CD36在氧化低密度脂蛋白降低鼠源細(xì)胞錳超氧化物歧化酶活性中的作用

王 釗

(邢臺(tái)市人民醫(yī)院普外科，河北 邢臺(tái) 054000)

CD36在氧化低密度脂蛋白降低鼠源細(xì)胞錳超氧化物歧化酶活性中的作用

王 釗

(邢臺(tái)市人民醫(yī)院普外科，河北 邢臺(tái) 054000)

目的 探討CD36在氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)降低大鼠錳(Mn)超氧化物歧化酶(SOD)活性中的作用。方法 將鼠源RAW264.7巨噬細(xì)胞按照處理方式分為ox-LDL處理組和抗CD36拮抗組；ox-LDL處理組在培養(yǎng)液中加入100 mg/L ox-LDL，抗CD36拮抗組在培養(yǎng)液中先加入2 mg/L抗CD36 mAb預(yù)處理1 h，再加入100 mg/L ox-LDL。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后比較兩組細(xì)胞凋亡率和Mn-SOD活性。結(jié)果 ox-LDL處理組24、48 h的細(xì)胞凋亡率〔分別為(10.8±2.91)%與(29.88±4.47)%〕明顯高于抗CD36拮抗組〔(5.83±1.18)%與(7.63±1.64)%〕(均P<0.05)。兩組0 h時(shí)Mn-SOD活性無顯著差異(P>0.05)；ox-LDL處理組24、48 h的Mn-SOD活性〔分別為(17.17±2.90)%與(16.73±2.87)%〕明顯低于抗CD36拮抗組〔(29.34±4.72)%與(22.83±3.72)%〕(均P<0.05)。結(jié)論 CD36在ox-LDL所介導(dǎo)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝過程中具有重要作用。

CD36；氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)；錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)

研究表明低密度脂蛋白(LDL)氧化是動(dòng)脈粥樣硬化(AS)的重要特征，氧化(ox)-LDL是LDL經(jīng)氧化修飾后形成的，此反應(yīng)與體內(nèi)的氧化應(yīng)激有關(guān)〔1〕。作為一種脂蛋白氧化產(chǎn)物，在腦梗死的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。研究證明脂質(zhì)豐富的斑塊往往結(jié)合更多的ox-LDL抗體，因此ox-LDL的含量高低與斑塊的不穩(wěn)定性密切相關(guān)〔2，3〕。抗氧化酶類是體內(nèi)最重要的對(duì)抗自由基氧化損傷的防御系統(tǒng)，其中超氧化物歧化酶(SOD)是體內(nèi)對(duì)抗自由基的第一道防線，其廣泛存在于自然界的動(dòng)物、植物及一些微生物體內(nèi)，能夠清除生物體內(nèi)的氧自由基，是最重要的抗氧化酶〔4，5〕。CD36是一種多功能的清道夫受體，可介導(dǎo)細(xì)胞ox-LDL的內(nèi)吞和降解。本研究通過分析CD36在ox-LDL降低大鼠錳(Mn)-SOD活性中的所發(fā)揮的作用，以探討LDL的降脂作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組 鼠源RAW264.7巨噬細(xì)胞購自中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫，用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)培養(yǎng)于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中。采用抗CD36單克隆抗體封閉受體(2.5 mg/L)，將細(xì)胞分為ox-LDL處理組和抗CD36拮抗組；ox-LDL處理組在培養(yǎng)液中加入100 mg/L ox-LDL，抗CD36拮抗組在培養(yǎng)液中先加入2 mg/L抗CD36 mAb預(yù)處理1 h，再加入100 mg/L ox-LDL。

1.2 主要試劑與儀器 DMEM(Hyclone)，ox-LDL(北京協(xié)生生物科技有限公司)，SOD及分型SOD檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，抗CD36單克隆抗體，AnnexinⅤ-FITC 試劑，流式細(xì)胞儀(Beckman Coutler Epics XL)，超聲細(xì)胞破碎儀(Cole-Parmer CPX400)。

1.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 收集細(xì)胞，用0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)消化細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，離心棄上清液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，收集細(xì)胞，用Annexin V-FITC試劑盒中結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，調(diào)節(jié)濃度為1×106/ml，取100 μl按試劑盒說明上機(jī)檢測(cè)。

1.4 黃嘌呤氧化酶法測(cè)定Mn-SOD的活性 用超聲細(xì)胞破碎儀將細(xì)胞破碎，按照試劑盒說明檢測(cè)總SOD和銅/鋅(Cu/Zn)SOD的活性，Mn-SOD活性=總SOD活性-Cu/Zn SOD活性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 兩組細(xì)胞凋亡率比較 ox-LDL處理組24、48 h細(xì)胞凋亡率〔分別為(10.8±2.91)%與(29.88±4.47)%〕明顯高于抗CD36拮抗組〔(5.83±1.18)%與(7.63±1.64)%〕(t=4.928,t=11.390；均P<0.001)。

2.2 兩組Mn-SOD活性比較 兩組0 h時(shí)Mn-SOD活性無顯著差異(P>0.05)；抗CD36拮抗組處理24、48 h明顯高于ox-LDL處理組(P<0.001)。見表1。

表1 兩組處理后各時(shí)點(diǎn)Mn-SOD活性比較

3 討 論

ox-LDL是造成內(nèi)皮損傷的重要因素，可通過多種機(jī)制損傷內(nèi)皮細(xì)胞，在AS等疾病的發(fā)生與發(fā)展中起著重要作用〔6〕。與ox-LDL的相關(guān)受體很多，其中CD36和凝集素樣氧化型LDL受體(LOX)-1在近年來備受關(guān)注〔7，8〕。LOX-1是ox-LDL的特異性受體，與血管內(nèi)皮細(xì)胞攝取和代謝ox-LDL密切相關(guān)；ox-LDL可導(dǎo)致CD36上調(diào)，引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷，促進(jìn)AS斑塊形成。SOD 是生物體內(nèi)各個(gè)組織中唯一能夠特異性清除氧自由基的抗氧化酶，能平衡生物體的氧自由基，使機(jī)體免受到氧自由基的危害。其中以線粒體中的Mn-SOD的作用最為重要，在體內(nèi)活性氧系統(tǒng)和氧化還原有關(guān)的平衡體系中發(fā)揮著關(guān)鍵作用〔9〕。根據(jù)活性中心所含金屬離子的不同，SOD主要可分為Mn-SOD、鐵(Fe)-SOD及Cu/Zn-SOD。Mn-SOD存在于所有真核及原核生物的線粒體中，后者又是細(xì)胞產(chǎn)生能量和進(jìn)行有氧代謝的重要場(chǎng)所，因此也是自由基產(chǎn)生的場(chǎng)所，故要防止自由基對(duì)線粒體的損傷，Mn-SOD作用具有重要地位〔10〕。CD36具有介導(dǎo)細(xì)胞黏附、細(xì)胞分化、細(xì)胞信號(hào)傳遞、參與長(zhǎng)鏈脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)等作用。CD36是巨噬細(xì)胞表面主要識(shí)別、攝取ox-LD的B類清道夫受體，其結(jié)合和攝取的ox-LDL占到巨噬細(xì)胞結(jié)合和攝取修飾脂質(zhì)總量的50%以上，且不受細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量的負(fù)反饋調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，抑制CD36表達(dá)則可減緩AS進(jìn)展；CD36缺乏患者的單核細(xì)胞與ox-LDL的最大結(jié)合率比正常人要低40%〔7〕。本研究提示預(yù)先用抗CD36的單克隆抗體封閉細(xì)胞，減少細(xì)胞對(duì)ox-LDL的吞噬作用，因此抑制ox-LDL所產(chǎn)生的細(xì)胞凋亡作用。Mn-SOD主要位于線粒體，多為誘導(dǎo)表達(dá)型。而線粒體在新陳代謝過程中產(chǎn)生的氧自由基及細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-1β、干擾素(IFN)-γ等都會(huì)對(duì)Mn-SOD的表達(dá)產(chǎn)生誘導(dǎo)作用。當(dāng)細(xì)胞被抗CD36的單克隆抗體封閉后，細(xì)胞相關(guān)的代謝與降解受到抑制，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的代謝終產(chǎn)物明顯降低，Mn-SOD消耗減少，活性增高。而ox-LDL處理組由于脂質(zhì)代謝產(chǎn)物的增加，細(xì)胞內(nèi)的氧自由基堆積，消耗了大量的Mn-SOD，因此Mn-SOD活性下降。

綜上，CD36在ox-LDL所介導(dǎo)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝過程中具有重要作用，在研究調(diào)血脂及防治動(dòng)脈粥樣硬化藥物，防治心腦血管疾病中具有重要意義。

1 葉南慧，林艷云，劉樹滔，等.口服PTD-SOD對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用〔J〕.中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2011；28(7)：602-6.

2 Niizuma K，Yoshioka H，Chen H，etal.Mitochondrial and apoptotic neuronal death signaling pathways in cerebral ischemia〔J〕.Biochim Biophys Acta,2010；1802(1)：92-9.

3 苗 成，李金國(guó)，苗 芳，等.槲皮素對(duì)ox-LDL所致的小鼠巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積和過氧化的影響〔J〕.中國(guó)病理生理雜志，2013；29(8)：1370-4.

4 Sakata H，Niizuma K，Wakai T，etal.Neural stem cells genetically modified to overexpress Cu/Zn-superoxide dismutase enhance amelioration of ischemic stroke in mice〔J〕.Stroke，2012；43(9)：2423-9.

5 趙 莉，姚樹桐，陳 軍，等.載脂蛋白A-I模擬肽D-4F對(duì)巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞清道夫受體 A1 的抑制作用〔J〕.中國(guó)病理生理雜志，2014；30(10)：1742-7.

6 Fukui M，Zhu BT.Mitochondrial superoxide dismutase SOD2，but not cytosolic SOD1，plays a critical role in protection against glutamate-induced oxidase stress and cell death in HT22 neuronal cells〔J〕.Free Radic Biol Med，2010；48(6)：821-30.

7 姚樹桐，桑 慧，楊娜娜，等.氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及CD36的可能作用〔J〕.生理學(xué)報(bào)，2010；62(5)：433-40.

8 Liao X，Sluimer JC，Wang Y，etal.Macrophage autophagy plays a protective role in advanced atherosclerosis〔J〕.Cell Metab，2012；15(4)：545-53.

9 Velikkakath AK，Nishimura T，Oita E，etal.Mammalian Atg 2 proteins are essential for autophagosome formation and important for regulation of size and distribution of lipid droplets〔J〕.Mol Biol Cell，2012；23(5)：896-909.

10 Yao S，Miao C，Tian H，etal.Endoplasmic reticulum stress promotes macrophage-derived foam cell formation by up-regulating cluster of differentiation 36(CD36) expression〔J〕.J Biol Chem，2014；289(7)：4032-42.

〔2016-03-27修回〕

(編輯 苑云杰)

王 釗(1982-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事普通外科疾病研究。

R363.2

A

1005-9202(2017)13-3190-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.029