• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    長鏈非編碼RNA PRNCR1對胃癌細胞增殖、侵襲及轉移的研究

    2017-07-18 11:50:46蔡毅
    中國現代醫(yī)學雜志 2017年12期
    關鍵詞:長鏈包被小室

    蔡毅

    (南華大學附屬第一醫(yī)院 急診內科,湖南 衡陽 421001)

    長鏈非編碼RNA PRNCR1對胃癌細胞增殖、侵襲及轉移的研究

    蔡毅

    (南華大學附屬第一醫(yī)院 急診內科,湖南 衡陽 421001)

    目的 探索胃癌MGC-803細胞和人正常胃黏膜上皮GES-1細胞中,長鏈非編碼RNA PRNCR1的表達,以及沉默PRNCR1對胃癌MGC-803細胞增殖、侵襲及遷移的影響。方法利用實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測細胞中PRNCR1表達水平;設計并合成PRNCR1-siRNA及對照序列(PRNCR1-NC)轉染胃癌細胞,通過qRT-PCR檢測細胞中PRNCR1的沉默效果;利用四甲基偶氮唑鹽比色法檢測胃癌細胞的增殖;Transwell實驗檢測胃癌細胞遷移和侵襲能力的變化。結果PRNCR1在胃癌MGC-803細胞中的表達高于人正常胃黏膜上皮GES-1細胞,PRNCR1-siRNA可以下調胃癌MGC-803細胞中PRNCR1的表達,并可以抑制MGC-803細胞的增殖和侵襲轉移能力。結論PRNCR1-siRNA能夠下調PRNCR1的表達,并有效抑制胃癌細胞的增殖和侵襲遷移力,為以PRNCR1為靶點的胃癌基因治療奠定理論基礎。

    長鏈非編碼RNA;前列腺癌非編碼RNA1;增殖;侵襲;轉移;胃癌

    胃癌是源自胃黏膜上皮的惡性腫瘤,占全部惡性 腫瘤的第3位,居消化道惡性腫瘤的首位,占胃惡性腫瘤的95%。早期胃癌多無癥狀或僅有輕微癥狀,當臨床癥狀明顯時,病變已屬晚期。由此可見,胃癌嚴重威脅著人類的健康[1]。目前,胃癌的致病基因、發(fā)病機制及影響預后的因素仍不清楚,因此尋找胃癌發(fā)生、發(fā)展的致病因素具有重要意義。

    長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一類不具有蛋白質編碼功能、長度>200 nt的RNA。最新研究顯示,lncRNA并非既往認為的“噪音”RNA,而是在生物進化過程中高度保守,具有重要調控功能的非編碼RNA[2]。前列腺癌非編碼RNA1(prostate cancer non-coding RNA 1,PRNCR1)定位于染色體8q24,長約13 kB,已經被證實在前列腺癌、結腸癌中發(fā)揮重要作用[3]。最新研究發(fā)現,PRNCR1的基因多態(tài)性與胃癌的患病風險有關[4]。但PRNCR1在胃癌中的作用尚不清楚。本實驗通過探索PRNCR1在胃癌細胞和人正常胃黏膜上皮細胞中的表達,并通過RNA干涉技術沉默胃癌細胞中PRNCR1的表達,檢測其對胃癌細胞增殖、侵襲及轉移能力的影響,為將PRNCR1分子作為胃癌基因治療靶點提供理論基礎。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    Trizol細胞裂解液購于北京博潤萊特科技有限公司,RNA反轉錄試劑、實時熒光定量聚合酶鏈反應(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)試劑盒購自日本TaKaRa公司,細胞轉染試劑購自美國Invitrogen公司,四甲基偶氮唑鹽比色法[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT]試劑購自美國Promega公司,細胞侵襲轉移檢測transwell小室購自美國Milipore公司,基質膠購自美國Sigma公司,MGC-803細胞、GES-1細胞購自上海細胞庫。

    1.2 方法

    1.2.1 PRNCR1-siRNA的設計和合成 根據PRNCR1序列,按照siRNA作用靶點設計原則,利用美國Invitrogen公司的siRNA作用靶點設計軟件,委托上海吉瑪基因股份有限公司合成相應的siRNA及對照序列,分別為PRNCR1-siRNA、PRNCR1-NC。1.2.2 細胞培養(yǎng)和轉染 MGC-803細胞、GES-1細胞用含100 ml/L胎牛血清的達爾伯克必需基本培養(yǎng)基(dulbecco's minimum essential medium,DMEM),于37℃、50 ml/L二氧化碳CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。適量MGC-803細胞接種在25mm2培養(yǎng)皿中,待細胞密度達70%~80%后,將合成的PRNCR1-siRNA、PRNCR1-NC經Lipofectamine 2000轉染至MGC-803細胞中,具體操作按Lipofectamine 2000試劑盒說明書操作。轉染后的細胞分別為PRNCR1-siRNA組和PRNCR1-NC組。

    1.2.3 qRT-PCR檢測PRNCR1的表達 利用qRT-PCR對PRNCR1表達進行檢測。收集轉染48 h后的細胞,利用Trizol細胞裂解液提取細胞,得總RNA,并反轉錄為cDNA。PRNCR1定量PCR引物。正向引物:5'-CCAGGGGGAAACACACAG-3';反向引物:5'-AAATGGCAGTTTCCTTCAATG-3'。β-actin作為看家基因,正向引物:5'-TTGGCTTGACTCAGG ATTTA-3',反向引物:5'-ATGCTATCACCTCCCCTGT G-3'。引物序列合成由深圳華大基因公司完成。反應條件:95℃預變性 4 min,95℃變性 12 s,59℃退火35s,共41個循環(huán)。每組3個復孔,實驗重復3次,將所得數據繪制成柱狀圖。

    1.2.4 MTT實驗檢測MGC-803細胞增殖 取轉染48 h后且處于對數生長期的MGC-803細胞,常規(guī)洗滌2遍,用胰蛋白酶消化細胞,離心重懸后制成單細胞懸液,并調整細胞濃度為3×104個/ml,加入細胞懸液200 μl/孔,每組設7個復孔。共培養(yǎng)5個96孔板,分別培養(yǎng)1~5 d,檢測1板/d。每天于實驗結束前4 h,加入5 mg/ml MTT 20 μl/孔,放入孵箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄上清液,加入二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)150 μl/孔,震蕩 11 min,使 MTT 的還原產物充分溶解,于490 nm處測定細胞的光密度(optical density,OD)值。

    1.2.5 Transwell實驗檢測MGC-803細胞侵襲和轉移能力 MGC-803細胞轉染48 h后,通過Transwell實驗檢測細胞侵襲和轉移力的變化,每組設3個復孔。胰蛋白酶消化各組細胞,無菌磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline,PBS)洗 3遍,離心后用牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA)10 g/L 無血清培養(yǎng)基重懸細胞,將細胞密度調整為1×105個/ml,事先用基質膠包被好Transwell小室中上室的基底膜,每組細胞懸液中取150 μl加入上室中,將小室放入24孔板中,下室中加入含有胎牛血清的培養(yǎng)基500 μl,培養(yǎng) 36 h。結束后,將小室取出,PBS 輕輕沖洗,棉簽擦去小室上室內層的細胞,95%乙醇固定6 min,4 g/L結晶紫溶液染色后,倒置顯微鏡下計數,每樣本隨機選取5個視野進行計數后取平均值,繪制柱狀圖。檢測MGC-803細胞轉移能力時,小室的上室中無需基質膠包被基底膜,其他步驟與上述方法相同。

    1.3 統(tǒng)計學方法

    數據分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件,計量資料以均數±標準差(±s)表示,用t檢驗或重復測量設計的方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結果

    2.1PRNCR1在MGC-803細胞中高表達

    收集對數生長期的MGC-803和GES-1細胞,提取細胞總RNA,qRT-PCR檢測PRNCR1的表達。結果顯示,經標準化后,GES-1細胞PRNCR1相對表達量為(1.000±0.051),MGC-803細胞PRNCR1相對表達量為(3.146±0.783),經t檢驗,差異有統(tǒng)計學意義(t=6.844,P=0.017),與GES-1細胞比較,PRNCR1在MGC-803細胞中高表達。見圖1。

    2.2 PRNCR1-siRNA下調MGC-803細胞中PRNCR1的表達

    PRNCR1-siRNA及對照序列轉染MGC-803細胞后48 h,抽提細胞總RNA,qRT-PCR檢測其表達。結果顯示,經標準化后,PRNCR1-NC組PRNCR1相對表達量為(1.000±0.153),PRNCR1-siRNA 組細胞PRNCR1相對表達量為(0.488±0.091),經 t檢驗,差異有統(tǒng)計學意義(t=7.841,P=0.009),PRNCR1-siRNA組PRNCR1表達較PRNCR1-NC組下調。見圖2。

    圖1 細胞中PRNCR1的表達 (±s)

    圖2 兩組細胞PRNCR1表達變化 (n=3,±s)

    2.3 PRNCR1-siRNA抑制MGC-803細胞增殖

    MTT實驗檢測PRNCR1-siRNA對MGC-803細胞增殖的影響,PRNCR1-siRNA與PRNCR1-NC組術后 24、48、72、96和 124 h測量的 OD 值比較,采用重復測量數據的方差分析,結果:①不同時間點的OD值有差異(F=8.105,P=0.014);②PRNCR1-iRNA組與PRNCR1-NC組的OD值有差異(F=16.217,P=0.008),PRNCR1-siRNA組較PRNCR1-NC組OD值低,增殖速度較慢;③PRNCR1-siRNA組與PRNCR1-NC組的OD值變化趨勢有差異(F=7.814,P=0.032),從檢測后第3天開始,PRNCR1-siRNA組細胞的增殖速度較PRNCR1-NC組緩慢。見圖3和附表。

    2.4 PRNCR1-siRNA抑制MGC-803細胞的侵襲

    圖3 PRNCR1-siRNA對細胞增殖的影響

    附表 兩組各時間點OD值比較 (n=3,±s)

    附表 兩組各時間點OD值比較 (n=3,±s)

    組別120 h PRNCR1-NC 組 0.481±0.100 0.863±0.090 1.501±0.121 2.407±0.104 2.901±0.201 PRNCR1-siRNA組 0.503±0.171 0.804±0.221 1.201±0.221 1.614±0.107 1.915±0.224 24 h 48 h 72 h 96 h

    PRNCR1-siRNA及對照序列轉染MGC-803細胞48h后,結果顯示,PRNCR1-siRNA組穿過Matrigel包被的微孔膜的細胞數目為(21.635±7.424)個/高倍鏡,PRNCR1-NC組穿過Matrigel包被的微孔膜的細胞數目為(52.471±9.518)個/高倍鏡,經t檢驗,差異有統(tǒng)計學意義(t=10.471,P=0.025),PRNCR1-siRNA組穿過Matrigel包被的微孔膜的細胞數目少于PRNCR1-NC組。說明沉默PRNCR1表達后,可以抑制MGC-803細胞的侵襲能力。見圖4。

    2.5PRNCR1-siRNA抑制MGC-803細胞遷移

    PRNCR1-siRNA及對照序列轉染MGC-803細胞48 h后,PRNCR1-siRNA組穿過Matrigel包被的微孔膜的細胞數目為(23.534±5.176)個/高倍鏡,PRNCR1-NC組穿過Matrigel包被的微孔膜的細胞數目為(41.512±8.873)個 /高倍鏡,經 t檢驗,差異有統(tǒng)計學意義(t=9.214,P=0.017),PRNCR1-siRNA組穿過Matrigel包被的微孔膜的細胞數目少于PRNCR1-NC組,說明沉默PRNCR1表達后,可以抑制MGC-803細胞的遷移能力。見圖5。

    圖4 MGC-803細胞侵襲能力的變化

    圖5 MGC-803細胞遷移能力的變化

    3 討論

    lncRNA僅僅是RNA聚合酶Ⅱ的轉錄副產物,在生物體內沒有任何生物學功能,但最近發(fā)現,lncRNA不僅可在多種層面上對基因的表達進行調控,而且與多種疾病的發(fā)生密切相關。目前大量相關研究證實,lncRNA的異常表達會導致其調控的下游功能基因異常表達,最終導致機體產生嚴重的病理變化,更有甚者誘導腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[5]。肺腺癌轉移相關轉錄子-1(metastasis-associated lung adenocar cinoma transcript-1,MALAT-1)是一類存在于細胞核內的長鏈非編碼RNA。研究證實,MALAT-1的異常表達與人類多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關,包括宮頸癌、前列腺癌、胰腺癌等,并與一些腫瘤的遠處轉移、術后復發(fā)及藥物治療耐藥有關[6]。PRENSNER等[7]研究發(fā)現,在前列腺癌中長鏈非編碼RNA PCGEM1過表達,PCGEM1可促進前列腺癌細胞的惡性增殖,并與患者的不良預后相關。lncRNAs可以在人的循環(huán)血液中檢測到,并在腫瘤中異常表達,說明lncRNAs很可能成為腫瘤的特異性診斷標志物。有研究報道,與健康對照組血清比較,長鏈非編碼RNA XLOC_006844、LOC152578及 XLOC_000303在結腸癌患者血清中表達升高,提示這3種lncRNAs很可能成為結腸癌診斷的新指標[8]。循環(huán)血清中的lncRNA HOTAIR可以作為乳腺癌早期診斷的生物學指標[9]。由此可見,lncRNAs在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著至關重要的作用。

    lncRNAs在胃癌的研究中也有許多研究進展,LIU等[10]研究發(fā)現,H19通過RUNX1促進胃癌的增殖和侵襲。PANDAR的高表達預示著胃癌患者預后不良[11]。LI等[12]發(fā)現,PRNCR1的基因多態(tài)性可能是胃癌的一個致病因素。但PRNCR1在胃癌中的作用并不清楚,因此,研究其在胃癌細胞中的表達及其在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用,將有助于更加全面地了解胃癌發(fā)生、發(fā)展的原因。

    2011年,CHUNG 等[13]研究發(fā)現,PRNCR1 基因在前列腺癌細胞中表達上調,沉默前列腺癌細胞中PRNCR1的表達,可降低雄激素受體(androgen receptor,AR)的轉錄活性,表明PRNCR1在前列腺癌中通過調控AR的轉錄活性促進前列腺癌的發(fā)生。有研究顯示,PRNCR1的基因多態(tài)性與結腸癌及胃癌的易感性相關[14]。此外,PRNCR1表達上調可以促進結腸癌細胞的增殖,沉默其表達可以抑制結腸癌細胞的細胞周期。而PRNCR1在胃癌細胞中的作用尚未有研究報道,其作用的分子機制更有待進一步研究。

    本實驗合成靶向人PRNCR1基因的雙鏈siRNA序列,直接轉染入胃癌細胞中,通過qRT-PCR檢測轉染后siRNA的沉默效果,通過MTT實驗驗證胃癌細胞增殖能力的變化,通過細胞侵襲轉移實驗驗證胃癌細胞侵襲和遷移能力的變化,最終證實沉默PRNCR1在胃癌細胞中的表達可以抑制胃癌細胞的增殖、侵襲及轉移能力,為以PRNCR1為靶點的胃癌基因治療奠定理論基礎。

    [1]WANG S,ZHAO D,TIAN R,et al.FGF19 contributes to tumor progression in gastric cancer by promoting migration and invasion[J].Oncol Res,2016,23(4):197-203.

    [2]PARALKAR V R,TABORDA C C,HUANG P,et al.Unlinking an lncRNA from its associated cis element[J].Mol Cell,2016,62(1):104-110.

    [3]YANG L,QIU M,XU Y,et al.Upregulation of long non-coding RNA PRNCR1 in colorectal cancer promotes cell proliferation and cell cycle progression[J].Oncol Rep,2016,35(1):318-324.

    [4]LI L J,JIA F,BAI P,et al.Association between polymorphisms in long non-coding RNA PRNCR1 in 8q24 and risk of gastric cancer[J].Tumour Biol,2016,37(1):299-303.

    [5]FANG Y,FULLWOOD M J.Roles,functions,and mechanisms of long non-coding RNAs in cancer[J].Genomics Proteomics Bioinformatics,2016,14(1):42-54.

    [6]ZHANG Y,WANG T,HUANG H Q,et al.Human MALAT-1 long non-coding RNA is overexpressed in cervical cancer metastasis and promotes cell proliferation,invasion and migration[J].J BUON,2015,20(6):1497-1503.

    [7]PRENSNER J R,SAHU A,IYER M K,et al.The incRNAs PCGEM1 and PRNCR1 are not implicated in castration resistant prostate cancer[J].Oncotarget,2014,5(6):1434-1438.

    [8]WANG F,REN S,CHEN R,et al.Development and prospective multicenter evaluation of the long noncoding RNA MALAT-1 as a diagnostic urinary biomarker for prostate cancer[J].Oncotarget,2014,5(22):11091-11102.

    [9]JIAO F,HU H,YUAN C,et al.Elevated expression level of long noncoding RNA MALAT-1 facilitates cell growth,migration and invasion in pancreatic cancer[J].Oncol Rep,2014,32(6):2485-2492.

    [10]LIU G,XIANG T,WU Q F,et al.Long noncoding RNA H19-Derived miR-675 enhances proliferation and invasion via RUNX1 in gastric cancer cells[J].Oncol Res,2016,23(3):99-107.

    [11]PETROVICS G,ZHANG W,MAKAREM M,et al.Elevated expression ofPCGEM1,a prostate-specific gene with cell growth-promoting function,is associated with high-risk prostate cancer patients[J].Oncogene,2004,23(2):605-611.

    [12]LI L,SUN R,LIANG Y,et al.Association between polymorphisms in long non-coding RNA PRNCR1 in 8q24 and risk of colorectal cancer[J].J Exp Clin Cancer Res.2013,32(1):104.

    [13]CHUNG S,NAKAGAWA H,UEMURA M,et al.Association of a novel long non-coding RNA in 8q24 with prostate cancer susceptibility[J].Cancer Sci,2011,102(1):245-252.

    (童穎丹 編輯)

    Long non-coding RNA PRNCR1 promotes proliferation,invasion and migration of gastric cancer cells

    Yi Cai
    (Department of Emergency,the First Affiliated Hospital,University of South China,Hengyang,Hunan 421001,China)

    ObjectiveTo observe the expressions of long non-coding RNA PRNCR1 in gastric cancer MGC-803 cells and normal gastric mucosa epithelial GES-1 cells,and to study the effect of PRNCR1 on the proliferation,migration and invasion of gastric cancer cells by silencing the expression of PRNCR1.MethodssiRNA fragments (PRNCR1-siRNA)and control fragments (PRNCR1-NC)were designed,synthesized and transfected to gastric cancer cells.The expression of PRNCR1 was detected by qRT-PCR.Cell proliferation was detected by MTT.Migration and invasion of gastric cancer cells were detected by Transwell assay.ResultsThe expression of PRNCR1 in the MGC-803 cells was higher than that in the GES-1 cells.The expression of PRNCR1 was reduced by PRNCR1-siRNA in the MGC-803 cells.The proliferation,invasion and migration of the MGC-803 cells decreased after transfection of PRNCR1-siRNA.ConclusionsThe expression of PRNCR1 can be down-regulated by PRNCR1-siRNA,and PRNCR1-siRNA could inhibit the proliferation,invasion and migration of gastric cancer cells,which provides a theoretical foundation for gene therapy of gastric cancer targeting atPRNCR1gene.

    long non-coding RNA;PRNCR1;proliferation;invasion;migration;gastric cancer

    R735.2

    A

    10.3969/j.issn.1005-8982.2017.12.007

    1005-8982(2017)12-0035-05

    2016-04-15

    猜你喜歡
    長鏈包被小室
    多糖包被在急性呼吸窘迫綜合征發(fā)生、診斷及治療中的作用研究進展
    長鏈非編碼RNA APTR、HEIH、FAS-ASA1、FAM83H-AS1、DICER1-AS1、PR-lncRNA在肺癌中的表達
    日媒勸“灰小子”早日放開公主
    ELISA兩種包被方法在牛乳氯霉素測定中的比較
    日本公主的準婆家靠譜嗎?
    暢談(2018年6期)2018-08-28 02:23:38
    新型寬帶橫電磁波小室的設計
    坐公交
    上海故事(2015年13期)2016-01-22 13:25:09
    長鏈磷腈衍生物的制備及其在聚丙烯中的阻燃應用
    中國塑料(2015年10期)2015-10-14 01:13:16
    跟一天了
    伴侶(2015年5期)2015-09-10 07:22:44
    長鏈非編碼RNA與腫瘤的相關研究進展
    亚洲国产欧美网| 999精品在线视频| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 免费高清在线观看日韩| av福利片在线| 欧美最黄视频在线播放免费 | 一级a爱片免费观看的视频| 美女高潮到喷水免费观看| 免费人成视频x8x8入口观看| e午夜精品久久久久久久| 可以在线观看毛片的网站| 黄色成人免费大全| 亚洲国产看品久久| 日本a在线网址| 国产国语露脸激情在线看| 黄片播放在线免费| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 午夜福利欧美成人| 交换朋友夫妻互换小说| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 国产深夜福利视频在线观看| 成人免费观看视频高清| 午夜老司机福利片| 99久久99久久久精品蜜桃| 国产高清视频在线播放一区| 久久精品人人爽人人爽视色| 最新在线观看一区二区三区| 超碰成人久久| 国产精品久久久av美女十八| 大型av网站在线播放| 十分钟在线观看高清视频www| 美女福利国产在线| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 亚洲男人天堂网一区| 国产黄色免费在线视频| 亚洲情色 制服丝袜| 又紧又爽又黄一区二区| 在线免费观看的www视频| 视频在线观看一区二区三区| 在线播放国产精品三级| 动漫黄色视频在线观看| 亚洲中文av在线| 波多野结衣一区麻豆| 久久热在线av| 午夜视频精品福利| 老汉色av国产亚洲站长工具| 日本一区二区免费在线视频| 9191精品国产免费久久| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 久久中文字幕人妻熟女| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 9191精品国产免费久久| 亚洲欧美日韩无卡精品| 日韩av在线大香蕉| 黑人猛操日本美女一级片| 曰老女人黄片| 国产91精品成人一区二区三区| 日韩人妻精品一区2区三区| 高清av免费在线| 色婷婷久久久亚洲欧美| av欧美777| 大型av网站在线播放| 美女扒开内裤让男人捅视频| 国产精品99久久99久久久不卡| 午夜a级毛片| 国产成人精品久久二区二区91| 国产单亲对白刺激| 国产精品1区2区在线观看.| 亚洲国产看品久久| 成年人黄色毛片网站| 黑人欧美特级aaaaaa片| 18禁观看日本| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 悠悠久久av| 国产精品一区二区三区四区久久 | 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 久久香蕉激情| 91在线观看av| 国产主播在线观看一区二区| 桃红色精品国产亚洲av| 国产成人免费无遮挡视频| 亚洲专区中文字幕在线| 免费观看人在逋| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 黄色丝袜av网址大全| 久热爱精品视频在线9| 国产一卡二卡三卡精品| 真人一进一出gif抽搐免费| 精品国产乱子伦一区二区三区| 不卡一级毛片| 国产有黄有色有爽视频| 校园春色视频在线观看| 在线观看www视频免费| 国产精品一区二区三区四区久久 | 成人免费观看视频高清| 成熟少妇高潮喷水视频| 亚洲中文字幕日韩| videosex国产| 高清av免费在线| 少妇 在线观看| 日本精品一区二区三区蜜桃| 国产麻豆69| 搡老熟女国产l中国老女人| 在线视频色国产色| av超薄肉色丝袜交足视频| 国产高清videossex| 亚洲三区欧美一区| 大陆偷拍与自拍| 性欧美人与动物交配| 亚洲国产精品合色在线| 欧美黄色片欧美黄色片| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 精品福利观看| 国产三级黄色录像| 色综合欧美亚洲国产小说| 欧美日韩精品网址| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 日日夜夜操网爽| 午夜免费成人在线视频| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 国产区一区二久久| 亚洲一区中文字幕在线| 天堂动漫精品| 欧美黄色淫秽网站| 一边摸一边做爽爽视频免费| 女性生殖器流出的白浆| 99在线视频只有这里精品首页| 色综合婷婷激情| 亚洲少妇的诱惑av| 亚洲一区二区三区欧美精品| 99久久99久久久精品蜜桃| 欧美在线黄色| 在线观看午夜福利视频| 两个人看的免费小视频| 色在线成人网| 高清毛片免费观看视频网站 | 黄色女人牲交| 久久午夜亚洲精品久久| 亚洲专区字幕在线| 一进一出好大好爽视频| 女人精品久久久久毛片| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 午夜福利免费观看在线| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 热re99久久精品国产66热6| 日韩三级视频一区二区三区| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 大型黄色视频在线免费观看| 亚洲黑人精品在线| 丁香六月欧美| 欧美在线黄色| 国产精品成人在线| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 一区二区日韩欧美中文字幕| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 老司机深夜福利视频在线观看| 精品人妻在线不人妻| 久久久国产成人免费| 色综合婷婷激情| avwww免费| 99riav亚洲国产免费| 国产精品野战在线观看 | 中文字幕最新亚洲高清| av中文乱码字幕在线| 亚洲一码二码三码区别大吗| 亚洲精品av麻豆狂野| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 久久九九热精品免费| 色综合婷婷激情| 男人舔女人下体高潮全视频| 一进一出抽搐动态| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 五月开心婷婷网| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| ponron亚洲| 欧美成人性av电影在线观看| 一级毛片高清免费大全| 欧美激情 高清一区二区三区| 午夜老司机福利片| 久久精品91蜜桃| 亚洲av电影在线进入| 多毛熟女@视频| 999久久久国产精品视频| 黄频高清免费视频| 在线观看免费高清a一片| 在线观看一区二区三区激情| 99香蕉大伊视频| 成人永久免费在线观看视频| 18禁国产床啪视频网站| 狂野欧美激情性xxxx| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 久久中文字幕一级| 啦啦啦在线免费观看视频4| 欧美在线黄色| aaaaa片日本免费| 欧美精品亚洲一区二区| 五月开心婷婷网| 精品久久久久久成人av| 国产精品综合久久久久久久免费 | 成人黄色视频免费在线看| av电影中文网址| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 中文字幕人妻熟女乱码| 久久香蕉精品热| 午夜福利在线免费观看网站| 久久热在线av| 久久久国产欧美日韩av| 十八禁人妻一区二区| 精品久久久精品久久久| 黄色视频不卡| 久久热在线av| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 一进一出抽搐动态| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 久久这里只有精品19| 欧美日韩精品网址| 黄色视频,在线免费观看| 欧美另类亚洲清纯唯美| ponron亚洲| 老鸭窝网址在线观看| 国产1区2区3区精品| avwww免费| 99久久国产精品久久久| 成人特级黄色片久久久久久久| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 国产av一区在线观看免费| 丰满饥渴人妻一区二区三| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| а√天堂www在线а√下载| 人人澡人人妻人| 啦啦啦免费观看视频1| 真人一进一出gif抽搐免费| 女性被躁到高潮视频| 亚洲精品粉嫩美女一区| 91大片在线观看| 男女午夜视频在线观看| 女警被强在线播放| 久久精品91蜜桃| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 精品国内亚洲2022精品成人| 一进一出好大好爽视频| 国产激情久久老熟女| 18禁观看日本| 一边摸一边抽搐一进一小说| 热99国产精品久久久久久7| 十八禁网站免费在线| 国产亚洲欧美精品永久| 涩涩av久久男人的天堂| 在线观看日韩欧美| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 国产伦人伦偷精品视频| 精品国内亚洲2022精品成人| 免费在线观看完整版高清| 国产单亲对白刺激| 新久久久久国产一级毛片| 一区二区三区精品91| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 国产一区二区三区综合在线观看| √禁漫天堂资源中文www| 国产精品影院久久| 日韩有码中文字幕| 国产99白浆流出| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 99久久99久久久精品蜜桃| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 级片在线观看| 午夜a级毛片| 亚洲免费av在线视频| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产精品偷伦视频观看了| 日韩国内少妇激情av| 国产一区二区三区综合在线观看| 国产在线精品亚洲第一网站| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 国产精品一区二区精品视频观看| а√天堂www在线а√下载| 一区二区三区国产精品乱码| 国产91精品成人一区二区三区| 人妻久久中文字幕网| 欧美精品亚洲一区二区| 交换朋友夫妻互换小说| 亚洲一区中文字幕在线| 国产有黄有色有爽视频| 欧美乱码精品一区二区三区| 老汉色av国产亚洲站长工具| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 在线视频色国产色| 欧美黄色淫秽网站| 欧美日本亚洲视频在线播放| 国产成人av教育| 天堂俺去俺来也www色官网| 国产成人精品久久二区二区91| 91在线观看av| 日韩视频一区二区在线观看| 看片在线看免费视频| 亚洲精品一二三| www.精华液| 午夜影院日韩av| 在线观看日韩欧美| 色哟哟哟哟哟哟| www.www免费av| 国产乱人伦免费视频| 国产有黄有色有爽视频| 国产亚洲精品一区二区www| 欧美日本中文国产一区发布| 精品国内亚洲2022精品成人| 天堂√8在线中文| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 精品一区二区三卡| 欧美另类亚洲清纯唯美| 成人三级黄色视频| 国产亚洲欧美98| 欧美一区二区精品小视频在线| 高清毛片免费观看视频网站 | 中文字幕人妻丝袜制服| 91九色精品人成在线观看| 久久久水蜜桃国产精品网| 国产高清国产精品国产三级| 少妇被粗大的猛进出69影院| 日本三级黄在线观看| 欧美在线黄色| 亚洲男人的天堂狠狠| 亚洲国产精品999在线| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 色哟哟哟哟哟哟| 久久性视频一级片| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 精品福利永久在线观看| 国产精品一区二区精品视频观看| 一级,二级,三级黄色视频| 免费日韩欧美在线观看| 欧美在线一区亚洲| 亚洲av五月六月丁香网| 中亚洲国语对白在线视频| a级毛片黄视频| 欧美成人性av电影在线观看| 手机成人av网站| 香蕉丝袜av| 搡老熟女国产l中国老女人| 精品久久久久久久毛片微露脸| av国产精品久久久久影院| 国产精品一区二区三区四区久久 | 后天国语完整版免费观看| 日本黄色视频三级网站网址| 男人的好看免费观看在线视频 | 人人妻人人澡人人看| ponron亚洲| 中文字幕人妻熟女乱码| 97碰自拍视频| 中文字幕人妻熟女乱码| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 精品无人区乱码1区二区| 久久久久久人人人人人| 操出白浆在线播放| 91字幕亚洲| 欧美日韩一级在线毛片| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 两人在一起打扑克的视频| 成人国产一区最新在线观看| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 97碰自拍视频| 欧美黄色淫秽网站| 99re在线观看精品视频| 黑人猛操日本美女一级片| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 国产精品久久电影中文字幕| 一进一出好大好爽视频| 精品一区二区三区av网在线观看| 亚洲av成人av| 日日爽夜夜爽网站| 亚洲性夜色夜夜综合| 色播在线永久视频| 丝袜美腿诱惑在线| 日韩精品中文字幕看吧| 久久久久久久久久久久大奶| 一二三四在线观看免费中文在| 国产精品久久视频播放| 在线观看www视频免费| 香蕉国产在线看| 亚洲精品在线美女| 久9热在线精品视频| 身体一侧抽搐| 精品国产一区二区久久| 新久久久久国产一级毛片| 成人国语在线视频| 午夜a级毛片| www.熟女人妻精品国产| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 我的亚洲天堂| 国产黄a三级三级三级人| 国产成人免费无遮挡视频| 90打野战视频偷拍视频| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 黄频高清免费视频| 国产精品98久久久久久宅男小说| 亚洲五月婷婷丁香| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 久久香蕉激情| 新久久久久国产一级毛片| 久久久国产成人精品二区 | 国产精品一区二区免费欧美| 天堂动漫精品| 精品卡一卡二卡四卡免费| 亚洲九九香蕉| 欧美日韩精品网址| 国产精品成人在线| 嫩草影视91久久| 很黄的视频免费| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 少妇的丰满在线观看| 午夜福利欧美成人| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 国产精品一区二区三区四区久久 | 无人区码免费观看不卡| 波多野结衣av一区二区av| 一级片'在线观看视频| 少妇被粗大的猛进出69影院| 怎么达到女性高潮| 成在线人永久免费视频| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 在线观看午夜福利视频| 午夜视频精品福利| 国产精品亚洲av一区麻豆| 国产在线观看jvid| 日本三级黄在线观看| 18禁国产床啪视频网站| 久久 成人 亚洲| 国产精品av久久久久免费| 女性被躁到高潮视频| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 久久国产精品影院| 久9热在线精品视频| www.自偷自拍.com| 国产成人av教育| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 青草久久国产| 乱人伦中国视频| 欧美日韩视频精品一区| 麻豆成人av在线观看| 日韩大码丰满熟妇| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产精品亚洲av一区麻豆| 日本 av在线| 亚洲情色 制服丝袜| av有码第一页| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 一级,二级,三级黄色视频| 999久久久精品免费观看国产| 国产熟女午夜一区二区三区| 99国产极品粉嫩在线观看| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 久久亚洲精品不卡| 精品一区二区三区av网在线观看| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 国产1区2区3区精品| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 日日夜夜操网爽| 久久久精品欧美日韩精品| 国产精品久久久久成人av| 亚洲精华国产精华精| 丰满饥渴人妻一区二区三| 99久久国产精品久久久| 亚洲国产看品久久| 精品国产乱子伦一区二区三区| 天天添夜夜摸| 9热在线视频观看99| 欧美精品一区二区免费开放| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 岛国视频午夜一区免费看| 99精品在免费线老司机午夜| 国产亚洲精品久久久久5区| 亚洲色图av天堂| 久久精品亚洲av国产电影网| 午夜免费成人在线视频| 色尼玛亚洲综合影院| 欧美日本中文国产一区发布| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 高清毛片免费观看视频网站 | 国产精品成人在线| 亚洲精品一区av在线观看| 国产亚洲欧美精品永久| 老汉色av国产亚洲站长工具| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 黄片大片在线免费观看| av天堂在线播放| 国产精品 欧美亚洲| 啦啦啦 在线观看视频| 超碰成人久久| 午夜精品在线福利| 亚洲欧美日韩无卡精品| 黑人欧美特级aaaaaa片| 久久中文字幕一级| 夜夜看夜夜爽夜夜摸 | 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 极品人妻少妇av视频| 一区二区日韩欧美中文字幕| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 免费观看人在逋| 欧美成人午夜精品| 热99re8久久精品国产| 欧美在线黄色| 国产99久久九九免费精品| 国产有黄有色有爽视频| 天堂俺去俺来也www色官网| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| av视频免费观看在线观看| 国产1区2区3区精品| 99国产精品一区二区蜜桃av| 午夜视频精品福利| 欧美另类亚洲清纯唯美| 国产精品九九99| 欧美国产精品va在线观看不卡| 国产成人影院久久av| 精品人妻1区二区| 在线播放国产精品三级| 免费高清在线观看日韩| 在线观看免费视频日本深夜| 热99re8久久精品国产| 久热这里只有精品99| 99国产精品99久久久久| 精品福利永久在线观看| 男人舔女人的私密视频| 色尼玛亚洲综合影院| 淫秽高清视频在线观看| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 黄色片一级片一级黄色片| 精品国产一区二区三区四区第35| 一级毛片女人18水好多| 久久人妻熟女aⅴ| 国产一区二区三区视频了| 欧美黄色淫秽网站| 男女床上黄色一级片免费看| 欧美性长视频在线观看| 欧美日韩视频精品一区| 国产不卡一卡二| 国产精品野战在线观看 | 欧美一区二区精品小视频在线| 成人亚洲精品av一区二区 | www日本在线高清视频| 成年人黄色毛片网站| 国产在线观看jvid| 欧美最黄视频在线播放免费 | 午夜福利影视在线免费观看| 国产色视频综合| 国产在线观看jvid| 日日夜夜操网爽| 一级片免费观看大全| 久久久久久人人人人人| 免费av中文字幕在线| 免费高清在线观看日韩| 天堂俺去俺来也www色官网| www国产在线视频色| 亚洲精品美女久久av网站| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 在线观看免费高清a一片| 最近最新免费中文字幕在线| 午夜免费成人在线视频| 久久久久久久久免费视频了| 男女之事视频高清在线观看| 午夜视频精品福利| 久久伊人香网站| 99精国产麻豆久久婷婷| 夜夜看夜夜爽夜夜摸 | 波多野结衣高清无吗| 成人影院久久| 国产精品av久久久久免费| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 成熟少妇高潮喷水视频| 成人亚洲精品一区在线观看| 中文亚洲av片在线观看爽| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| www.999成人在线观看| 成年版毛片免费区| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 亚洲第一青青草原| 高清欧美精品videossex| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 欧美黑人精品巨大| 久久久久久久久中文| 在线观看午夜福利视频| 日韩成人在线观看一区二区三区| 亚洲 欧美一区二区三区| 精品福利永久在线观看| 国产av在哪里看| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 日日干狠狠操夜夜爽| 日韩精品青青久久久久久| 黑人欧美特级aaaaaa片| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 色尼玛亚洲综合影院| 叶爱在线成人免费视频播放| 老司机靠b影院| 午夜久久久在线观看| 91成年电影在线观看| 国产亚洲av高清不卡| 99久久综合精品五月天人人| 亚洲精品粉嫩美女一区| 国产视频一区二区在线看| 亚洲欧美精品综合久久99| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 女同久久另类99精品国产91| 在线av久久热| 国产精品日韩av在线免费观看 | 精品乱码久久久久久99久播| 超碰成人久久| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 深夜精品福利| 激情在线观看视频在线高清|