3株真核微藻在不同濃度豬糞水沼液中生長差異及氮磷去除率研究

王利燕，黃開耀，彭 霞，桑奧聞，徐澤東，蔣思文,5*，高其雙*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，湖北武漢 430070；2.中國科學(xué)院水生生物研究所藻類生物學(xué)重點實驗室，湖北武漢 430072；3.武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)研究院畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所，湖北武漢 430208；4.武漢凈宇微藻科技有限公司，湖北武漢 430074；5.湖北省生豬健康養(yǎng)殖協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢 430070）

3株真核微藻在不同濃度豬糞水沼液中生長差異及氮磷去除率研究

王利燕1，黃開耀2，彭 霞3，桑奧聞1，徐澤東4，蔣思文1,5*，高其雙3*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，湖北武漢 430070；2.中國科學(xué)院水生生物研究所藻類生物學(xué)重點實驗室，湖北武漢 430072；3.武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)研究院畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所，湖北武漢 430208；4.武漢凈宇微藻科技有限公司，湖北武漢 430074；5.湖北省生豬健康養(yǎng)殖協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢 430070）

為比較小球藻（Chlorella Vulgaris）、四尾柵藻（Scenedesmus Quadricauda）和斜生柵藻（Scenedesmus Obliqnus）3株真菌微藻在不同濃度豬糞水沼液中的生長情況及氮磷去除率的差異，試驗選用豬糞水沼液，進(jìn)行稀釋，得到1/1、1/2、1/4、1/8、1/16和1/32不同濃度的豬糞水沼液，高壓滅菌后，分別培養(yǎng)3株微藻。結(jié)果表明：3株微藻均能在糞水沼液中生長，而且能有效去除濃度為1/4、1/8、1/16和1/32的沼液中的氮磷；在濃度為1/4和1/8沼液中，小球藻相對生長速率最高，而在濃度為1/16和1/32的沼液中，四尾柵藻和斜生柵藻的生長速率優(yōu)于小球藻；在濃度為1/4、1/8、1/16和1/32的沼液中，斜生柵藻的總氮和氨態(tài)氮去除效果最佳；3株微藻在濃度為1/4和1/8的沼液中硝態(tài)氮增加，在1/16和1/32沼液硝態(tài)氮有所減少，其中四尾柵藻去除效果較好；四尾柵藻和斜生柵藻的總磷去除率基本相同，優(yōu)于小球藻。在本試驗條件下，小球藻和斜生柵藻可作為后期馴化的優(yōu)勢藻種。

微藻；豬糞水沼液；生長差異；總氮；總磷

隨著畜牧業(yè)的不斷發(fā)展，畜禽養(yǎng)殖糞污污染問題逐漸引起社會關(guān)注，因此尋找簡單、低成本、低投入、效果好的糞水處理工藝成為畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵。目前，研究者們嘗試運用藻類處理各種養(yǎng)殖糞水，此方法具有局限性小、占地面積小、微藻生長速度較快、能吸收較多的氮磷、凈化效率高等特點[1-2]。已有報道指出，利用養(yǎng)殖糞水培養(yǎng)小球藻，糞水中總氮、總磷和氨態(tài)氮的去除率分別達(dá)50%、60%和90%以上[3]。程海翔[4]研究表明，養(yǎng)豬糞水培養(yǎng)柵藻，糞水中氨態(tài)氮、總氮和總磷的去除率分別為97.3%、87.9%和93.2%。雖然研究者們在此方面開展了大量研究工作，但對于不同濃度的豬糞水沼液對藻類生長的影響及氮磷去除率的研究較少。將藻類用于規(guī)?；コ右褐械母粻I養(yǎng)元素，沼液濃度越低意味著成本越高。因此，本試驗選用小球藻（Chlorella Vulgaris）、四尾柵藻（Scenedesmus Quadricauda）和斜生柵藻（Scenedesmus Obliqnus）3株去除污水較好的微藻分別培養(yǎng)于不同濃度豬糞水沼液中，分析3株微藻的生長差異及氮磷去除率，為今后培養(yǎng)微藻選擇最適宜的糞水沼液濃度及規(guī)?；锰峁├碚撘罁?jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗藻株 小球藻HS108來自于武漢凈宇微藻科技有限公司，四尾柵藻FACHB-1297和斜生柵藻FACHB-276來自于中科院淡水藻種庫。

1.1.2 試驗沼液 豬糞水沼液取自新洲東泰畜牧有限公司，首先將糞水沼液3 000 r/min離心20 min，然后用純水將豬糞水沼液稀釋成1/1、1/2、1/4、1/8、1/16和1/32等6種濃度，121℃高壓滅菌20 min表1所示。試驗糞水沼液稀釋前的水質(zhì)狀況。

表1 試驗用豬糞水沼液稀釋前的水質(zhì)狀況 mg/L

1.2 試驗方法

1.2.1 藻種接種及培養(yǎng) 3株微藻在BG11培養(yǎng)基（表2）中擴(kuò)培，待各微藻在680 nm處的光密度值（OD680）為0.900左右時，離心收集藻細(xì)胞，將藻細(xì)胞分別接種到高壓滅菌后的不同濃度豬糞水沼液中，并用純水和BG11作對照。接種比例為1:10，接種好的微藻于（27±1）℃培養(yǎng)，光照強度為2 000 Lx，采用24 h光照，每2 d測定藻細(xì)胞生長狀況，培養(yǎng)13 d后測定豬糞水沼液氮磷等去除情況。

表2 BG11（Blue-Green Medium）

1.2.2 微藻生長分析 培養(yǎng)液中微藻的細(xì)胞密度與其在680 nm處光密度值成線性相關(guān)[5]，因此用紫外可見分光光度計（UV754N 上海儀電分析儀器有限公司）測定活體藻液在680 nm處的光密度值代表細(xì)胞密度，根據(jù)公式（1）計算微藻接種到糞水沼液后1～13 d的相對生長速率：其中，K為相對生長速率；t1、t2為對應(yīng)的培養(yǎng)時間；N1、N2分別為t1、t2時期的藻液的OD680值。

1.2.3 水質(zhì)指標(biāo)測定 水質(zhì)指標(biāo)總氮、總磷、氨態(tài)氮和硝態(tài)氮的測定均采用國家環(huán)境保護(hù)總局頒布的標(biāo)準(zhǔn)方法[6]。總氮用GB11894-89堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法，氨態(tài)氮用GB7479-87納氏試劑比色法，總磷用GB11893-89鉬酸銨分光光度法，硝態(tài)氮用HZ-HJ-SZ-0138紫外分光光度法。

總氮和總磷等去除率（r）計算：r=（C0-Ct）/ C0×100%

其中，C0為初始總氮總磷等濃度，Ct為培養(yǎng)t天后的濃度（mg/L）。

1.3 統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)均重復(fù)3次，用t檢驗進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＞0.05表示差異不顯著，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 3株微藻在糞水沼液中的生長特性 如圖1所示，小球藻在1/1濃度的沼液中無生長跡象，在1/2濃度的沼液中有生長趨勢，但生長趨勢變化較小。其余濃度的小球藻在取糞水沼液當(dāng)天處于生長階段，排序是BG11＞1/8＞1/4＞1/16＞1/32＞純水＞1/2＞1/1。

由圖2～3可知，四尾柵藻和斜生柵藻在1/1和1/2濃度的沼液中無生長跡象，其余濃度微藻在取糞水沼液當(dāng)天處于生長階段，排序分別為BG11＞1/16＞1/32＞1/8＞1/4＞純水＞1/1＞1/2和1/8＞1/16＞BG11＞1/32＞1/4＞純水＞1/1＞1/2。

圖1 小球藻在不同濃度糞水沼液中的生長曲線

圖2 四尾柵藻在不同濃度糞水沼液中的生長曲線

圖3 斜生柵藻在不同濃度糞水沼液中的生長曲線

2.2 3株微藻在糞水沼液中的相對生長速率 如表3所示，經(jīng)純水、BG11、1/4、1/8、1/16和1/32沼液培養(yǎng)13 d后，小球藻的相對生長速率分別為0.113、0.239、0.198、0.209、0.210、0.150，四尾柵藻的相對生長速率為0.094、0.188、0.101、0.138、0.212、0.168，斜生柵藻的相對生長速率為0.101、0.208、 0.157、0.207、0.236、0.175。可以看出，在1/4濃度沼液中，小球藻的相對生長速率極顯著高于四尾柵藻和斜生柵藻（P＜0.01），同時斜生柵藻極顯著高于四尾柵藻（P＜0.01）。在1/8濃度沼液中，小球藻和斜生柵藻的相對生長速率極顯著高于四尾柵藻（P＜0.01），小球藻與斜生柵藻間差異不顯著（P＞0.05）。在1/16濃度沼液中，斜生柵藻極顯著高于小球藻和四尾柵藻（P＜0.01），但小球藻和四尾柵藻差異不顯著（P＞0.05）。在1/32濃度沼液中，斜生柵藻和四尾柵藻極顯著高于小球藻（P＜0.01），但斜生柵藻與四尾柵藻間差異不顯著（P＞0.05）。可以得出，斜生柵藻在1/16沼液中生長最好。

表3 3種微藻在BG11培養(yǎng)基、純水和不同濃度糞水沼液中的相對生長速率

2.3 3株微藻對糞水沼液中總氮、氨態(tài)氮和硝態(tài)氮的影響 如表4～5所示，斜生柵藻對不同濃度糞水沼液總氮和氨態(tài)氮的去除率均高于其余2株微藻。斜生柵藻對1/4、1/8、1/16和1/32濃度沼液總氮和氨態(tài)氮去除率分別為44%、75%、88%、92%和47%、81%、96%、93%。在1/4濃度沼液中斜生柵藻和小球藻總氮和氨態(tài)氮去除率極顯著高于四尾柵藻（P＜0.01），斜生柵藻顯著高于小球藻（P＜0.05）。1/8濃度沼液中斜生柵藻總氮和氨態(tài)氮的去除率極顯著高于小球藻（P＜0.01），并顯著高于四尾柵藻（P＜0.05），其中小球藻與四尾柵藻差異不顯著（P＞0.05）。1/16濃度沼液中斜生柵藻和四尾柵藻總氮和氨態(tài)氮的去除率極顯著高于小球藻（P＜0.01），斜生柵藻與四尾柵藻差異不顯著（P＞0.05）。1/32濃度沼液中斜生柵藻總氮去除率極顯著高于其余2株微藻（P＜0.01），四尾柵藻極顯著高于小球藻（P＜0.01），但3株微藻氨態(tài)氮去除率差異不顯著（P＞0.05）。如表6所示，3株微藻對1/4和1/8濃度沼液硝態(tài)氮不但無去除反而增加，1/16和1/32濃度沼液硝態(tài)氮有去除，四尾柵藻去除效果較好，去除率分別達(dá)到75%和100%。綜上所述，斜生柵藻在1/16和1/32濃度沼液中總氮和氨態(tài)氮去除較好。

2.4 3株微藻對糞水沼液中總磷的影響 如表7所示，3株微藻對1/4濃度沼液總磷去除率差異不顯著（P＞0.05），去除率在50%左右。四尾柵藻和斜生柵藻對1/8和1/16濃度沼液總磷去除率差異不顯著（P＞0.05），且都極顯著高于小球藻（P＜0.01），去除率達(dá)80%以上。3株微藻對1/32濃度沼液總磷去除率達(dá)90%以上。

3 討 論

3.1 3株微藻在糞水沼液中的生長特性 從3株微藻在不同濃度沼液中的生長性能可以看出，3株微藻在1/1沼液中均不能生長，在1/2濃度沼液中小球藻有較小的生長趨勢，其余2株微藻無生長跡象。在1/4和1/8濃度沼液中小球藻相對生長速率高于其余2株微藻。斜生柵藻在1/8濃度沼液中的相對生長速率與在BG11培養(yǎng)時基本相同，隨后在1/16和1/32濃度沼液中斜生柵藻的相對生長速率高于小球藻。而四尾柵藻在1/16濃度沼液中的相對生長速率高于BG11培養(yǎng)。由此表明，小球藻在較高濃度糞水沼液中生長的耐性強于柵藻，其中四尾柵藻耐性最差。但如果3株微藻同時在適宜的糞水沼液濃度下生長時，斜生柵藻相對生長速率較高，這與很多學(xué)者報道的選用柵藻處理養(yǎng)殖、生活和工業(yè)污水一致[7-8]。3株微藻在1/32濃度沼液中的相對生長速率低于1/16濃度沼液，說明1/32濃度沼液中氮磷含量太低，難以滿足微藻需求。

表4 3株微藻對不同濃度糞水沼液總氮的去除率 %

表5 3株微藻對不同濃度糞水沼液氨態(tài)氮的去除率 %

表6 3株微藻對不同濃度糞水沼液硝態(tài)氮的去除率 %

表7 3株微藻對不同濃度糞水沼液總磷的去除率 %

3.2 3株微藻對糞水沼液中總氮、氨態(tài)氮和硝態(tài)氮的影響 在養(yǎng)殖廢水中，氨態(tài)氮和亞硝態(tài)氮的含量遠(yuǎn)高于硝態(tài)氮，氨態(tài)氮在養(yǎng)殖廢水可溶性無機(jī)氮中占比可達(dá)50%～90%[9]。本試驗所采用的糞水沼液氨態(tài)氮含量占總氮80%左右。本試驗表明，經(jīng)過斜生柵藻和四尾柵藻處理過的1/32濃度沼液，其總氮從11.27 mg/L分別降到0.91、1.97 mg/L，均達(dá)到了地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（GB3838-2002）的Ⅲ類水總氮要求和Ⅴ類水總氮要求。經(jīng)過斜生柵藻和四尾柵藻處理過的1/16和1/32濃度沼液的氨態(tài)氮分別為0.80、0.81 mg/L和0.77、0.97 mg/L，達(dá)到了地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（GB3838-2002）的Ⅲ類水氨態(tài)氮要求。因此，斜生柵藻對不同濃度糞水沼液總氮和氨態(tài)氮去除率最高，其次是四尾柵藻。

本試驗中，3株微藻對1/4和1/8濃度沼液的硝態(tài)氮去除率為負(fù)值，而對1/16和1/32濃度沼液有去除。賴子尼等[10]研究發(fā)現(xiàn)，氨態(tài)氮、硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮是藻類吸收利用的主要有效氮，其中氨態(tài)氮和硝態(tài)氮是水生植物氮營養(yǎng)元素的主要形態(tài)，水生植物優(yōu)先利用氨態(tài)氮，當(dāng)氨態(tài)氮濃度很低時才會利用硝態(tài)氮。藻類光合作用產(chǎn)生氧氣，在硝化菌作用下會使氨態(tài)氮轉(zhuǎn)化為硝態(tài)氮，進(jìn)而分析，本試驗1/4和1/8濃度沼液氨態(tài)氮高于1/16和1/32濃度沼液氨態(tài)氮。1/4和1/8濃度沼液氨態(tài)氮濃度還未被微藻吸收到較低水平，培養(yǎng)13 d后微藻還未開始吸收硝態(tài)氮。再加上沼液硝化菌將氨態(tài)氮少量轉(zhuǎn)化為硝態(tài)氮，導(dǎo)致1/4和1/8濃度沼液硝態(tài)氮反而增加。而1/16和1/32濃度沼液中氨態(tài)氮濃度起初較低，當(dāng)微藻吸收氨態(tài)氮到一定程度時開始吸收硝態(tài)氮，從而使其去除率較高，這與很多學(xué)者報道的結(jié)果一致[11]。

3.3 3株微藻對糞水沼液中總磷的影響 經(jīng)過小球藻處理后的1/32濃度沼液中總磷降為0.02 mg/L，達(dá)到了地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（GB3838-2002）的Ⅰ類水總磷要求。四尾柵藻處理后的1/16和1/32濃度沼液中總磷分別降為0.14 mg/L和0.13 mg/L，達(dá)到了地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（GB3838-2002）的Ⅲ類水總磷要求。斜生柵藻處理后的1/8、1/16和1/32濃度沼液中總磷分別降為0.16、0.097、0.04 mg/L，均達(dá)到了地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（GB3838-2002）的Ⅲ和Ⅱ類水總磷要求。

3.4 3株微藻相對生長速率與氮磷去除率關(guān)系 同一微藻的相對生長速率與氮磷去除率基本呈正比關(guān)系[12]。但不同微藻之間卻不同，如在1/4濃度沼液中，小球藻的相對生長速率高于斜生柵藻，但氮磷去除率卻低于斜生柵藻。斜生柵藻常由4個細(xì)胞組成，4個細(xì)胞寬12～34 μm，細(xì)胞長10～21 μm。而小球藻直徑3～8 μm，小于斜生柵藻。另外，由于每種微藻的生長和代謝情況不一樣，因此推測，斜生柵藻在生長階段要達(dá)到與小球藻同樣細(xì)胞濃度時對氮磷等營養(yǎng)元素的需求高于小球藻，從而造成1/4濃度沼液中小球藻的相對生長速率高，而氮磷等去除率低的現(xiàn)象。同時，也可能由于不同種藻種生長特性的差異和對氮磷去除效果不同而造成的[13]。

4 結(jié) 論

本試驗利用不同濃度沼液培養(yǎng)3株微藻，高壓滅菌沼液中的總氮、總磷、氨態(tài)氮和硝態(tài)氮分別為88.18、8.67、67.28 、7.19 mg/L時，3株微藻都能存活。相比另外2株微藻，斜生柵藻在糞水沼液氮磷去除效果和相對生長速率方面都比較好，是處理糞水沼液的一株優(yōu)勢藻種；高壓滅菌沼液總氮、總磷、氨態(tài)氮和硝態(tài)氮分別為176.36、17.33、134.56 、14.37 mg/L時，小球藻也能存活，但生長趨勢較小。說明小球藻在高濃度糞水沼液中存活耐性強于柵藻，如果將其進(jìn)行馴化，將是一株更好的處理高濃度糞水沼液的優(yōu)勢藻種。綜上，利用微藻處理養(yǎng)殖糞水基本可以達(dá)到水質(zhì)排放標(biāo)準(zhǔn)并減輕對地表水體污染，保護(hù)生態(tài)環(huán)境，促進(jìn)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展，同時，藻細(xì)胞及其細(xì)胞成分具有經(jīng)濟(jì)價值，因此，微藻處理養(yǎng)殖糞水具有廣闊的應(yīng)用前景和意義。

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S828.5

：A

：10.19556/j.0258-7033.2017-07-098

2016-11-21；

2017-01-31

湖北省重大科技攻關(guān)項目（2014BBB015）

王利燕（1989-），女，河南濮陽人，碩士研究生，研究方向為農(nóng)業(yè)推廣養(yǎng)殖，E-mail: 935127716@qq.com

*通訊作者：蔣思文，教授，主要從事分子遺傳與動物育種研究，E-mail: jiangsiwen@mail.hzau.edu.cn；高其雙，高級畜牧師，主要從事循環(huán)農(nóng)業(yè)研究， E-mail: 850881665@qq.com