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    長鏈非編碼RNA PRNCR1對胃癌細胞增殖、侵襲及轉移的研究

    2017-07-18 11:50:46蔡毅
    中國現代醫(yī)學雜志 2017年12期
    關鍵詞:長鏈包被小室

    蔡毅

    (南華大學附屬第一醫(yī)院 急診內科,湖南 衡陽 421001)

    長鏈非編碼RNA PRNCR1對胃癌細胞增殖、侵襲及轉移的研究

    蔡毅

    (南華大學附屬第一醫(yī)院 急診內科,湖南 衡陽 421001)

    目的 探索胃癌MGC-803細胞和人正常胃黏膜上皮GES-1細胞中,長鏈非編碼RNA PRNCR1的表達,以及沉默PRNCR1對胃癌MGC-803細胞增殖、侵襲及遷移的影響。方法利用實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測細胞中PRNCR1表達水平;設計并合成PRNCR1-siRNA及對照序列(PRNCR1-NC)轉染胃癌細胞,通過qRT-PCR檢測細胞中PRNCR1的沉默效果;利用四甲基偶氮唑鹽比色法檢測胃癌細胞的增殖;Transwell實驗檢測胃癌細胞遷移和侵襲能力的變化。結果PRNCR1在胃癌MGC-803細胞中的表達高于人正常胃黏膜上皮GES-1細胞,PRNCR1-siRNA可以下調胃癌MGC-803細胞中PRNCR1的表達,并可以抑制MGC-803細胞的增殖和侵襲轉移能力。結論PRNCR1-siRNA能夠下調PRNCR1的表達,并有效抑制胃癌細胞的增殖和侵襲遷移力,為以PRNCR1為靶點的胃癌基因治療奠定理論基礎。

    長鏈非編碼RNA;前列腺癌非編碼RNA1;增殖;侵襲;轉移;胃癌

    胃癌是源自胃黏膜上皮的惡性腫瘤,占全部惡性 腫瘤的第3位,居消化道惡性腫瘤的首位,占胃惡性腫瘤的95%。早期胃癌多無癥狀或僅有輕微癥狀,當臨床癥狀明顯時,病變已屬晚期。由此可見,胃癌嚴重威脅著人類的健康[1]。目前,胃癌的致病基因、發(fā)病機制及影響預后的因素仍不清楚,因此尋找胃癌發(fā)生、發(fā)展的致病因素具有重要意義。

    長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一類不具有蛋白質編碼功能、長度>200 nt的RNA。最新研究顯示,lncRNA并非既往認為的“噪音”RNA,而是在生物進化過程中高度保守,具有重要調控功能的非編碼RNA[2]。前列腺癌非編碼RNA1(prostate cancer non-coding RNA 1,PRNCR1)定位于染色體8q24,長約13 kB,已經被證實在前列腺癌、結腸癌中發(fā)揮重要作用[3]。最新研究發(fā)現,PRNCR1的基因多態(tài)性與胃癌的患病風險有關[4]。但PRNCR1在胃癌中的作用尚不清楚。本實驗通過探索PRNCR1在胃癌細胞和人正常胃黏膜上皮細胞中的表達,并通過RNA干涉技術沉默胃癌細胞中PRNCR1的表達,檢測其對胃癌細胞增殖、侵襲及轉移能力的影響,為將PRNCR1分子作為胃癌基因治療靶點提供理論基礎。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    Trizol細胞裂解液購于北京博潤萊特科技有限公司,RNA反轉錄試劑、實時熒光定量聚合酶鏈反應(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)試劑盒購自日本TaKaRa公司,細胞轉染試劑購自美國Invitrogen公司,四甲基偶氮唑鹽比色法[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT]試劑購自美國Promega公司,細胞侵襲轉移檢測transwell小室購自美國Milipore公司,基質膠購自美國Sigma公司,MGC-803細胞、GES-1細胞購自上海細胞庫。

    1.2 方法

    1.2.1 PRNCR1-siRNA的設計和合成 根據PRNCR1序列,按照siRNA作用靶點設計原則,利用美國Invitrogen公司的siRNA作用靶點設計軟件,委托上海吉瑪基因股份有限公司合成相應的siRNA及對照序列,分別為PRNCR1-siRNA、PRNCR1-NC。1.2.2 細胞培養(yǎng)和轉染 MGC-803細胞、GES-1細胞用含100 ml/L胎牛血清的達爾伯克必需基本培養(yǎng)基(dulbecco's minimum essential medium,DMEM),于37℃、50 ml/L二氧化碳CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。適量MGC-803細胞接種在25mm2培養(yǎng)皿中,待細胞密度達70%~80%后,將合成的PRNCR1-siRNA、PRNCR1-NC經Lipofectamine 2000轉染至MGC-803細胞中,具體操作按Lipofectamine 2000試劑盒說明書操作。轉染后的細胞分別為PRNCR1-siRNA組和PRNCR1-NC組。

    1.2.3 qRT-PCR檢測PRNCR1的表達 利用qRT-PCR對PRNCR1表達進行檢測。收集轉染48 h后的細胞,利用Trizol細胞裂解液提取細胞,得總RNA,并反轉錄為cDNA。PRNCR1定量PCR引物。正向引物:5'-CCAGGGGGAAACACACAG-3';反向引物:5'-AAATGGCAGTTTCCTTCAATG-3'。β-actin作為看家基因,正向引物:5'-TTGGCTTGACTCAGG ATTTA-3',反向引物:5'-ATGCTATCACCTCCCCTGT G-3'。引物序列合成由深圳華大基因公司完成。反應條件:95℃預變性 4 min,95℃變性 12 s,59℃退火35s,共41個循環(huán)。每組3個復孔,實驗重復3次,將所得數據繪制成柱狀圖。

    1.2.4 MTT實驗檢測MGC-803細胞增殖 取轉染48 h后且處于對數生長期的MGC-803細胞,常規(guī)洗滌2遍,用胰蛋白酶消化細胞,離心重懸后制成單細胞懸液,并調整細胞濃度為3×104個/ml,加入細胞懸液200 μl/孔,每組設7個復孔。共培養(yǎng)5個96孔板,分別培養(yǎng)1~5 d,檢測1板/d。每天于實驗結束前4 h,加入5 mg/ml MTT 20 μl/孔,放入孵箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄上清液,加入二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)150 μl/孔,震蕩 11 min,使 MTT 的還原產物充分溶解,于490 nm處測定細胞的光密度(optical density,OD)值。

    1.2.5 Transwell實驗檢測MGC-803細胞侵襲和轉移能力 MGC-803細胞轉染48 h后,通過Transwell實驗檢測細胞侵襲和轉移力的變化,每組設3個復孔。胰蛋白酶消化各組細胞,無菌磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline,PBS)洗 3遍,離心后用牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA)10 g/L 無血清培養(yǎng)基重懸細胞,將細胞密度調整為1×105個/ml,事先用基質膠包被好Transwell小室中上室的基底膜,每組細胞懸液中取150 μl加入上室中,將小室放入24孔板中,下室中加入含有胎牛血清的培養(yǎng)基500 μl,培養(yǎng) 36 h。結束后,將小室取出,PBS 輕輕沖洗,棉簽擦去小室上室內層的細胞,95%乙醇固定6 min,4 g/L結晶紫溶液染色后,倒置顯微鏡下計數,每樣本隨機選取5個視野進行計數后取平均值,繪制柱狀圖。檢測MGC-803細胞轉移能力時,小室的上室中無需基質膠包被基底膜,其他步驟與上述方法相同。

    1.3 統(tǒng)計學方法

    數據分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件,計量資料以均數±標準差(±s)表示,用t檢驗或重復測量設計的方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結果

    2.1PRNCR1在MGC-803細胞中高表達

    收集對數生長期的MGC-803和GES-1細胞,提取細胞總RNA,qRT-PCR檢測PRNCR1的表達。結果顯示,經標準化后,GES-1細胞PRNCR1相對表達量為(1.000±0.051),MGC-803細胞PRNCR1相對表達量為(3.146±0.783),經t檢驗,差異有統(tǒng)計學意義(t=6.844,P=0.017),與GES-1細胞比較,PRNCR1在MGC-803細胞中高表達。見圖1。

    2.2 PRNCR1-siRNA下調MGC-803細胞中PRNCR1的表達

    PRNCR1-siRNA及對照序列轉染MGC-803細胞后48 h,抽提細胞總RNA,qRT-PCR檢測其表達。結果顯示,經標準化后,PRNCR1-NC組PRNCR1相對表達量為(1.000±0.153),PRNCR1-siRNA 組細胞PRNCR1相對表達量為(0.488±0.091),經 t檢驗,差異有統(tǒng)計學意義(t=7.841,P=0.009),PRNCR1-siRNA組PRNCR1表達較PRNCR1-NC組下調。見圖2。

    圖1 細胞中PRNCR1的表達 (±s)

    圖2 兩組細胞PRNCR1表達變化 (n=3,±s)

    2.3 PRNCR1-siRNA抑制MGC-803細胞增殖

    MTT實驗檢測PRNCR1-siRNA對MGC-803細胞增殖的影響,PRNCR1-siRNA與PRNCR1-NC組術后 24、48、72、96和 124 h測量的 OD 值比較,采用重復測量數據的方差分析,結果:①不同時間點的OD值有差異(F=8.105,P=0.014);②PRNCR1-iRNA組與PRNCR1-NC組的OD值有差異(F=16.217,P=0.008),PRNCR1-siRNA組較PRNCR1-NC組OD值低,增殖速度較慢;③PRNCR1-siRNA組與PRNCR1-NC組的OD值變化趨勢有差異(F=7.814,P=0.032),從檢測后第3天開始,PRNCR1-siRNA組細胞的增殖速度較PRNCR1-NC組緩慢。見圖3和附表。

    2.4 PRNCR1-siRNA抑制MGC-803細胞的侵襲

    圖3 PRNCR1-siRNA對細胞增殖的影響

    附表 兩組各時間點OD值比較 (n=3,±s)

    附表 兩組各時間點OD值比較 (n=3,±s)

    組別120 h PRNCR1-NC 組 0.481±0.100 0.863±0.090 1.501±0.121 2.407±0.104 2.901±0.201 PRNCR1-siRNA組 0.503±0.171 0.804±0.221 1.201±0.221 1.614±0.107 1.915±0.224 24 h 48 h 72 h 96 h

    PRNCR1-siRNA及對照序列轉染MGC-803細胞48h后,結果顯示,PRNCR1-siRNA組穿過Matrigel包被的微孔膜的細胞數目為(21.635±7.424)個/高倍鏡,PRNCR1-NC組穿過Matrigel包被的微孔膜的細胞數目為(52.471±9.518)個/高倍鏡,經t檢驗,差異有統(tǒng)計學意義(t=10.471,P=0.025),PRNCR1-siRNA組穿過Matrigel包被的微孔膜的細胞數目少于PRNCR1-NC組。說明沉默PRNCR1表達后,可以抑制MGC-803細胞的侵襲能力。見圖4。

    2.5PRNCR1-siRNA抑制MGC-803細胞遷移

    PRNCR1-siRNA及對照序列轉染MGC-803細胞48 h后,PRNCR1-siRNA組穿過Matrigel包被的微孔膜的細胞數目為(23.534±5.176)個/高倍鏡,PRNCR1-NC組穿過Matrigel包被的微孔膜的細胞數目為(41.512±8.873)個 /高倍鏡,經 t檢驗,差異有統(tǒng)計學意義(t=9.214,P=0.017),PRNCR1-siRNA組穿過Matrigel包被的微孔膜的細胞數目少于PRNCR1-NC組,說明沉默PRNCR1表達后,可以抑制MGC-803細胞的遷移能力。見圖5。

    圖4 MGC-803細胞侵襲能力的變化

    圖5 MGC-803細胞遷移能力的變化

    3 討論

    lncRNA僅僅是RNA聚合酶Ⅱ的轉錄副產物,在生物體內沒有任何生物學功能,但最近發(fā)現,lncRNA不僅可在多種層面上對基因的表達進行調控,而且與多種疾病的發(fā)生密切相關。目前大量相關研究證實,lncRNA的異常表達會導致其調控的下游功能基因異常表達,最終導致機體產生嚴重的病理變化,更有甚者誘導腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[5]。肺腺癌轉移相關轉錄子-1(metastasis-associated lung adenocar cinoma transcript-1,MALAT-1)是一類存在于細胞核內的長鏈非編碼RNA。研究證實,MALAT-1的異常表達與人類多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關,包括宮頸癌、前列腺癌、胰腺癌等,并與一些腫瘤的遠處轉移、術后復發(fā)及藥物治療耐藥有關[6]。PRENSNER等[7]研究發(fā)現,在前列腺癌中長鏈非編碼RNA PCGEM1過表達,PCGEM1可促進前列腺癌細胞的惡性增殖,并與患者的不良預后相關。lncRNAs可以在人的循環(huán)血液中檢測到,并在腫瘤中異常表達,說明lncRNAs很可能成為腫瘤的特異性診斷標志物。有研究報道,與健康對照組血清比較,長鏈非編碼RNA XLOC_006844、LOC152578及 XLOC_000303在結腸癌患者血清中表達升高,提示這3種lncRNAs很可能成為結腸癌診斷的新指標[8]。循環(huán)血清中的lncRNA HOTAIR可以作為乳腺癌早期診斷的生物學指標[9]。由此可見,lncRNAs在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著至關重要的作用。

    lncRNAs在胃癌的研究中也有許多研究進展,LIU等[10]研究發(fā)現,H19通過RUNX1促進胃癌的增殖和侵襲。PANDAR的高表達預示著胃癌患者預后不良[11]。LI等[12]發(fā)現,PRNCR1的基因多態(tài)性可能是胃癌的一個致病因素。但PRNCR1在胃癌中的作用并不清楚,因此,研究其在胃癌細胞中的表達及其在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用,將有助于更加全面地了解胃癌發(fā)生、發(fā)展的原因。

    2011年,CHUNG 等[13]研究發(fā)現,PRNCR1 基因在前列腺癌細胞中表達上調,沉默前列腺癌細胞中PRNCR1的表達,可降低雄激素受體(androgen receptor,AR)的轉錄活性,表明PRNCR1在前列腺癌中通過調控AR的轉錄活性促進前列腺癌的發(fā)生。有研究顯示,PRNCR1的基因多態(tài)性與結腸癌及胃癌的易感性相關[14]。此外,PRNCR1表達上調可以促進結腸癌細胞的增殖,沉默其表達可以抑制結腸癌細胞的細胞周期。而PRNCR1在胃癌細胞中的作用尚未有研究報道,其作用的分子機制更有待進一步研究。

    本實驗合成靶向人PRNCR1基因的雙鏈siRNA序列,直接轉染入胃癌細胞中,通過qRT-PCR檢測轉染后siRNA的沉默效果,通過MTT實驗驗證胃癌細胞增殖能力的變化,通過細胞侵襲轉移實驗驗證胃癌細胞侵襲和遷移能力的變化,最終證實沉默PRNCR1在胃癌細胞中的表達可以抑制胃癌細胞的增殖、侵襲及轉移能力,為以PRNCR1為靶點的胃癌基因治療奠定理論基礎。

    [1]WANG S,ZHAO D,TIAN R,et al.FGF19 contributes to tumor progression in gastric cancer by promoting migration and invasion[J].Oncol Res,2016,23(4):197-203.

    [2]PARALKAR V R,TABORDA C C,HUANG P,et al.Unlinking an lncRNA from its associated cis element[J].Mol Cell,2016,62(1):104-110.

    [3]YANG L,QIU M,XU Y,et al.Upregulation of long non-coding RNA PRNCR1 in colorectal cancer promotes cell proliferation and cell cycle progression[J].Oncol Rep,2016,35(1):318-324.

    [4]LI L J,JIA F,BAI P,et al.Association between polymorphisms in long non-coding RNA PRNCR1 in 8q24 and risk of gastric cancer[J].Tumour Biol,2016,37(1):299-303.

    [5]FANG Y,FULLWOOD M J.Roles,functions,and mechanisms of long non-coding RNAs in cancer[J].Genomics Proteomics Bioinformatics,2016,14(1):42-54.

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    [7]PRENSNER J R,SAHU A,IYER M K,et al.The incRNAs PCGEM1 and PRNCR1 are not implicated in castration resistant prostate cancer[J].Oncotarget,2014,5(6):1434-1438.

    [8]WANG F,REN S,CHEN R,et al.Development and prospective multicenter evaluation of the long noncoding RNA MALAT-1 as a diagnostic urinary biomarker for prostate cancer[J].Oncotarget,2014,5(22):11091-11102.

    [9]JIAO F,HU H,YUAN C,et al.Elevated expression level of long noncoding RNA MALAT-1 facilitates cell growth,migration and invasion in pancreatic cancer[J].Oncol Rep,2014,32(6):2485-2492.

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    [13]CHUNG S,NAKAGAWA H,UEMURA M,et al.Association of a novel long non-coding RNA in 8q24 with prostate cancer susceptibility[J].Cancer Sci,2011,102(1):245-252.

    (童穎丹 編輯)

    Long non-coding RNA PRNCR1 promotes proliferation,invasion and migration of gastric cancer cells

    Yi Cai
    (Department of Emergency,the First Affiliated Hospital,University of South China,Hengyang,Hunan 421001,China)

    ObjectiveTo observe the expressions of long non-coding RNA PRNCR1 in gastric cancer MGC-803 cells and normal gastric mucosa epithelial GES-1 cells,and to study the effect of PRNCR1 on the proliferation,migration and invasion of gastric cancer cells by silencing the expression of PRNCR1.MethodssiRNA fragments (PRNCR1-siRNA)and control fragments (PRNCR1-NC)were designed,synthesized and transfected to gastric cancer cells.The expression of PRNCR1 was detected by qRT-PCR.Cell proliferation was detected by MTT.Migration and invasion of gastric cancer cells were detected by Transwell assay.ResultsThe expression of PRNCR1 in the MGC-803 cells was higher than that in the GES-1 cells.The expression of PRNCR1 was reduced by PRNCR1-siRNA in the MGC-803 cells.The proliferation,invasion and migration of the MGC-803 cells decreased after transfection of PRNCR1-siRNA.ConclusionsThe expression of PRNCR1 can be down-regulated by PRNCR1-siRNA,and PRNCR1-siRNA could inhibit the proliferation,invasion and migration of gastric cancer cells,which provides a theoretical foundation for gene therapy of gastric cancer targeting atPRNCR1gene.

    long non-coding RNA;PRNCR1;proliferation;invasion;migration;gastric cancer

    R735.2

    A

    10.3969/j.issn.1005-8982.2017.12.007

    1005-8982(2017)12-0035-05

    2016-04-15

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