原料，采用固態(tài)或半固態(tài)的發(fā)酵方式[49]。其制醋方法可以分為3個步驟，分別是淀粉糖化、酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵，這些操作都是在開放的空間進行，包含了多種微生物的生長代謝。這些微生物可以提供大量不同種類的酶，從而促進香味物質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)的合成代謝，如各種有機酸、氨基酸、可揮發(fā)物質(zhì)和川芎嗪等物質(zhì)[50]。使用傳統(tǒng)工藝釀造的食醋具有高品質(zhì)的特點，但是相對于液態(tài)深層發(fā)酵制醋工藝而言，其生產(chǎn)周期長，價格更為昂貴。

XU W等[51]利用PCR-DGGE技術對鎮(zhèn)江香醋的固態(tài)發(fā)酵過程中的微生物變化進行了監(jiān)控，他們發(fā)現(xiàn)在整個發(fā)酵過程中的微生物菌群是相對穩(wěn)定的，說明長時間的釀醋環(huán)境已經(jīng)使得當?shù)氐木N得到馴化。同時，PCR-DGGE結果顯示在醋酸發(fā)酵階段的菌種主要有：Lactobacillus、Acetobacter、Gluconacetobacter、Staphylococcus、Saccharomyces、Enterobacter、Pseudomonas、Flavobacterium和Sinorhizobium，其中醋酸菌有Acetobacter、Gluconacetobacter。認為鎮(zhèn)江香醋醋醅有約1 m的深度，雖然只有醋醅表面一層有充足的氧氣，醋醅中間或底部都是無氧的環(huán)境，但是醋醅每天都會被攪拌一次，這就是大量好氧微生物如Acetobacter和Lactobacillus等能在發(fā)酵期大量存在的主要原因。而且Gluconacetobacter之類的固氮菌種能為原料增加氮源，以供Acetobacter等功能微生物的代謝[49]。這與NIE Z等[52]對天津獨流老醋醋醅中的微生物菌種的研究結果一致，他們發(fā)現(xiàn)天津獨流老醋醋醅在醋酸發(fā)酵期間的主要菌種是Acetobacter和Lactobacillus。

FUKUYAMA H等[53]使用PCR-RFLP和16S rRNA分離出傳統(tǒng)葡萄醋發(fā)酵中的醋酸菌，研究其在發(fā)酵過程中的演替變化，證實醋酸發(fā)酵過程中的主要菌種有：巴氏醋酸桿菌（A.pasteurianus）、氧化葡糖桿菌（G.oxydans）和歐洲駒形桿菌（K.europaeus）。在發(fā)酵初期，A.pasteurianus能很快適應酒精環(huán)境，成為主導微生物；當醋酸積累達到6%時，K.europaeus開始大量繁殖。因此，認為A.pasteurianus對醋酸的耐受性較差，但是對酒精卻有極好的耐受性；而K.europaeus能在醋酸含量達到6%時才開始活躍，說明這樣的環(huán)境更適宜該菌種的生長，它也有更強的醋酸耐受性。3.2液態(tài)深層發(fā)酵制醋工藝[54-55]

液態(tài)深層發(fā)酵是醋酸菌在富氧環(huán)境下將白酒、葡萄酒或蘋果酒等含酒精物料轉(zhuǎn)化為醋酸的生產(chǎn)工藝。因為多采用特定的菌種發(fā)酵，具有產(chǎn)量高、周期短的特點，得益于多年來對該發(fā)酵方式中的各種參數(shù)的研究如耗氧量、發(fā)酵溫度、酒精含量和醋酸含量等，現(xiàn)代食醋工業(yè)取得了長足的發(fā)展[53]。液態(tài)深層發(fā)酵通常是在大型發(fā)酵罐中進行的，因此其必須具備以下條件：合適的酒精度數(shù)、不間斷地補充無菌空氣、對酒精和醋酸都有較強耐受性的醋酸菌種，以及其他一些營養(yǎng)物質(zhì)。由于發(fā)酵罐中嚴苛的環(huán)境，因此能夠用于醋酸生產(chǎn)的醋酸菌不多，大多都是由Gluconacetobacter、Acetobacter和Komagataeibacter等菌屬組成的[56]。

ZHENG Y等[57]對使用16S rRNA鑒定為Acetobacter pasteurianusAC2005菌種的山楂醋液態(tài)深層發(fā)酵工藝進行研究。在發(fā)酵過程中，菌種受到底物（乙醇）和產(chǎn)物（乙酸）的抑制作用，造成產(chǎn)物產(chǎn)量較低，因此他們對種子培養(yǎng)基作出改造，將之前使用的合成種子培養(yǎng)基換為啤酒種子培養(yǎng)基，可以明顯地提升醋酸的產(chǎn)量。對此，他們認為首先是啤酒種子培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)有助于乙醇脫氫酶（ADH）或乙醛脫氫酶（ALDH）的表達，以促進乙醇氧化生成乙酸；其次，使用啤酒種子培養(yǎng)基可以增強AC2005對酒精的耐受性，從而提高菌株AC2005在發(fā)酵培養(yǎng)階段中適應能力。

FERNANDEZ-PEREZ R等[43]利用PFGE和ERIC-PCR分析了白酒醋（酒精度14%vol）、葡萄酒醋（酒精度12%vol）和蘋果醋（酒精度6%vol）的深層發(fā)酵過程中的微生物種類，結果顯示白酒醋中的微生物有K.europaeus，白葡萄酒醋中的微生物有K.europaeus、漢森駒形桿菌（K.hansenii）和A.pasteurianus，紅葡萄酒醋中的微生物有K.europaeus，蘋果醋中的微生物有K.europaeus、木駒形桿菌（K.xylinus）、K.hansenii和A.pasteurianus，證明是由于發(fā)酵條件造成了微生物種類上的差異。

4 結語

隨著科學技術的發(fā)展，醋酸菌的分類經(jīng)歷了很多不同階段的變化，但是直到現(xiàn)在，醋酸菌的分類學依然是不完善的。近代的分子生物學技術能夠提供參考，但是一個新屬種的發(fā)現(xiàn)建立必須以包含表型特征、生化特點和基因特性的多相分析為基礎，沒有更統(tǒng)一的依據(jù)。同樣，在工業(yè)生產(chǎn)中，醋酸菌研究在食醋和酒精飲料生產(chǎn)中有著非常重要的地位，現(xiàn)在使用的常規(guī)菌種快速分析技術與實驗室分析相差較大，菌種的分離、保存和培養(yǎng)有很大的局限性，因此還需要更多的研究來克服這些問題，加強食醋生產(chǎn)的控制，解決食醋生產(chǎn)中的問題，為生產(chǎn)選擇更優(yōu)良的菌種。

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Research of molecular taxonomy and application in vinegar production of acetic acid bacteria

QIN Xing,LU Hongmei*,CHEN Li
(Guizhou Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biological Pharmacy,School of Liquor and Food Engineering, Guizhou University,Guiyang 550003,China)

Acetic acid bacteria are Gram-negative,obligate aerobic bacteria that have the ability to oxidize alcohols or sugars to acetic acids as end products,and widely distributed in nature.Due to the characteristics of metabolizing alcohol to acetic acid,and acetic acid bacteria have been widely applied in food production.The research of acetic acid taxonomy had begun for a long time,but until recent decades,with the development of various biomolecular technologies,while it has been more deeply understood.The research and development of molecular taxonomy and application in vinegar industry of acetic acid bacteria were summarized.Various molecular taxonomy methods and acetic acid bacteria species applied in vinegar production were mainly introduced.

acetic acid bacteria;molecular taxonomy;vinegar;application

TS264.2

0254-5071（2017）06-0001-08

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.06.001

2017-04-09

貴州省科技廳、貴州大學聯(lián)合資金計劃項目（黔科合LH字[2014]7674）；貴州省農(nóng)業(yè)攻關項目（黔科合支撐[2016]2540號）

秦興（1991-），男，碩士研究生，研究方向為輕工技術與工程。

*通訊作者：盧紅梅（1967-），女，教授，博士，研究方向為發(fā)酵工程。